青稞細(xì)菌性病害的病原菌分離與鑒定

姚小波++王文峰++王翠玲

摘要 從扎朗縣扎其鄉(xiāng)采集青稞細(xì)菌性病害典型病株，通過菌物的分離與純化，按照柯赫氏法則進(jìn)行致病性測定及菌株鑒定。結(jié)果表明，該菌物為黃單孢桿菌屬細(xì)菌。

關(guān)鍵詞 青稞；細(xì)菌性病害；病原菌；分離；鑒定

中圖分類號 S432.4+2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-5739（2017）08-0095-02

Isolation and Identification of Highland Barley Bacterial Pathogens

YAO Xiao-bo WANG Wen-feng WANG Cui-ling * ZHA Luo LI Yang LEI Xue-ping LIU He-chun ZHUO Ga

（Plant Protection Research Department，Tibet Academy of Agriculture and Animal Husbandry Sciences，Lhasa Tibet 850032）

Abstract The typical pathogens of highland barley bacterial disease were collected from Zhaqi Town of Zhalang County，The pathogens were isolated and purified，by Koch′s Rule pathogenicity determination and strain identification were made.The results showed that the pathogen was identified as a microorganism of Xanthomonas genus.

Key words highland barley；bacterial disease；pathogens；isolation；identification

青稞（Hordeumvulgare L.var.nudum Hook.f.）俗稱裸大麥，又稱元麥，屬于禾本科植物[1]。青稞主要分布在海拔4 200～4 500 m的青藏高寒地區(qū)[2]，例如西藏、青海、云南的迪慶、甘肅的甘南州，以及四川的甘孜州和阿壩州等。青稞是藏區(qū)農(nóng)牧民不可替代的主糧，也是藏區(qū)主要飼料和釀造業(yè)等農(nóng)產(chǎn)品加工業(yè)的重要原料，西藏青稞播種面積達(dá)13.3萬hm2左右。從扎朗縣扎其鄉(xiāng)采集一株典型的細(xì)菌性病害病株，葉片黃化，呈暗綠色水漬狀或油漬狀小斑，并有黃色顆粒狀細(xì)菌溢液，根及莖基部出現(xiàn)褐腐，對其進(jìn)行分離、致病性測定和菌物鑒定?，F(xiàn)將鑒定結(jié)果報道如下，以為青稞病害的防治提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 青稞細(xì)菌病害標(biāo)本的采集。2016年7月，在山南扎朗縣扎其鄉(xiāng)采集到本研究的供試樣本，所采樣本青稞品種為藏青2000。

1.1.2 培養(yǎng)基制備。試驗(yàn)選用PDA培養(yǎng)基[3]。培養(yǎng)基配方為馬鈴薯200 g、葡萄糖10～20 g、瓊膠17～20 g、水1 000 mL。將洗凈后去皮的馬鈴薯切碎，加水1 000 mL煮沸30 min，用紗布濾去馬鈴薯，加水補(bǔ)足1 000 mL。調(diào)pH值為7.4～7.6。加入糖和瓊膠，加熱使瓊膠完全溶化后，趁熱用紗布過濾，分裝試管。加棉花塞，用高壓滅菌鍋滅菌20～30 min。將培養(yǎng)基放于28 ℃的恒溫箱培養(yǎng)72 h。觀察有無微生物的生長，對無菌的培養(yǎng)基，保存在2～4 ℃冰箱內(nèi)待用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)病部位微生物的分離。剪取病、健交界處2～3 mm長的病組織，用70%乙醇消毒30 s，用0.1%升汞消毒3 min，用無菌水洗3次，最后將病組織直接移至馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，將接菌的PDA平板倒置于20～25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，待菌落長出后挑取邊緣菌物轉(zhuǎn)接到新的PDA平板上，在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行純化培養(yǎng)[1-3]。在無菌條件下用接種環(huán)挑取菌物，先在平板培養(yǎng)基的一邊作第1次平行劃線3～4條。轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿約70°，并燒掉接種環(huán)上的剩余物，待冷卻后通過第1次劃線部分作第2次平行劃線[4-5]。用同樣的方法通過第2次劃線部分作第3次劃線和通過第3次平行劃線部分作第4次平行劃線。劃線完畢后，蓋上培養(yǎng)皿蓋，倒置于恒溫箱培養(yǎng)[6]。

