“連花湯”正丁醇提物對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

唐瑤 包曉霞 魯周南 薛曉鷗

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·論著·

“連花湯”正丁醇提物對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

唐瑤 包曉霞 魯周南 薛曉鷗

目的 研究“連花湯”正丁醇提物對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，為臨床應(yīng)用“連花湯”治療子宮內(nèi)膜癌提供實驗依據(jù)。方法 提取物從10 mg/mL依次降濃度梯度至0.078125 mg/mL分成8組，即：10 mg/mL、5 mg/mL、2.5 mg/mL、1.25 mg/mL、0.625 mg/mL、0.3125 mg/mL、0.15625 mg/mL、0.078125 mg/mL組。MTT法檢測細(xì)胞抑制率；分別計算出兩種細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率。結(jié)果 “連花湯”正丁醇提物在不同濃度、不同時間里對2種內(nèi)膜癌細(xì)胞系的增殖有顯著抑制作用。其中，作用24小時、48小時，HEC-1A細(xì)胞1.25 mg、0.625 mg、0.3125 mg組間細(xì)胞抑制率有顯著性差異(P<0.01)；Ishikawa細(xì)胞5 mg/mL、2.5 mg/mL、1.25 mg/mL、0.625 mg/mL、0.3125 mg/mL、0.15625 mg/mL組間細(xì)胞抑制率有顯著性差異(P<0.01)；作用24小時，HEC-1A細(xì)胞、Ishikawa細(xì)胞10 mg、5 mg、0.625 mg、0.078125 mg組間細(xì)胞抑制率有顯著性差異(P<0.01)。與正常組相比，“連花湯”正丁醇提物細(xì)胞凋亡率顯著增高，差異顯著。其中，HEC-1A細(xì)胞：高劑量組0.4 mg/mL、中劑量組0.2 mg/mL、低劑量組0.1 mg/mL與正常組比較，細(xì)胞凋亡率有顯著性差異(P<0.01)；Ishikawa細(xì)胞：Ishikawa 高劑量組1.0 mg/mL、中劑量組0.5 mg/mL、低劑量組0.25 mg/mL與正常組比較，細(xì)胞凋亡率有顯著性差異(P<0.05)。結(jié)論 “連花湯”正丁醇提物能有效抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

子宮內(nèi)膜癌； “連花湯”正丁醇提物； 細(xì)胞增殖； 細(xì)胞凋亡

子宮內(nèi)膜癌(endometrial carcinoma，EC)是女性生殖系統(tǒng)最常見的三大惡性腫瘤之一。在中國，其發(fā)病率僅次于宮頸癌，約占女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的20%～30%，占女性全身惡性腫瘤的7%[1]。根據(jù)子宮內(nèi)膜癌的臨床特點和預(yù)后將其分為2型:Ⅰ型為雌激素依賴型，Ⅱ型為非雌激素依賴型[2]。Ishikawa細(xì)胞是ER陽性子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系,HEC-1A細(xì)胞為ER低表達(dá)細(xì)胞系。目前子宮內(nèi)膜癌的治療原則是以手術(shù)為主，輔以放療、化療、內(nèi)分泌治療及生物治療等[3]。

前期研究發(fā)現(xiàn)[4]，中藥復(fù)方“連花湯”中部分單體多糖能通過抑制子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞即Ⅰ型雌激素依賴型中TAMS活化下調(diào)TLR4/MYD88信號通路表達(dá),抑制TAMS的活化，從而起到抗子宮內(nèi)膜癌的作用。而“連花湯”對Ⅱ型非雌激素依賴型HEC-1A子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、凋亡的研究尚未見報道。因此本研究即以清熱解毒方“連花湯”復(fù)方正丁醇提取物分別作用于2種子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系，觀察其對兩種子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，檢驗相互之間是否有差異，為臨床提供實驗學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株

人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株Ishikawa細(xì)胞及HEC-1A細(xì)胞由北京大學(xué)人民醫(yī)院婦科實驗室友情贈送。

1.2 藥物與試劑

“連花湯”正丁醇提取物制備：中藥復(fù)方“連花湯”：黃連10 g、白花蛇舌草15 g、半枝蓮15 g、生黃芪20 g，5劑，采購自東直門醫(yī)院中草藥房，于北京大學(xué)天然藥物及仿生藥物國家重點實驗藥室以正丁醇萃取，烘箱烘干，密封，冰箱4攝氏度保存。胎牛血清購自Gibco，DMEM 購自Hyclone，MTS試劑購自Promega，凋亡試劑購自BD公司。

