五齡期家蠶幼蟲血淋巴酚氧化酶活性研究

楊大平

摘要 以家蠶為試驗材料，調(diào)查了5齡幼蟲從起蠶到熟蠶血淋巴酚氧化酶的活性變化情況。結(jié)果表明，酚氧化酶活性呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，其中在5齡起蠶和熟蠶時酚氧化酶活性較低，而在盛食期（5齡第5天）活性最高。

關(guān)鍵詞 5齡家蠶；血淋巴；酚氧化酶活性

中圖分類號 S881.24 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2017）08-0240-01

昆蟲酚氧化酶（phenol oxidase，PO）一般以無活性的酚氧化酶原（pro-phenoloxidase，PPO）形式存在于血淋巴中，通過特異的絲氨酸蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)，使其轉(zhuǎn)化為有活性的酚氧化酶[1-2]。它能夠催化單酚為O-聯(lián)苯，再催化O-聯(lián)苯轉(zhuǎn)變?yōu)轷愇镔|(zhì)，參與黑色素的形成[3]。由酚氧化酶參與的黑色素形成是昆蟲體液免疫防御反應(yīng)的重要生化過程[4]。本試驗以家蠶為研究對象，測定了整個五齡期家蠶幼蟲血淋巴酚氧化酶活性，為深入了解家蠶血淋巴酚氧化酶的變化規(guī)律提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試家蠶品種為菁松×皓月，人工孵化，飼育溫度為25.5～28.0 ℃，濕度為60%～70%，用桑葉飼養(yǎng)。

1.2 試驗設(shè)計

取5齡起蠶至熟蠶的血淋巴，血淋巴收集到預(yù)先加有苯基硫脲的5 mL離心管中。每次取樣均設(shè)3次重復(fù)，每個重復(fù)取5頭蠶，樣品收集后置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 酶液的制備

將家蠶血淋巴轉(zhuǎn)移到含有0.5 mL二甲胂酸鈉（CAC）緩沖液（10 mmol/L二甲胂酸鈉，20 mmol/L氯化鈣，pH值6.5）的離心管中，于4 ℃條件下以5 000 r/min離心10 min收集上清，即為待測酶液。

1.4 酶活性測定

參照Ashida等[5]的方法，量取50 μL待測酶液，加入3 mL PBS緩沖液（pH=6.0）與0.01 mol/L的L-3，4-二羥基苯丙氨酸（L-DOPA），混合均勻，用Thermo Scientific BioMate 3S 紫外可見光分光光度計（美國），在460 nm波長下，測定1 min內(nèi)吸光度的增大值，6次重復(fù)。酶活力單位用U表示，1U=A460/50 μL/min。

2 結(jié)果與分析

家蠶五齡期不同發(fā)育階段血淋巴PO的活性變化情況如圖1所示。從圖中可以看出，家蠶5齡幼蟲從起蠶到熟蠶，PO的活力表現(xiàn)為先升后降的變化趨勢。5齡起蠶（0 d）PO酶活力最低，第1天和第2天PO活力維持在3.5 U左右，從第3天酶活力開始逐漸升高，在第5天酶活力最高（9.88 U），隨后酶活力逐漸減弱，到5齡末期熟蠶時急劇下降至1.59 U，略高于起蠶。

3 結(jié)論與討論

酚氧化酶廣泛存在于昆蟲體內(nèi)，在其生長發(fā)育及免疫學(xué)功能方面都發(fā)揮了重要作用[4]。血淋巴是家蠶生長發(fā)育不可缺少的重要組織之一，研究血淋巴PO酶活性變化規(guī)律不僅對其生理機能有重要的意義，也為深入研究PO提供了理論基礎(chǔ)。

本研究結(jié)果顯示，PO酶活力在家蠶的整個五齡期呈先升高后降低的變化趨勢，其活性變化規(guī)律與該階段家蠶的食量及生理進程趨于一致。研究結(jié)果與陳文柱等[6]的研究結(jié)果基本一致，5齡家蠶一般在第4～5天達到盛食期，PO活性即在第4天和第5天相對較高；而在起蠶和熟蠶時PO活性相對較低，這與家蠶生理學(xué)研究結(jié)果保持一致。家蠶生理學(xué)研究結(jié)果表明，在每個齡期的中盛食期家蠶抗性較強，而在起蠶及眠期時抗性比較弱[7-8]。

4 參考文獻

[1] KAN H，KIM C，KWON H，et al.Molecular control of phenoloxidase-induced melanin synthesis in an insect[J].The Journal of Biological Che-mistry，2008，283（37）：25316-25323.

[2] 時超美.昆蟲酚氧化酶原活化及其在免疫中的作用[J].昆蟲知識，2000，37（5）：310-314.

[3] 龐秋香，龐書香，趙博生.酚氧化酶及其酶原的生化特征與分子生物學(xué)研究進展[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展，2008，8（1）：196-200.

[4] 劉麗萍，奚耕思，王芳，等.昆蟲酚氧化酶的研究進展[J].生命科學(xué)，2013，25（4）：383-387.

[5] ASHIDA M.Purification and characterization of prophenoloxidase from the hemolymph of the silkworm Bombyx morí[J].Archives of Biochemistry and Biophysics，1971，144（2）：749-762.

[6] 陳文柱，李兵，貢成良，等.酚氧化酶在家蠶血淋巴中的活力分布及影響因素的研究[J].江蘇蠶業(yè)，2005，27（2）：12-15.

[7] 馮麗春，沈衛(wèi)德.蠶體解剖生理學(xué)[M].北京：高等教育出版社，2015：77-81.

[8] 劉麗萍，奚耕思，王芳，等.昆蟲酚氧化酶的研究進展[J].生命科學(xué)，2013（4）：383-387.