生物化學(xué)綜合性實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)與實(shí)現(xiàn)
——以親和層析法純化豬胰蛋白酶為例

黃體冉， 劉悅萍， 張國(guó)慶， 王文平， 張 靜

(1. 北京農(nóng)學(xué)院 生物科學(xué)與工程學(xué)院, 北京 102206; 2. 農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)(北方)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 102206)

生物化學(xué)綜合性實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)與實(shí)現(xiàn)
——以親和層析法純化豬胰蛋白酶為例

黃體冉1,2， 劉悅萍1， 張國(guó)慶1， 王文平1， 張 靜1

(1. 北京農(nóng)學(xué)院 生物科學(xué)與工程學(xué)院, 北京 102206; 2. 農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)(北方)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 102206)

生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)是生命科學(xué)領(lǐng)域一門(mén)重要專(zhuān)業(yè)基礎(chǔ)課，其所包含的實(shí)驗(yàn)技術(shù)在訓(xùn)練學(xué)生基本技能、培養(yǎng)實(shí)踐能力和創(chuàng)新能力上起著至關(guān)重要的作用。圍繞生物化學(xué)中蛋白質(zhì)化學(xué)、酶學(xué)性質(zhì)的有關(guān)內(nèi)容，將雞卵粘蛋白的制備、豬胰蛋白酶的制備、豬胰蛋白酶的純化以及純胰蛋白酶活性和雞卵粘蛋白抑制活性的測(cè)定重新整合，設(shè)計(jì)了一個(gè)包括蛋白質(zhì)分離純化、蛋白質(zhì)含量測(cè)定以及酶活性測(cè)定3個(gè)單元的綜合性實(shí)驗(yàn)，并將光譜和色譜技術(shù)融入其中。最后對(duì)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的綜合性設(shè)計(jì)部分進(jìn)行了探索性研究，以期為生物化學(xué)綜合性、設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)開(kāi)發(fā)和研究提供參考。

生物化學(xué); 綜合性實(shí)驗(yàn); 柱層析; 分離純化

0 引 言

生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)是生命科學(xué)領(lǐng)域的一門(mén)專(zhuān)業(yè)基礎(chǔ)課程之一，是植(動(dòng))物生理學(xué)、遺傳學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、微生物學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞工程、基因工程等理論及其實(shí)驗(yàn)課程先修課程。在以往的生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，基礎(chǔ)性實(shí)驗(yàn)、驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)的授課學(xué)時(shí)占去了整個(gè)實(shí)驗(yàn)授課學(xué)時(shí)的大部分，學(xué)生只要按照實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書(shū)上的步驟按部就班的完成相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作即可，一定程度上束縛了學(xué)生的思維，不利于學(xué)生主觀能動(dòng)性的發(fā)揮，更不利于學(xué)生分析和解決問(wèn)題能力的培養(yǎng)和科學(xué)素養(yǎng)的形成[1]。綜合性實(shí)驗(yàn)屬于復(fù)合性實(shí)驗(yàn)范疇，往往與本課程綜合知識(shí)相關(guān)的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，或與本課程相關(guān)課程知識(shí)的實(shí)驗(yàn)，是綜合訓(xùn)練學(xué)生技能的方法[2]。通過(guò)綜合性實(shí)驗(yàn)教學(xué)，一方面使學(xué)生掌握的理論知識(shí)逐步系統(tǒng)化，激發(fā)學(xué)生帶著好奇的眼光初步了解探索科學(xué)研究領(lǐng)域興趣，培養(yǎng)和提高學(xué)生的動(dòng)手能力；另一方面還可通過(guò)專(zhuān)業(yè)綜合創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)的訓(xùn)練，增加學(xué)生對(duì)科研領(lǐng)域中先進(jìn)課題實(shí)驗(yàn)技能、原理、研究現(xiàn)狀及發(fā)展前景的認(rèn)知，提高學(xué)生關(guān)注和學(xué)習(xí)與學(xué)科前沿問(wèn)題相關(guān)實(shí)驗(yàn)知識(shí)體系的意識(shí)，增強(qiáng)學(xué)生的科學(xué)探索與創(chuàng)新精神[3]。目前，國(guó)內(nèi)多數(shù)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)教材，生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)基本上是按照糖、脂肪、蛋白質(zhì)、核酸等的理化性質(zhì)為模塊進(jìn)行設(shè)置的，雖然每個(gè)模塊單獨(dú)設(shè)置實(shí)驗(yàn)，但實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目之間銜接不夠，甚至相互割裂，這在一定程度上制約了生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)在培養(yǎng)應(yīng)用型、創(chuàng)新型人才方面作用的發(fā)揮。近年來(lái)，生物化學(xué)教學(xué)團(tuán)隊(duì)結(jié)合自身教學(xué)實(shí)踐，嘗試將一些模塊串聯(lián)起來(lái)，形成一個(gè)內(nèi)容相關(guān)、實(shí)驗(yàn)方法多樣的綜合性實(shí)驗(yàn)，同時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)教學(xué)模式進(jìn)行了改革，取得了良好的效果。