1.3 儀器設(shè)備

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、酶聯(lián)免疫檢測儀(美國Thermo Scientific公司)，垂直超凈工作臺(Esco公司)，節(jié)能型智能恒溫槽(寧波新芝生物科技有限公司)，倒置熒光顯微鏡(北京銳馳恒業(yè)儀器科技有限公司)、流式細(xì)胞儀(Epics Elite ESP型，美國Coulter公司)。

1.4 方法

1.4.1 MTS法檢測子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖情況及計算IC50值 將Ishikawa及HEC-1A于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件在5%CO2、37℃及飽和濕度下進(jìn)行，以1×104cells/well接種于96孔板中，常規(guī)培養(yǎng)24小時，待細(xì)胞貼壁后，將“連花湯”正丁醇提取物溶解在含0.1%DMSO的培養(yǎng)液中，配成20 mg/mL的母液，于實驗當(dāng)天用DMEM培養(yǎng)液稀釋。MTT檢測子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖情況，被試藥物被稀釋為8個濃度梯度，即：10 mg/mL、5 mg/mL、2.5 mg/mL、1.25 mg/mL、0.625 mg/mL、0.3125 mg/mL、0.15625 mg/mL、0.078125 mg/mL。實驗分為18個組:Ishikawa 8個藥物濃度組和對照組(培養(yǎng)液+細(xì)胞)；HEC-1A組8個藥物濃度組和對照組(培養(yǎng)液+細(xì)胞)，分別作用24、48小時。在細(xì)胞處于對數(shù)生長期時棄原培養(yǎng)基，加入16組干預(yù)藥物工作液100 μL/孔。16組細(xì)胞處理24、48小時(每組設(shè)5個復(fù)孔)后，棄藥物工作液及對照組培養(yǎng)基，每孔加入MTS溶液(5 g/L)20 μL+80 μL無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育4小時，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm處讀取每孔的吸光度(OD)值。按下列公式計算細(xì)胞抑制率(%)=(1-加藥組測定的平均OD 值/對照孔測定的平均OD 值)×100%，繪制細(xì)胞抑制率曲線。1.4.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況 根據(jù)MTT計算細(xì)胞IC50值，分別計算兩種細(xì)胞系給藥濃度，分為高劑量組(IC50組)、中劑量組(1/2 IC50)、低劑量組(1/4 IC50組)，HEC-1A：高劑量組0.4 mg/mL、中劑量組0.2 mg/mL、低劑量組0.1 mg/mL、正常組及陽性對照組；Ishikawa 高劑量組1.0 mg/mL、中劑量組0.5 mg/mL、低劑量組0.25 mg/mL，正常組及陽性對照組。各組細(xì)胞加藥干預(yù)24小時后收集細(xì)胞，檢測細(xì)胞凋亡，培養(yǎng)基+細(xì)胞組作為空白對照。200 μ binding buffer重懸細(xì)胞加入10 μL Annexin V和4 μL propidium iodide，室溫中避光孵育30分鐘，最后加入300 μL binding buffer，1小時內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測，Cell Quest軟件計算細(xì)胞凋亡率。每組實驗重復(fù)3次。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 “連花湯”正丁醇提物對HEC-1A及Ishikawa細(xì)胞增殖影響

HEC-1A及Ishikawa兩種細(xì)胞系多組間抑制率進(jìn)行獨立樣本t檢驗(時間，濃度)，HEC-1A、Ishikawa兩組細(xì)胞隨時間和藥物濃度的增加，細(xì)胞的抑制率增加。不同時間，不同濃度組之間差異不同，見表1。

2.2 流式細(xì)胞儀檢測“連花湯”正丁醇提物對HEC-1A及Ishikawa細(xì)胞凋亡影響

Probit法用于計算IC50，細(xì)胞凋亡各組間采用單因素方差分析LSD法進(jìn)行組間兩兩比較。見表2。

2.3 “連花湯”正丁醇提物對HEC-1A及Ishikawa細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞儀檢測圖

圖1～4所示細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果，其中Q1為死亡細(xì)胞，Q2為晚期凋亡細(xì)胞，Q3為活細(xì)胞，Q4為早期凋亡細(xì)胞，Q2+Q4即為各組細(xì)胞總凋亡率。從所有結(jié)果中選擇四組作為示例，結(jié)果可見，“連花湯”正丁醇給藥組HEC-1A、Ishikawa細(xì)胞凋亡率與陰性對照組比較差異有顯著性。

