黃芩素對氧化應(yīng)激狀態(tài)下白癜風(fēng)黑素細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)和功能的影響

朱龍飛 田 軍 堅(jiān) 哲 張偉剛 劉邦民 李春英 高天文

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·論著·

黃芩素對氧化應(yīng)激狀態(tài)下白癜風(fēng)黑素細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)和功能的影響

朱龍飛1,2田 軍1,3堅(jiān) 哲1張偉剛1劉邦民1李春英1高天文1

目的： 明確黃芩素對氧化應(yīng)激狀態(tài)下白癜風(fēng)黑素細(xì)胞(PIG3V)線粒體超微結(jié)構(gòu)和功能的影響。方法： 常規(guī)培養(yǎng)白癜風(fēng)黑素細(xì)胞系PIG3V細(xì)胞，分為空白對照組、黃芩素組、H2O2組及黃芩素+H2O2組。電鏡觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)；MTT法檢測線粒體活性；流式細(xì)胞術(shù)檢測線粒體膜電位；熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測細(xì)胞ATP含量；RT-PCR檢測線粒體DNA拷貝數(shù)。結(jié)果： 與H2O2組比較，黃芩素+H2O2組線粒體結(jié)構(gòu)損害輕，線粒體活性率、膜電位、ATP含量及DNA拷貝數(shù)高。結(jié)論： 黃芩素減輕氧化應(yīng)激狀態(tài)下白癜風(fēng)黑素細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)和功能損害，增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力。

黃芩素； 白癜風(fēng)； 黑素細(xì)胞； 線粒體； 氧化應(yīng)激

白癜風(fēng)的發(fā)病機(jī)制尚未充分闡明?；谧陨砻庖邔W(xué)說，臨床上外用糖皮質(zhì)激素、免疫調(diào)節(jié)劑，以及NB-UVB照射等治療白癜風(fēng)，可獲一定的治療效果。但是這些治療手段對于預(yù)防白癜風(fēng)的復(fù)發(fā)以及對進(jìn)展期白癜風(fēng)的治療效果明顯不足。近年來，氧化應(yīng)激學(xué)說得到普遍關(guān)注，并得到一系列實(shí)驗(yàn)結(jié)果的支持。線粒體是細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(Reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生的主要部位，正常情況下其具有完善的抗氧化體系，當(dāng)線粒體功能障礙時出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)ROS堆積，導(dǎo)致線粒體損傷。研究發(fā)現(xiàn)，白癜風(fēng)患者皮損處(角質(zhì)形成細(xì)胞)和皮損周圍(黑素細(xì)胞及角質(zhì)形成細(xì)胞)細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)損害，進(jìn)一步支持氧化應(yīng)激致病學(xué)說[1]。

我們課題組前期研究證實(shí)，黃芩素(Baicalein)抑制p38MAPK通路對抗正常人黑素細(xì)胞系(PIG1)氧化應(yīng)激損傷，同時減少細(xì)胞色素C(Cytochrome c, CytC)釋放，通過抑制線粒體凋亡途徑保護(hù)PIG1細(xì)胞，但是具體機(jī)制尚不明確[2]。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 電鏡為捷克FEI公司Tecnai G2型透射電子顯微鏡；BD FACSAria流式細(xì)胞分選儀為美國Backman公司生產(chǎn)；全自動酶標(biāo)儀、IQ5實(shí)時熒光定量PCR儀為美國Bio-rad公司生產(chǎn)；254培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司；30% H2O2溶液(分析純)為西安化學(xué)試劑廠產(chǎn)品；黃芩素購自美國Sigma公司；Red cm ROS購自美國Invitrogen公司；MTT試劑盒為碧云天生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；ENLITEN?ATP試劑盒購自美國Promega公司；線粒體DNA特征性基因ND4引物(上游序列：CCATTCTCCTCCTATCCCTCAAC；下游序列：CACAATCTGATGTTTTGGTTAAACTATATTT)由生工生物工程公司(上海)股份有限公司設(shè)計(jì)合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 白癜風(fēng)患者表皮黑素細(xì)胞系(PIG3V)由美國伊利諾斯州芝加哥洛約拉大學(xué)Caroline Le Poole博士贈送，該細(xì)胞系運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染16型HPV E6和E7開放讀碼框得來。PIG3V細(xì)胞為貼壁生長的人永生化細(xì)胞，使用含5%胎牛血清的254黑素細(xì)胞培養(yǎng)基(含血清黑素細(xì)胞培養(yǎng)基)，細(xì)胞種入25 cm2培養(yǎng)瓶、六孔板或96孔板中，恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)條件設(shè)置為37℃，5% CO2。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及處理 依照我們課題組前期實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，我們采用0.75 mM H2O2培養(yǎng)基處理PIG3V細(xì)胞建立氧化應(yīng)激模型[3]。對照組：黑素細(xì)胞培養(yǎng)基；單純黃芩素處理組：40 μM黃芩素液處理1 h，其后換用黑素細(xì)胞培養(yǎng)基。氧化應(yīng)激組：0.75 mM H2O2處理；黃芩素預(yù)處理組：40 μM黃芩素液處理1h,其后換用0.75 mM H2O2處理。