1 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中存在的問(wèn)題

教學(xué)實(shí)驗(yàn)是為達(dá)到某種教學(xué)目的而有計(jì)劃安排的實(shí)驗(yàn)，是學(xué)生在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的教學(xué)活動(dòng)[4]。生物化學(xué)課程教學(xué)的主要內(nèi)容包括糖類(lèi)、脂類(lèi)、蛋白質(zhì)(含氨基酸)、核酸(DNA和RNA)的理化性質(zhì)、分離鑒定、定量測(cè)定，以及酶促動(dòng)力學(xué)等內(nèi)容[5]，相應(yīng)地實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容包括糖的顏色反應(yīng)、可溶性總糖、還原糖和淀粉含量的測(cè)定、蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及其定量測(cè)定、蛋白質(zhì)的分離純化、氨基酸含量測(cè)定、核酸定量測(cè)定、維生素C含量的測(cè)定、酶的特異性、溫度、pH對(duì)酶活性的影響、酶活性的測(cè)定等。傳統(tǒng)的生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)一般是將這些單元作為一個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)進(jìn)行教學(xué)。雖然開(kāi)設(shè)的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目基本涵蓋了主要教學(xué)內(nèi)容，但實(shí)驗(yàn)內(nèi)容簡(jiǎn)單，缺乏關(guān)聯(lián)性、系統(tǒng)性。這種單元化教學(xué)方式很容易使得學(xué)生獲得的知識(shí)也呈現(xiàn)單元化，進(jìn)而導(dǎo)致學(xué)生不能很好理解生物化學(xué)的理論教學(xué)內(nèi)容，更不能活學(xué)活用生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)。如果能將這些單元化的實(shí)驗(yàn)串聯(lián)起來(lái)，組裝成一個(gè)綜合性實(shí)驗(yàn)，必將有助于學(xué)生對(duì)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)的全局有一個(gè)把握，使學(xué)生能夠深刻理解并掌握各實(shí)驗(yàn)間的有機(jī)聯(lián)系。

2 綜合性實(shí)驗(yàn)的內(nèi)容與設(shè)計(jì)

普通高等學(xué)校開(kāi)設(shè)綜合性實(shí)驗(yàn)的目的，是通過(guò)課程實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)學(xué)生的實(shí)驗(yàn)綜合與應(yīng)用能力、理論與實(shí)際相結(jié)合的能力和創(chuàng)新研究能力[6]。因此，基于生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)的特殊性，團(tuán)隊(duì)僅僅圍繞上述目標(biāo)，按照實(shí)驗(yàn)內(nèi)容復(fù)合性、實(shí)驗(yàn)方法多元性、實(shí)驗(yàn)手段多樣性、人才培養(yǎng)綜合性的要求，秉承互補(bǔ)、交融、滲透、承前啟后、遞進(jìn)的原則[4,6]，設(shè)計(jì)出了一個(gè)親和層析法分離純化豬胰蛋白酶的綜合性實(shí)驗(yàn)。