表1 “連花湯”正丁醇提物對Ishikawa及HEC-1A細(xì)胞 抑制率(%)的比較

注： HEC-1A細(xì)胞作用24小時、48小時兩組間比較，1.25 mg、0.625 mg、0.3125 mg組間有差異，aP<0.01；Ishikawa細(xì)胞作用24小時、48小時兩組間比較，5 mg/mL、2.5 mg/mL、1.25 mg/mL、0.625 mg/mL、0.3125 mg/mL、0.15625 mg/mL組間有差異，bP<0.01；HEC-1A細(xì)胞、Ishikawa細(xì)胞作用24小時，兩組間比較10 mg、5 mg、0.625 mg、0.078125 mg組間有差異，cP<0.01。

表2 “連花湯”正丁醇提物對Ishikawa及HEC-1A細(xì)胞 凋亡率(%)的比較

注： HEC-1A細(xì)胞：高劑量組、中劑量組、低劑量組、陽性對照組與正常組比較，aP<0.01；低劑量組與高劑量組、中劑量組比較，bP<0.05；Ishikawa細(xì)胞：高劑量組、中劑量組、低劑量組與正常組比較，cP<0.05。三個組與陽性對照組比較，dP<0.01。

圖2 HEC-1A細(xì)胞凋亡正常對照組

圖3 Ishikawa細(xì)胞凋亡“連花湯”正丁醇提物 中劑量給藥組0.5 mg/mL

圖4 Ishikawa細(xì)胞凋亡正常對照組

3 討論

3.1 連花湯醇提物能有效抑制Ishikawa及HEC-1A的增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

從MTT來看，“連花湯”正丁醇提物均能有效抑制Ishikawa及HEC-1A的增殖，呈明顯時間依賴性，而從細(xì)胞凋亡來看，沒有明顯劑量依賴，HEC-1A細(xì)胞藥物中等濃度凋亡率高于高等濃度，然兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義，Ishikawa細(xì)胞也是中等濃度誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率最高，而三者差異無統(tǒng)計學(xué)意義，分析原因，其一可能在凋亡實驗中高劑量用藥濃度并未被完全利用，中等劑量就能誘導(dǎo)大部分細(xì)胞凋亡。其二，可能與重復(fù)次數(shù)少有關(guān)，今后實驗可以加大樣本量及重復(fù)次數(shù)，再做統(tǒng)計。

3.2 “連花湯”正丁醇提物對HEC-1A細(xì)胞藥效優(yōu)于Ishikawa細(xì)胞

對Ishikawa及HEC-1A兩個細(xì)胞系之間比較，“連花湯”正丁醇提物在較高劑量組間的抑制率差異有統(tǒng)計學(xué)意義，在中等劑量間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可能與MTT的精確度不高有關(guān)，從凋亡的結(jié)果來看，“連花湯”正丁醇提物對HEC-1A效果要好，最佳藥效濃度在0.2 mg/mL，而Ishikawa最佳藥效濃度在0.5 mg/mL。

3.3 “連花湯”正丁醇提物對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的抑制可能不通過ER受體表達(dá)通路

既往研究發(fā)現(xiàn)中藥有效成分對子宮內(nèi)膜癌作用機(jī)制大致為影響雌激素受體拮抗雌激素作用，引起癌細(xì)胞DNA損傷，阻滯癌細(xì)胞周期，抑制癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，影響子宮內(nèi)膜癌侵襲力，抑制子宮內(nèi)膜癌新生血管生成及逆轉(zhuǎn)耐藥性等[5]。Ishikawa為ER陽性子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系,HEC-1A為ER低表達(dá)細(xì)胞系，達(dá)到同樣的抑制率Ishikawa所需“連花湯”正丁醇提物藥物濃度比HEC-1A要高很多。因此可以推測“連花湯”正丁醇提物對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的抑制機(jī)制可能不通過ER受體表達(dá)通路影響，而是通過其他機(jī)制作用。具體通過哪種機(jī)制作用，有待進(jìn)一步細(xì)胞周期實驗及信號通路實驗研究探討。