因線粒體超微結(jié)構(gòu)和膜電位對氧化應(yīng)激較為敏感，所以線粒體超微結(jié)構(gòu)觀察實(shí)驗(yàn)和線粒體膜電位檢測實(shí)驗(yàn)在24 h收取標(biāo)本，其他實(shí)驗(yàn)分別在24 h、48 h收取標(biāo)本。

1.2.3 線粒體超微結(jié)構(gòu)觀察 細(xì)胞常規(guī)消化，將1培養(yǎng)瓶(25 cm2)細(xì)胞收集至10 mL離心管中，1000 g離心5 min，棄上清，重懸，將細(xì)胞懸液移入0.5 mL EP管中，2000 g離心8 min，小心抽去上清液，加2.5%戊二醛溶液4℃固定24 h。固定好的標(biāo)本交由第四軍醫(yī)大學(xué)解剖學(xué)教研室電鏡中心制作透射電鏡切片，透射電鏡下觀察。

1.2.4 MTT法檢測線粒體活性 具體步驟：a.向96孔板每孔中加入1×MTT溶液50 μL，另選取無細(xì)胞的4孔各加入150 μL DMSO作空白對照組；b.37 ℃，5 % CO2、100 %濕度孵育4 h；c.將96孔板置平板搖床上，室溫，80 rpm振搖5 min；d.全自動酶標(biāo)儀570 nm波長處檢測光密度(OD)；e.線粒體活性率計(jì)算：每個檢測值均減去本底(空白對照組)的平均值。線粒體活性率=處理組OD/對照組OD。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測線粒體膜電位(Mitochondrial membrane potential, MMP) MMP檢測方法：a.將Red cm ROS用254培養(yǎng)基按1∶5000稀釋成工作液，避光保存；b.向培養(yǎng)細(xì)胞的六孔板每孔加入2 mL工作液，37℃孵育30 min；c.常規(guī)消化，收集細(xì)胞至離心管中，無菌生理鹽水洗1次，離心，棄上清；d.向每管細(xì)胞中加入500 μL生理鹽水重懸，移入流式管中，上流式細(xì)胞儀，選擇PE通道，檢測X-mean。

1.2.6 線粒體ATP產(chǎn)量變化檢測 細(xì)胞常規(guī)消化，用254培養(yǎng)基重懸，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，每組各取4500個細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)；向細(xì)胞中加入2%三氯乙酸50 μL/管，室溫靜置10 min后向管中加入50 μL 4%三羥甲基氨基甲烷中和，1000 g離心3 min，取上清；使用ENLITEN?ATP檢測試劑盒，用熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測樣品RLU值；使用試劑盒中ATP標(biāo)準(zhǔn)品配制梯度濃度的ATP溶液，檢測梯度濃度ATP溶液各自的RLU值；按照ATP濃度梯度和所測得的RLU值，建立RLU值-ATP濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得擬合公式；按照擬合公式和所測RLU值計(jì)算各樣品ATP含量。