2.1 綜合性實(shí)驗(yàn)的內(nèi)容

親和層析法分離純化豬胰蛋白酶的基本實(shí)驗(yàn)內(nèi)容包括雞卵粘蛋白的制備、豬胰蛋白酶的制備以及豬胰蛋白酶的純化三部分內(nèi)容。

2.1.1 雞卵粘蛋白的制備

取新鮮雞蛋蛋清50 mL，緩慢加入等體積10% pH 1.15 的三氯乙酸溶液，邊加入邊攪拌，直至蛋清沉淀均勻，用5 mol/L NaOH或5mol/L HCl調(diào)懸濁液的pH值至3.5，室溫下靜止4 h以上。 待清蛋白完全沉淀后，以3 000 r/min離心10 min，棄沉淀，上清液用濾紙過(guò)濾，除去上清液中的脂類(lèi)物質(zhì)及不溶物，收集濾液到500 mL燒杯，檢查pH=3.5(準(zhǔn)確)，放置冰浴冷卻片刻，緩緩加入3倍體積的預(yù)冷丙酮，用玻璃棒攪拌均勻，并用塑料薄膜蓋好防止丙酮揮發(fā)，冰浴放置4 h以上。待雞卵粘蛋白完全沉淀后，小心傾出一部分上清液，剩余的部分沉淀液全部轉(zhuǎn)移到50 mL離心管里，蓋好蓋，以3 000 r/min離心15 min，棄上清液，離心杯沉淀物放入真空干燥器或通風(fēng)廚內(nèi)抽氣，除去殘留丙酮，然后用20 mL蒸餾水溶解，如液體渾濁可用濾紙過(guò)濾，即可獲得雞卵粘蛋白粗品[7]。

取20 mL雞卵粘蛋白粗品通過(guò)Sephadex G-25 柱層析脫鹽(上樣量不得超過(guò)柱床體積的1/6)用0.02 mol/L pH6.5磷酸緩沖液(以下簡(jiǎn)稱(chēng)Buffer)洗脫收集雞卵粘蛋白粗提液；將脫鹽的雞卵粘蛋白粗提液上DE-32陰離子交換柱吸附， 以Buffer平衡，流出液經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定光吸收A280 nm小于0.02以后，改用含0.3 mol/L NaCl的Buffer洗脫，收集洗脫峰，收集體積一般在35-45 mL為宜。將經(jīng)DEAE-32陰離子交換柱層析分離的雞卵粘蛋白溶液裝入透析袋內(nèi)對(duì)蒸餾水透析，間隔一段時(shí)間更換一次蒸餾水，直到用1%AgNO3檢查無(wú)氯離子為止；透析液轉(zhuǎn)移到燒杯內(nèi)，取出2 mL透析液測(cè)定雞卵粘蛋白含量及其抑制活性，其余的透析液用1 mol/L HCl調(diào)到pH4.0，量取體積，然后加入3倍體積的預(yù)冷丙酮沉淀(此時(shí)應(yīng)當(dāng)出現(xiàn)大量的白色沉淀，否則就是溶液的pH值不準(zhǔn)確)，蓋上塑料膜，在冰浴里靜置4 h以上或過(guò)夜；待雞卵粘蛋白析出后，傾出部分上清液，剩余的沉淀液裝入50 mL離心管里，于3 000 r/min離心15 min，棄去上清液，收集沉淀物真空干燥，干燥后的雞卵粘蛋白為透明膠狀物；然后以提取的雞卵粘蛋白為樣品，分別測(cè)定其濃度和活性[8]。

2.1.2 豬胰蛋白酶粗提取液的制備

稱(chēng)50 g豬胰臟(已剝?nèi)ブ竞徒Y(jié)締組織)，剪碎后裝入組織搗碎機(jī)內(nèi)，加入150 mL預(yù)冷的3.5%乙酸酸化水，勻漿(5 s/次，間隔30 s，共3次)，然后把勻漿轉(zhuǎn)移到5 00 mL燒杯中，在4℃冰箱提取2 h，4層紗布過(guò)濾，濾液用2.5 mol/L H2SO4調(diào)pH至3.0，4 ℃冰箱靜置2 h以上，靜置期間pH值保持在3.0左右，然后用濾紙過(guò)濾，收集濾液待激活。將胰蛋白酶原的粗提取液用5 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至8.0，量取溶液體積；加入固體CaCl2使溶液Ca2+的終濃度達(dá)到0.1 mol/L，再次檢查溶液pH是否是8.0，若偏酸或偏堿，則用5 mol/L的NaOH或HCl精確調(diào)pH至8.0；然后，加入約50 mg標(biāo)準(zhǔn)胰蛋白酶，混勻，在4℃冰箱中激活12～16 h。在酶激活期間，經(jīng)常檢測(cè)酶的活性，取1 mL上清液分別測(cè)定胰蛋白酶的濃度和活性，待酶的比活達(dá)到1 000 u/mg時(shí)，用2.5 mol/L H2SO4調(diào)至pH至3.0，停止激活[9]。