中醫(yī)藥治療子宮內(nèi)膜癌強(qiáng)調(diào)以“扶正祛邪、攻補兼施”為總則。“連花湯”以黃連、白花蛇舌草、半枝蓮清熱解毒，生黃芪益氣扶正，可以彌補手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)治療的不足。手術(shù)固然能切除癌腫，但還有殘癌區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管中癌栓存在等，運用中醫(yī)中藥術(shù)后長期治療，可以防止復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移；放療、化療治療對消化道和造血系統(tǒng)有一定的毒副作用，損傷機(jī)體正氣，運用中醫(yī)中藥治療既能提高機(jī)體正氣加強(qiáng)放療、化療的效果，又能減輕放、化療的毒副作用，對于晚期子宮內(nèi)膜癌癥患者或不能手術(shù)和放療、化療的患者可以采用中醫(yī)中藥治療[6]。本實驗為進(jìn)一步的實驗研究提供了一定基礎(chǔ)，本方對子宮內(nèi)膜癌患者術(shù)前、術(shù)后的治療均有重要的參考價值。

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[2] Bokhman J V.Two pathogenetic types of endometrial carcinoma.[J].Gynecologic Oncology,1983,15(1):10-7.

[3] 公苓苓,郭楊,孫浩罡,等.子宮內(nèi)膜癌的治療進(jìn)展[J].中國婦幼保健,2015,30(11):1797-1799.

[4] 包曉霞,李柳葉,薛曉鷗.連花湯通過抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中TAMs活化下調(diào)TLR4/MyD88信號通路表達(dá)的分子機(jī)制研究[C]//2015全國中西醫(yī)結(jié)合月經(jīng)病專題學(xué)術(shù)會議論文及摘要集，2015:3.

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(本文編輯： 禹佳)

Effect of N-butanolextract fromLianhuadecoction on proliferation and apoptosis of human endometrial cancer cell

TANGYao，BAOXiaoxia，LUZhounan，etal.

DongzhimenHospitalBejingUniversityofChineseMedicine，Beijing100700,China

XUEXiaoou,E-mail:Pro_xue@163.com

Objective To investigate the effect of N-butanol extract fromLianhuadecoction on proliferation and apoptosis of human endometrial cancer cell, and provide the experimental evidence of endometrial cancer treatment.Methods N-butanol extract fromLianhuadecoction was divided into 10 mg/mL,5 mg/mL,2.5 mg/mL,1.25 mg/mL,0.625 mg/mL,0.3125 mg/mL,0.15625 mg/mL,0.078125 mg/mL gourps. Half inhibition concentration(IC50) of cell was calculated, apoptosis rate was detected by flow cytometry.Results N-butanol extract fromLianhuadecoction had significant inhibitory effects on the proliferation of two kinds of endometrial cancer cell lines at different concentrations and different time. The inhibition rates of HEC-1A cells in 1.25 mg gourp, 0.625 mg gourp, 0.3125 mg gourp were significantly different at 24 hours and 48 hours (P<0.01). Cell inhibition rate of Ishikawa cell in 5 mg/mL gourp, 2.5 mg/mL gourp, 1.25 mg/mL gourp, 0.625 mg/mL gourp, 0.3125 mg/ml gourp, 0.15625 mg/mL gourp had significant difference (P<0.01,P<0.01). Cell inhibition rate of HEC - 1 A cells and Ishikawa cells in 10 mg gourp, 5 mg gourp, 0.625 mg gourp, 0.078125 mg gourp had significant difference in 24 hours(P<0.01). Compared with normal group , the apoptosis rate of N-butyl alcohol extract fromLianhuadecoctionon was significantly higher. The cell apoptosis rate of high dose of 0.4 mg/mL, middle dose group of 0.2 mg/mL and low dose of 0.1 mg/mL had significant difference compared with normal group in HEC-1A cell(P<0.01). The cell apoptosis rate of high dose of 1.0 mg/mL, middle dose group of 0.5 mg/mL and low dose group of 0.25 mg/mL had significant difference compared with normal group in Ishikawa cell(P<0.05).Conclusion The N-butanol extract fromLianhuadecoction can effectively inhibit the cell proliferation and induce cell apoptosis.

Endometrial cancer; N-butanol extract fromLianhuadecoction; Cell proliferation; Cell apoptosis

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金(81403262)

100700 北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院婦科[唐瑤(博士研究生)、包曉霞、魯周南、薛曉鷗]

唐瑤(1985- )，2014級在讀博士研究生。研究方向:中西醫(yī)結(jié)合治療婦科腫瘤。E-mail:tangyaobeijing@126.com

薛曉鷗(1963- )，女，博士，教授，主任醫(yī)師。研究方向：中西醫(yī)結(jié)合治療婦科內(nèi)分泌及腫瘤。E-mail：Pro_xue@163.com

R711.74

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.06.012

2017-02-19)