1.2.7 RT-PCR技術(shù)檢測線粒體DNA拷貝數(shù)，觀察線粒體生物合成情況 收集細(xì)胞，按照天根血液/組織/細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒說明書操作步驟，提取全基因組DNA；分光光度計(jì)測DNA樣品濃度；Real-time PCR法檢測線粒體DNA拷貝數(shù)，選取線粒體DNA特征性基因ND4為檢測目標(biāo)，β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算對特異性擴(kuò)增的目的基因進(jìn)行相對定量。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。采用one-way anova檢驗(yàn)，各組數(shù)據(jù)兩兩比較，P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃芩素對氧化應(yīng)激狀態(tài)下PIG3V細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)的影響 線粒體超微結(jié)構(gòu)觀察顯示，對照組和單純黃芩素處理組細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)清晰、完整，線粒體嵴無腫脹，未見線粒體空泡化(圖1a，1b)。氧化應(yīng)激條件下PIG3V細(xì)胞部分線粒體出現(xiàn)空泡化改變，未空泡化的線粒體也出現(xiàn)了超微結(jié)構(gòu)損害，如線粒體內(nèi)膜腫脹、嵴增厚、嵴減少(圖1c)。黃芩素預(yù)處理后的再予以氧化應(yīng)激刺激PIG3V細(xì)胞中未見線粒體空泡化，線粒體結(jié)構(gòu)清晰、完整，僅有部分線粒體嵴輕度腫脹(圖1d)，較氧化應(yīng)激組PIG3V線粒體超微結(jié)構(gòu)損害明顯減輕?？梢婞S芩素預(yù)處理后PIG3V細(xì)胞線粒體抗氧化應(yīng)激能力增強(qiáng)，線粒體超微結(jié)構(gòu)損害改善。

2.2 黃芩素對氧化應(yīng)激狀態(tài)下PIG3V細(xì)胞線粒體活性率的影響 處理后24 h氧化應(yīng)激組線粒體活性率較對照組下降45.77%(P<0.05)，黃芩素預(yù)處理組較氧化應(yīng)激組未見明顯差異(P>0.05)。處理后48h時氧化應(yīng)激組線粒體活性率較對照組下降40.67%(P<0.05)，而黃芩素預(yù)處理組較氧化應(yīng)激組升高35.53%(P<0.05)。結(jié)果見圖2a。

2.3 黃芩素對氧化應(yīng)激狀態(tài)下PIG3V細(xì)胞線粒體膜電位的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示：氧化應(yīng)激條件下PIG3V細(xì)胞膜電位較對照組下降26.93%(P<0.05)。黃芩素預(yù)處理組較氧化應(yīng)激組升高37.54%(P<0.05)。結(jié)果見圖2b。

2.4 黃芩素對氧化應(yīng)激狀態(tài)下PIG3V細(xì)胞線粒體ATP含量的影響 細(xì)胞內(nèi)ATP含量處理后24 h各實(shí)驗(yàn)組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。48 h時氧化應(yīng)激組較對照組降低60.03%(P<0.05)，黃芩素預(yù)處理組較氧化應(yīng)激組組升高210.4%(P<0.05)。結(jié)果見圖2c。

2.5 黃芩素對氧化應(yīng)激狀態(tài)下PIG3V細(xì)胞線粒體DNA拷貝數(shù)的影響 處理后24 h，單純黃芩素處理組線粒體DNA拷貝數(shù)較對照組升高340%(P<0.05),氧化應(yīng)激組較對照組未見明顯差異；黃芩素預(yù)處理組較氧化應(yīng)激組升高113%(P<0.05)。48 h后單純黃芩素處理組線粒體DNA拷貝數(shù)較對照組未見明顯差異，氧化應(yīng)激組線粒體DNA拷貝數(shù)較對照組下降75.33%(P<0.05)，而黃芩素預(yù)處理組較氧化應(yīng)激組升高182.3%(P<0.05)。結(jié)果見圖2d。

圖1 黃芩素對氧化應(yīng)激下PIG3V細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響(a.對照組；b.單純黃芩素組；c.氧化應(yīng)激組；d.黃芩素預(yù)處理組。圖中紅色箭頭所指為線粒體嵴，藍(lán)色箭頭所指為空泡化的線粒體)