2.1.3 豬胰蛋白酶的純化

稱(chēng)取10 g Sepharose 4B置于玻璃燒結(jié)漏斗G-3中抽干，用100 mL 1.0 mol/L NaCl溶液抽洗3次，再用200 mL蒸餾水抽洗3次，抽干后轉(zhuǎn)移到小三角瓶?jī)?nèi)。然后依次加入7 mL蒸餾水、8 mL 1，4二氧六環(huán)、6.5 mL 2 mol/L NaOH、1.5 mL環(huán)氧氯丙烷，用塑料薄膜將瓶口封住，在40℃的恒溫水浴搖床中振搖活化2 h，然后將活化的Sepharose 4B轉(zhuǎn)移到玻璃燒結(jié)漏斗中，抽去活化劑，用100 mL蒸餾水洗滌，少量多次，抽干，再將Sepharose 4B轉(zhuǎn)移到100ml干凈的三角瓶中備用。稱(chēng)取100 mg雞卵粘蛋白用10 mL 0.2 mol/L pH9.5 Na2CO3緩沖液充分溶解，取0.1 mL稀釋30倍后測(cè)定A280 nm，計(jì)算溶液中雞卵粘蛋白的濃度，然后將溶解好的蛋白溶液加入到100 mL三角瓶中與活化的Sepharose 4混勻，在40℃恒溫水浴中，以130～140 r/min振搖偶聯(lián)22 h左右后，終止偶聯(lián)。將已經(jīng)偶聯(lián)好的Sepharose 4B轉(zhuǎn)移到玻璃燒結(jié)漏斗中，用100 mL 0.5 mol/L NaCl溶液洗去未被偶聯(lián)的蛋白，收集的濾液，量取體積并在紫外分光光度計(jì)上測(cè)定未被偶聯(lián)的雞卵粘蛋白含量，以計(jì)算偶聯(lián)蛋白量；然后用100 mL蒸餾洗，50 mL親和柱洗脫液淋洗，蒸餾水洗至中性(大約pH6.0)。然后將親和介質(zhì)轉(zhuǎn)移到小燒杯內(nèi)，用親和柱平衡液浸泡15 min脫氣，裝柱。取一支層析柱( 10×150 mm)柱內(nèi)先裝入1/4體積的親和柱平衡液，將脫氣的親和吸附劑輕輕攪勻，一次裝入柱內(nèi)，待其自然沉降，調(diào)好流速(2～4 mL/10 min)。用親和柱平衡液平衡，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定A280 mm值小于0.02即可。將已經(jīng)激活的胰蛋白酶提取液用5 mol/L NaOH精確調(diào)至pH8.0，過(guò)濾，取濾液20～50 mL上柱(通過(guò)親和介質(zhì)的偶聯(lián)量和胰蛋白酶粗提液的比活性，計(jì)算出上樣所需體積=)，上樣體積(mL)=[介質(zhì)偶聯(lián)mg數(shù)×0.86×1.3×104(u/mg)] ×1.5 /胰蛋白酶粗提液濃度(mg/mL)×比活(u/mg)上完樣以后，再以0.1 mol/L，pH8.0 Tris-HCl 緩沖液(內(nèi)含0.5 mol/L KCl，50 mmol/L CaCl2)平衡，洗去未被吸附的雜蛋白，直至流出的平衡液經(jīng)蛋白質(zhì)核酸檢測(cè)儀繪出的基線(xiàn)穩(wěn)定。上柱后用親和柱平衡液平衡，待流出液在經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定A280 nm值小于0.02以后，改用親和柱洗脫液(0.1 mol/L pH2.5甲酸，0.5 mol/L KCl溶液)洗脫，收集第Ⅱ洗脫峰，即為純化后的豬胰蛋白酶[10-11]。

2.1.4 純胰蛋白酶活性和雞卵粘蛋白抑制活性測(cè)定

測(cè)定雞卵粘蛋白濃度時(shí)，先將透析液稀釋30～50倍，然后用重蒸水作空白調(diào)零，在λ=280 nm時(shí)，測(cè)OD值(如測(cè)得的OD值大于1，接著再稀釋)，然后計(jì)算卵粘蛋白的濃度(雞卵粘蛋白濃度(mg/mL) =A280 nm×稀釋倍數(shù)/0.413計(jì)算雞卵粘蛋白的含量)。