1.2.2 菌物致病性鑒定。采用柯赫氏法則進(jìn)行致病性鑒定[4]。將分離的菌物，經(jīng)肉汁胨瓊膠培養(yǎng)基培養(yǎng)2～3 d，然后用接種針從瓊膠斜面上挑取少許細(xì)菌，采用穿刺法接種到盆栽青稞藏青2000的葉片上，通過套塑料袋進(jìn)行保溫、保濕觀察發(fā)病癥狀。

1.2.3 菌物的形態(tài)學(xué)鑒定。①革蘭氏染色反應(yīng)。用接種環(huán)取菌物涂于載玻片上，把涂片置于火焰上部的熱氣層中烘烤。用染色夾子夾住涂片，在火焰的最熱部分連續(xù)通過3次固定。將結(jié)晶紫染液加于涂膜上，染色（初染）1 min。水洗后加蘆戈氏碘液處理（媒染）1 min。水洗后用95%酒精脫色，脫色時頻頻搖動玻片[5]，直至流下的液體無色為止（需30 s左右）。水洗后加石炭酸復(fù)紅稀釋液染色（復(fù)染）30 s。水洗，用濾紙輕輕吸干，待標(biāo)本充分干燥后進(jìn)行鏡檢[5]。②鞭毛染色反應(yīng)。將玻片放入洗衣粉過濾液中煮沸20 min，冷卻自來水沖洗晾干，濃洗液中浸泡5～6 d，自來水沖去殘酸，瀝干水分，放入95%乙醇中脫水。加1滴GENMED清理液（Reagent A）在載玻片的一端，用無菌接種環(huán)輕輕點(diǎn)觸分離的菌落再輕輕點(diǎn)觸在載玻片一端的GENMED清理液（Reagent A）傾斜載玻片，使含有細(xì)菌的GENMED清理液（ReagentA）順勢流向另一端[6]。室溫下晾干載玻片加入GENMED染色液（Reagent B），室溫下處理5 min，避免光照小心移去GENMED染色液（Reagent B），加上GENMED清理液（ReagentA），小心移去GENMED清理液（Reagent A），重復(fù)上述試驗(yàn)步驟3～5次，直至染色液洗去，晾干載玻片于油鏡下觀察。

1.3 菌物的鑒定

依據(jù)《柏杰氏細(xì)菌鑒定手冊》，參照植物病原細(xì)菌有關(guān)的5個屬的主要性狀進(jìn)行鑒定[5-6]。結(jié)果如表1所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌物的培養(yǎng)性狀

通過平板劃線分離法，分離菌物呈淡黃色、透明、表面光滑（圖1）。

2.2 菌物的致病性鑒定

經(jīng)1周左右保溫、保濕培養(yǎng)，得到的癥狀為葉片黃化，呈暗綠色水漬狀或油漬狀小斑，與田間癥狀相似，分離的菌物為致病菌。

2.3 病原物的形態(tài)學(xué)鑒定

通過革蘭氏染色，菌物呈淡紅色，陰性菌，短桿狀，多單生，少雙生。經(jīng)過鞭毛染色菌體極生一根鞭毛，呈不透明紫藍(lán)色，鞭毛也呈不透明紫藍(lán)色（圖3），則鑒定菌物為黃單孢桿菌屬細(xì)菌。

3 結(jié)論與討論

青稞的病害組織在分離培養(yǎng)過程中分離出其他2種菌物。但是經(jīng)過多次回接后發(fā)現(xiàn)并沒有形成與病害一致的癥狀，無致病性，并不是青稞細(xì)菌病害的病原菌。這有可能是在分離純化過程中病原菌被雜菌污染造成的，也可能是腐生菌。目前對青稞細(xì)菌病害的研究較少，通過分離鑒定青稞細(xì)菌性病害的致病菌物，為病害的下一步診斷提供了理論依據(jù)，也為今后病害防治提供了技術(shù)保障。

4 參考文獻(xiàn)

[1] 謝宗萬.本草綱目藥物彩色圖鑒[M].1版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2001.

[2] 馬得泉，洛桑更堆.西藏栽培大麥分類研究進(jìn)展[J].西藏科技，1997（1）：2-8.

[3] 方中達(dá).植病研究方法[M].北京：農(nóng)業(yè)出版社，1979：116-117.

[4] 王海蕓.青稞主要病害及防治技術(shù)[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)，2012（7）：29.

[5] 姚小波.青稞細(xì)菌性條斑病的診斷技術(shù)研究[J].西藏農(nóng)業(yè)科技，2015（1）：37-41.

[6] 微生物染色技術(shù)[EB/OL].[2017-02-04].https：//wenku.baidu.com/view/91b940e281c758f5f61f6771.html.