圖2 a：黃芩素對氧化應(yīng)激下PIG3V細(xì)胞線粒體活性率的影響(n=3，*P<0.05)；b：黃芩素對氧化應(yīng)激下PIG3V細(xì)胞線粒體的膜電位的影響(n=3，*P<0.05)；c：黃芩素對氧化應(yīng)激下PIG3V細(xì)胞ATP含量的影響(n=3，*P<0.05)；d：黃芩素對氧化應(yīng)激下PIG3V細(xì)胞線粒體DNA拷貝數(shù)的影響(n=3，*P<0.05)

3 討論

線粒體是真核細(xì)胞“動力工廠”，它除了合成ATP之外，還具有多種重要的功能，包括產(chǎn)生ROS、調(diào)節(jié)氧化還原電位、細(xì)胞氧化還原信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)控細(xì)胞凋亡和基因表達(dá)等。細(xì)胞中95%的ROS來源于線粒體，線粒體既是ROS產(chǎn)生的主要場所，又是ROS攻擊的主要靶細(xì)胞器[4]。

氧化應(yīng)激導(dǎo)致白癜風(fēng)患者黑素細(xì)胞破壞，而氧化應(yīng)激導(dǎo)致的線粒體損傷是黑素細(xì)胞破壞的重要原因，因?yàn)榫€粒體損傷誘導(dǎo)的線粒體凋亡途徑是細(xì)胞凋亡主要途徑之一。線粒體損傷后MMP下降，ATP產(chǎn)生減少，Cyt C釋放至胞漿，形成Cyt C/Apaf-1/procaspase-3凋亡復(fù)合體，引起procaspase-3激活成caspase-3進(jìn)而引起細(xì)胞的凋亡[5]。

本實(shí)驗(yàn)中用H2O2處理PIG3V細(xì)胞，結(jié)果顯示線粒體超微結(jié)構(gòu)損害，線粒體活性下降，MMP水平下降，ATP生產(chǎn)能力下降，提示線粒體功能障礙。而單獨(dú)用黃芩素處理PIG3V細(xì)胞，線粒體活性、MMP、細(xì)胞ATP含量等指標(biāo)與對照組比較未見明顯差異?？梢婞S芩素直接提高PIG3V細(xì)胞線粒體功能的作用并不明顯。黃芩素可能是通過間接途徑提高線粒體功能的。本實(shí)驗(yàn)中H2O2可抑制細(xì)胞內(nèi)的線粒體生物合成，降低細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)。而黃芩素單獨(dú)作用于PIG3V細(xì)胞后24 h，即表現(xiàn)出對線粒體生物合成明顯的促進(jìn)作用，使線粒體DNA拷貝數(shù)明顯增加，此作用在24 h時最明顯，其后則逐漸減弱。我們推測黃芩素促進(jìn)氧化應(yīng)激下線粒體的生物合成，提高線粒體活性率、線粒體膜電位、ATP含量，抵消了氧化應(yīng)激造成的線粒體數(shù)量損失和功能下降，是黃芩素改善氧化應(yīng)激下線粒體功能障礙的可能機(jī)制。

有文獻(xiàn)報(bào)道，在6-OHDA誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激模型中，黃芩素通過激活Keap1/Nrf2/HO-1通路保護(hù)PC12細(xì)胞[6]；在V79-4細(xì)胞造成氧化應(yīng)激損傷模型中，黃芩素可激活 Nrf2通路，升高M(jìn)nSOD蛋白表達(dá)水平，抵抗氧化應(yīng)激對細(xì)胞的損傷[7]。我們課題組前期研究證實(shí)過表達(dá)Nrf2可以促進(jìn)黑素細(xì)胞線粒體生物合成相關(guān)基因和蛋白(NRF1、TFAM)的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)線粒體生物合成、上調(diào)線粒體功能相關(guān)的指標(biāo)，改善白癜風(fēng)患者黑素細(xì)胞的線粒體功能[8]。以上結(jié)果提示黃芩素可能是通過Nrf2-NRF1-TFAM途徑促進(jìn)線粒體生物合成，補(bǔ)充新的線粒體，抵消氧化應(yīng)激造成的線粒體結(jié)構(gòu)損害和功能下降，進(jìn)而提高黑素細(xì)胞抗氧化能力。

[1] Prignano F, Pescitelli L, Becatti M, et al. Ultrastructural and functional alterations of mitochondria in perilesionalvitiligo skin[J]. J Dermatol Sci,2009,54(3):157-167.