測(cè)定雞卵粘蛋白抑制活性時(shí)，在λ=253 nm時(shí)，將0.05 mol/L pH7.8 Tris-HCl緩沖液、標(biāo)準(zhǔn)胰蛋白酶和雞卵粘蛋白直接加入比色杯中，混合2 min后(使胰蛋白酶和卵粘蛋白充分混合)；再加入2 mol/L BAEE底物，然后混合記時(shí)測(cè)定，30 s讀一次共5次，以0.05 mol/L pH7.8 Tris-HCl緩沖液、2 mol/L BAEE底物、標(biāo)準(zhǔn)胰蛋白酶作無(wú)空白對(duì)照，測(cè)定透析液卵粘蛋白的抑制活性。雞卵粘蛋白抑制活性單位(胰酶BAEE)=(未加抑制劑的胰蛋白酶△A253 nm/min-加入抑制劑胰蛋白酶△A253 nm/min)/ 0.001，雞卵粘蛋白抑制比活性單位(胰酶BAEE/mg)=[抑制劑活性單位(胰酶BAEE)×抑制劑的稀釋倍數(shù)]/ [抑制劑的濃度(mg/mL)×加入抑制劑的體積][7,11]。

測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)胰蛋白酶活性時(shí)，先計(jì)算所需標(biāo)準(zhǔn)胰蛋白酶的體積，在λ=280 nm時(shí)，用重蒸水調(diào)零，測(cè)標(biāo)準(zhǔn)胰蛋白酶的濃度(胰蛋白酶濃度=A280 nm/1.35)，然后用5～10 μg(加入胰酶的量理論值)除濃度即為所得的體積數(shù)。在λ=253 nm時(shí)，將0.1 mol/L Tris-HCl pH8.0緩沖液和2 mmol/L BAEE底物直接加入比色杯，然后加標(biāo)準(zhǔn)胰蛋白酶(用蓋子或硫酸紙蓋上，上下翻轉(zhuǎn)2或3次，立即計(jì)時(shí))30 s讀一次共5次，以0.1 mol/L Tris-HCl pH8.0緩沖液和2 mmol/L BAEE底物作無(wú)空白對(duì)照，測(cè)定純胰蛋白酶的活性。胰蛋白酶活性單位(BAEE)=(△A253 nm/min)/0.001，胰蛋白酶比活性單位(BAEE/mg)=(胰酶活性U×稀釋倍數(shù))/ 胰酶濃度(mg/mL)×加入酶體積[8]。注意：測(cè)定時(shí)，雞卵粘蛋白的抑制活性的光吸收遞增值在△A253 nm/min (0.05±0.01)最適宜，測(cè)定胰蛋白酶反應(yīng)的時(shí)間為5～7 min，測(cè)定雞卵粘蛋白的抑制活性是胰蛋白酶的2～3倍時(shí)間或許更長(zhǎng)。

在綜合性實(shí)驗(yàn)-親和層析法純化胰蛋白酶中，以蛋白質(zhì)化學(xué)、酶學(xué)的性質(zhì)等內(nèi)容組織教學(xué)，每一個(gè)實(shí)驗(yàn)的終產(chǎn)物都是下一個(gè)實(shí)驗(yàn)的材料，環(huán)環(huán)相扣，既很好的將不同單元的實(shí)驗(yàn)操作融合在了一起，又體現(xiàn)了綜合性實(shí)驗(yàn)強(qiáng)調(diào)突出內(nèi)容復(fù)合性、方法多元性、手段多樣性的要求[12]，從而實(shí)現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容、研究方法、手段的綜合[13]。

2.2 綜合性實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)

作為一個(gè)綜合性實(shí)驗(yàn)，親和層析法分離純化豬胰蛋白酶主要圍繞著蛋白質(zhì)化學(xué)、酶學(xué)的性質(zhì)等內(nèi)容組織教學(xué)，選擇有代表性的實(shí)驗(yàn)材料，根據(jù)分析的目標(biāo)融入光譜、色譜、電泳等技術(shù)。在實(shí)驗(yàn)技術(shù)上，既要考慮內(nèi)容和方法具有相互關(guān)聯(lián)和完整性，又要考慮每一個(gè)單元側(cè)重點(diǎn)和相對(duì)獨(dú)立性。在實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的教學(xué)安排過(guò)程中，嚴(yán)格按照循序漸進(jìn)的教學(xué)原則，按照雞卵粘蛋白制備-粗胰蛋白酶制備及標(biāo)準(zhǔn)胰蛋白酶活性測(cè)定-親和層析純化胰蛋白酶的順序合理安排教學(xué)內(nèi)容，從而使教學(xué)過(guò)程符合認(rèn)知科學(xué)的理論與實(shí)踐[13]。

在雞卵粘蛋白制備模塊中，不僅融入了有機(jī)酸、有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)的基本技術(shù)，而且融入了柱層析技術(shù)分離純化蛋白質(zhì)的方法，更為重要的是將紫外吸收分光光度計(jì)測(cè)定蛋白質(zhì)含量巧妙的引入實(shí)驗(yàn)中。在雞卵粘蛋白粗提的操作步驟中，除了給定濃度、pH的三氯乙酸溶液以及丙酮外，啟發(fā)學(xué)生通過(guò)查閱文獻(xiàn)找出其他可以沉淀蛋白質(zhì)的有機(jī)酸或有機(jī)溶劑，并親自通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，同時(shí)指出選擇10% pH1.15的三氯乙酸進(jìn)行蛋白質(zhì)沉淀的原理，如果沉淀后不調(diào)節(jié)pH至1.15，最后能否提取出雞卵粘蛋白，同時(shí)思考將丙酮換成其他溶劑是否可以達(dá)到同樣的目的。在雞卵粘蛋白分離純化的步驟中，使用了Sephadex G-25和 DEAE-32兩種層析介質(zhì)，為提高教學(xué)效果，使學(xué)生理解并掌握柱層析的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)，課前讓學(xué)生提前預(yù)習(xí)，課上提問(wèn)兩種介質(zhì)層析的原理、操作要點(diǎn)，以及層析過(guò)程中可能出現(xiàn)的層析峰，如何判斷層析峰的開(kāi)始與結(jié)束，什么時(shí)候開(kāi)始流出的層析液中含有目標(biāo)蛋白等。通過(guò)這種方式，將三氯乙酸提取雞卵粘蛋白、丙酮沉降法分級(jí)分離、Sephadex G-25柱層析分離以及DEAE-32陰離子交換柱層析分離雞卵粘蛋白的方法有機(jī)串聯(lián)起來(lái)，蛋白質(zhì)的提取、分離、純化不再是一個(gè)個(gè)單元化實(shí)驗(yàn)操作，而是一個(gè)具體的可操作的完整的有機(jī)體。

在粗胰蛋白酶制備及標(biāo)準(zhǔn)胰蛋白酶活性測(cè)定模塊中，不僅巧妙地融入酶原激活概念和方法，進(jìn)一步加深了學(xué)生對(duì)酶和酶原這兩個(gè)概念的理解，而且引入了酶抑制活性測(cè)定的概念和方法，從而將該模塊與雞卵粘蛋白制備模塊有機(jī)結(jié)合起來(lái)。授課時(shí)，通過(guò)提問(wèn)和釋疑的方式，引導(dǎo)學(xué)生深入理解和區(qū)別酶活性和酶抑制活性的概念及其應(yīng)用。如在豬胰蛋白酶原粗提過(guò)程中，使用的乙酸酸化水的作用是什么，它與三氯乙酸、丙酮在雞卵粘蛋白制備中的作用有何異同？在靜置提取過(guò)程中，pH值為什么要始終保持在2.5～3.0左右？在胰蛋白酶原激活過(guò)程中，為什么要加入CaCl2和固體胰蛋白酶，不加入酶原能否被激活？

在親和層析純化胰蛋白酶模塊中， 親和層析介質(zhì)的制備方法、親和層析分離純化胰蛋白酶的技術(shù)流程、圖譜分析技術(shù)以及純化胰蛋白酶活性指標(biāo)的測(cè)定與計(jì)算方法是考核的主要能力指標(biāo)。并通過(guò)上一模塊的產(chǎn)物豬胰蛋白酶粗提取液與本模塊進(jìn)行銜接，既保證了實(shí)驗(yàn)的連續(xù)性，又是對(duì)上一模塊實(shí)驗(yàn)在內(nèi)容和技術(shù)上的升華。豬胰蛋白酶粗提取液中既含有胰蛋白酶，又含有非胰蛋白酶，采用何種方式可以將豬胰蛋白酶分離出來(lái)呢？第一模塊中用到的三氯乙酸沉淀、丙酮沉降法分級(jí)分離、Sephadex G-25柱層析分離以及DEAE-32陰離子交換柱層析分離蛋白質(zhì)的方法是否依然使用呢？讓學(xué)社帶著這些問(wèn)題去查閱文獻(xiàn)，對(duì)比分析，尋找合適的分離出豬胰蛋白酶的方法，順勢(shì)引入Sepharose 4B親和層析的技術(shù)與方法。胰蛋白酶分離提純后，其活性指標(biāo)測(cè)定和計(jì)算方法的學(xué)習(xí)也就順理成章了。