[2] Liu B, Jian Z, Li Q, et al. Baicalein protects human melanocytes from H2O2-induced apoptosis via inhibiting mitochondria-dependent caspase activation and the p38 MAPK pathway[J]. Free Radic Biol Med,2012,53(2):183-193.

[3] 田軍,朱龍飛,堅(jiān)哲,等.過氧化氫誘導(dǎo)人黑素細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型的建立[J].實(shí)用皮膚性病學(xué)雜志,2014,7(6):406-410.

[4] Murphy MP. How mitochondria produce reactive oxygen species[J]. Biochem J,2009,417(1):1-13.

[5] Stevens JM. Cytochrome c as an experimental model protein[J]. Metallomics,2011,3(4):319-322.

[6] Zhang Z, Cui W, Li G, et al. Baicalein protects against 6-OHDA-induced neurotoxicity through activation of Keap1/Nrf2/HO-1 and involving PKCalpha and PI3K/AKT signaling pathways[J]. J Agric Food Chem,2012,60(33):8171-8182.

[7] Lee IK, Kang KA, Zhang R, et al. Mitochondria protection of baicalein against oxidative damage via induction of manganese superoxide dismutase[J]. Environ Toxicol Pharmacol,2011,31(1):233-241.

[8] 朱龍飛,田軍,堅(jiān)哲,等.過表達(dá)Nrf2對白癜風(fēng)黑素細(xì)胞線粒體生物合成和功能的影響[J].中華皮膚科雜志,2015,48(6):5-9.

(收稿：2016-09-07 修回：2016-12-14)

Effects of baicalein on the mitochondrial ultrastructure and function in stressed vitiligo melanocytes

ZHULongfei1,2TIANJun1,3,JIANZhe1,ZHANGWeigang1,LIUBangmin1,LIChunying1,GAOTianwen1.

1DepartmentofDermatology,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'an710032,China; 2No.538HospitalofPLA,Hanzhong723000,Shaanxi,China; 3OutpatientDepartmentofNo.63600ArmyofPLA,Jiuquan732750,Gansu,China

GAOTianwen,E-mail：gaotw@fmmu.edu.cn

Objective: To determine the effects of baicalein (BE) on the mitochondrial ultrastructure and function in stressed vitiligo melanocytes. Methods: The vitiligo melanocyte line (PIG3V) cells were cultured in vitro, and then, were divided into the blank control group, baicalein group, H2O2group and baicalein+H2O2group. The ultrastructure changes of mitochondria were observed under electron microscope. The mitochondrial activity, mitochondrial membrane potential (MMP), level of intracellular ATP, copy number of mitochondrial DNA (mtDNA) were detected by MTT, flow cytometry, ENLITEN ATP assay kit and real-time PCR (RT-PCR) respectively. Results: Compared with the H2O2group, the level of the damage of mitochondrial ultrastructure was lower and the level of mitochondrial activity, MMP, intracellular ATP, copy number of mitochondrial DNA (mtDNA) were higher in the baicalein+H2O2group. Conclusion: BE protects the structure and function of mitochondria from the damage of oxidative stress and enhances the anti-oxidative ability of PIG3V cells.

baicalein; vitiligo; melanocyte; mitochondria; oxidative stress

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號：81373844，81402599)

1第四軍醫(yī)大學(xué)西京皮膚醫(yī)院，陜西西安，710032 2解放軍第538醫(yī)院，陜西漢中，723000 3解放軍63600部隊(duì)司令部門診部，甘肅酒泉，732750

高天文，E-mail：gaotw@fmmu.edu.cn