在時(shí)間安排上，基本上按照雞卵粘蛋白的制備、豬胰蛋白酶粗提液的制備以及親和層析純化豬胰蛋白酶的順序安排實(shí)驗(yàn)，又不完全拘泥于上述實(shí)驗(yàn)各個(gè)步驟，如在豬胰蛋白酶粗提液的制備過(guò)程中穿插了Sepharose 4B親和介質(zhì)制備的內(nèi)容，以達(dá)到充分利用各個(gè)步驟中的等待時(shí)間，提高實(shí)驗(yàn)效率的目的?？傮w上該綜合性實(shí)驗(yàn)需要5 d，累計(jì)授課40學(xué)時(shí)，具體安排如下：第一天主要進(jìn)行玻璃器皿的清洗、試劑配制、儀器設(shè)備的安裝調(diào)試以及三氯乙酸提取雞卵粘蛋白。第二天主要進(jìn)行以丙酮沉降法分級(jí)分離、ephadex G-25柱層析分離以及DEAE-32陰離子交換柱層析分離等為主要內(nèi)容雞卵粘蛋白的分離純化工作。第三天雞卵粘蛋白純品的獲得、雞卵粘蛋白含量及其抑制活性測(cè)定等內(nèi)容。第四天主要進(jìn)行豬胰蛋白酶原的提取、胰蛋白酶原的激活、胰蛋白酶的活性濃度及活性測(cè)定以及Sepharose 4B親和介質(zhì)的制備等內(nèi)容。第五天主要進(jìn)行親和層析柱的安裝與平衡、豬胰蛋白酶粗提液的上樣、平衡與洗脫以及純胰蛋白酶活性和雞卵粘蛋白抑制活性的測(cè)定等內(nèi)容。

可見(jiàn)，模塊化的實(shí)驗(yàn)設(shè)置體系和循序漸進(jìn)的教學(xué)過(guò)程安排，使學(xué)生在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中變被動(dòng)學(xué)習(xí)為主動(dòng)學(xué)習(xí)，有利于逐步提高發(fā)現(xiàn)問(wèn)題、分析問(wèn)題和解決問(wèn)題的能力, 增強(qiáng)對(duì)困難和失敗的承受力, 并增進(jìn)團(tuán)隊(duì)精神和協(xié)作能力[14]。

2.3 綜合性實(shí)驗(yàn)的考核

由于過(guò)去過(guò)度依賴(lài)實(shí)驗(yàn)報(bào)告的優(yōu)劣作為考評(píng)指標(biāo)，導(dǎo)致學(xué)生不注重實(shí)驗(yàn)過(guò)程，片面追求實(shí)驗(yàn)結(jié)果的正確性、實(shí)驗(yàn)報(bào)告的篇幅和整潔程度，嚴(yán)重制約了對(duì)學(xué)生綜合素質(zhì)的培養(yǎng)[15]。為了提高學(xué)生實(shí)驗(yàn)過(guò)程中獨(dú)立思考的能力和發(fā)現(xiàn)問(wèn)題、分析問(wèn)題、解決問(wèn)題的能力，實(shí)行實(shí)驗(yàn)座談、實(shí)驗(yàn)報(bào)告、實(shí)驗(yàn)考試綜合評(píng)定學(xué)生的考核制度。該考核制度加大了對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程的考核力度，激發(fā)了學(xué)生主觀能動(dòng)性，符合江月玲[15]以及戰(zhàn)春梅等[16]等構(gòu)建的綜合性實(shí)驗(yàn)教學(xué)質(zhì)量評(píng)價(jià)體系思想，有利于培養(yǎng)和提高學(xué)生的實(shí)踐能力和創(chuàng)新能力。

由于綜合性實(shí)驗(yàn)周期相對(duì)較長(zhǎng)，即便在授課過(guò)程中盡可能統(tǒng)籌安排，也難免會(huì)有較長(zhǎng)的等待時(shí)間，為充分利用相對(duì)閑散的時(shí)間，專(zhuān)門(mén)設(shè)置了實(shí)驗(yàn)座談環(huán)節(jié)，座談?dòng)山處熤鞒?，各?shí)驗(yàn)小組逐一闡述本組實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的問(wèn)題，并分析成功或失敗的原因，其他組的同學(xué)進(jìn)行點(diǎn)評(píng)，點(diǎn)評(píng)情況由老師測(cè)評(píng)并計(jì)入平時(shí)成績(jī)。通過(guò)這樣的討論，使學(xué)生對(duì)各實(shí)驗(yàn)操作步驟及其原理有了更進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)，有利于學(xué)生在掌握實(shí)驗(yàn)技能的同時(shí)，舉一反三，能夠?qū)W(xué)到的方法和技術(shù)靈活運(yùn)用到其他實(shí)驗(yàn)材料上。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，要求每位同學(xué)必須同時(shí)完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告的撰寫(xiě)，包括結(jié)果計(jì)算、分析和討論，嚴(yán)禁課后補(bǔ)寫(xiě)實(shí)驗(yàn)報(bào)告。設(shè)置實(shí)驗(yàn)課程考試環(huán)節(jié)，考試方式閉卷，內(nèi)容包括試劑配制及其在實(shí)驗(yàn)中作用、實(shí)驗(yàn)原理、實(shí)驗(yàn)操作、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析等，全部為授課過(guò)程中涉及到的內(nèi)容。上述三種方式的綜合得分即為該綜合性實(shí)驗(yàn)的最后得分，即實(shí)驗(yàn)成績(jī)=實(shí)驗(yàn)座談成績(jī)×35%+實(shí)驗(yàn)報(bào)告成績(jī)×35%+考試成績(jī)×30%。

3 結(jié) 語(yǔ)

親和層析法純化豬胰蛋白酶實(shí)際上將蛋白質(zhì)分離純化、蛋白質(zhì)含量測(cè)定以及酶活性測(cè)定等3個(gè)單元的實(shí)驗(yàn)有機(jī)融合在一起，形成了一個(gè)綜合性和設(shè)計(jì)性于一體的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，旨在培養(yǎng)和提高學(xué)生綜合利用生物化學(xué)知識(shí)的能力與素質(zhì)。經(jīng)過(guò)多年的實(shí)踐，學(xué)生們普遍反映，通過(guò)該實(shí)驗(yàn)不僅學(xué)到了多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)和方法，而且獲得了綜合運(yùn)用所學(xué)知識(shí)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的思維。此外，該綜合性實(shí)驗(yàn)的實(shí)踐與探索為生物化學(xué)其他(如糖類(lèi)、脂類(lèi)、核酸)綜合性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目設(shè)計(jì)提供了有益借鑒。

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Design and Implementation of a Comprehensive Experiment of Biological Chemistry — Separated and Purified Porcine Trypsin Using Affinity Chromatography for Example

HUANGTiran1,2,LIUYueping1,ZHANGGuoqing1,WANGgWenping1,ZHANGJing1

(1. College of Biological Sciences and Engineering, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206, China; 2. Key Laboratory of Urban Agriculture (North) of Ministry of Agriculture, Beijing 102206, China)

Biochemistry experiment is an important professional basic course in the field of life science. The experimental technology contained in the biochemistry experiment played a vital role in training students’ basic skills, cultivating practical ability and innovation ability. Around the protein chemistry and enzymatic properties in the biochemistry, the experiments of chicken ovalin preparation, porcine trypsin preparation, porcine trypsin purification, and the determination of purified trypsin activity and chicken ovalin inhibitory activity were re-integrated. Therefore a comprehensive experiment including protein separation and purification, determination of protein content and enzyme activity was designed. The spectroscopy and chromatography were also used in the comprehensive experiment. Finally comprehensive designing content in the experiment was studied. The design can provide the reference for the research and development of comprehensive and designing experiments in the biochemistry experiment teaching.

biochemistry; comprehensive experiment; chromatograph; separated and purified

2016-05-20

北京農(nóng)學(xué)院實(shí)驗(yàn)技術(shù)體系研發(fā)基金項(xiàng)目(SXST201606)，北京農(nóng)學(xué)院學(xué)位與研究生教育改革與發(fā)展項(xiàng)目(2016YJS080)

黃體冉(1983-)，男，山東鄆城人，碩士，實(shí)驗(yàn)師，研究方向：實(shí)驗(yàn)教學(xué)與管理、植物分類(lèi)。

Q 503

A

1006-7167(2017)04-0179-05

Tel.: 010-80799294; E-huangtr151@bua.edu.cn