不同消毒方法及濃度對冰菜種子萌發(fā)與幼苗生長的影響

謝翔+頓子云+劉瑞+羅巍+段儒東+榮海燕

摘 要：試驗研究升汞和NaClO等2種消毒劑對冰菜種子萌發(fā)與幼苗生長的影響。初步預(yù)試驗結(jié)果表明，NaClO處理組萌發(fā)率優(yōu)于升汞處理組。設(shè)置不同濃度NaClO處理組進(jìn)行研究，結(jié)果表明，不同消毒劑處理組，通過對種子表皮的侵蝕，影響種子萌發(fā)過程中負(fù)責(zé)分解內(nèi)含物的α-淀粉酶、β-淀粉酶及蛋白酶活性，進(jìn)而影響種子的萌發(fā)與幼苗的生長，其中，6% NaClO處理組對冰菜種子的萌發(fā)率及幼苗生長效果最佳。

關(guān)鍵詞：消毒劑；冰菜；種子

中圖分類號：S636.9 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2017.06.023

Abstract： To study the effects of different disinfection methods on seed germination and seedling growth of ice plant，HgCl2 and NaClO were selected in the experiment. The results showed that NaClO treatment group was better than HgCl2 treatment group. The experiment seted NaClO treatment groups of different concentrations. It was found that different disinfection methods affected the enzymatic activity during seed germination by eroding seed epidermis. The experimental results showed that seeding germination and seedling growth were best in the 6% NaClO treatment group.

Key words： ：disinfection；ice plant；seed

冰菜（Mesembryanthemum crystallinum L.），又名冰葉日中花，屬番杏科日中花屬1年生或2年生草本植物，原產(chǎn)于非洲西奈、南歐地區(qū)。冰菜是兼性CAM植物[1]，具有耐鹽堿、耐旱性的特征[2]，其葉表和莖部覆蓋著大量凸起的鹽囊泡細(xì)胞，富含礦物鹽、糖醇、果酸、氨基酸、甜菜堿、類黃酮等，具有極高的營養(yǎng)價值，由于其對治療糖尿病有幫助作用[1]，所以越來越受到亞洲地區(qū)植物工廠的重視。

冰菜作為一種新型蔬菜，在國內(nèi)栽植情況處于起步階段，育種研究尚未見報道?，F(xiàn)代育種大多進(jìn)行轉(zhuǎn)基因技術(shù)育種和分子標(biāo)記輔助育種，而無菌苗的篩選和培育是關(guān)系到試驗?zāi)芊癯晒Φ年P(guān)鍵環(huán)節(jié)，無菌苗通常是由種子獲得，因此，種子消毒顯得尤為重要[3]。

消毒劑的選擇對于組織培養(yǎng)過程中外植體的滅菌至關(guān)重要。不同種類的消毒劑及不同濃度消毒劑對于植物體材料存在不同的生理影響，如汞會抑制IAA對細(xì)胞壁的影響[4]和幼苗生長[5]，NaClO會影響植物對GA3的反應(yīng)和幼苗生長[6]，還可能促進(jìn)體細(xì)胞胚胎的發(fā)生 [7]。國內(nèi)在消毒劑對種子理化特性的影響研究中，種子萌發(fā)特性的研究較為多見，而以消毒劑為單一因素，對種子內(nèi)可溶性物質(zhì)滲漏以及種子萌發(fā)過程中分解貯藏物的酶的影響尚未見報道。孫成虎等[8]在消毒劑對甘藍(lán)種子的研究中，對于種子萌發(fā)過程的生理影響進(jìn)行了探討，但其討論的基礎(chǔ)建立在鏈格孢菌與消毒劑對甘藍(lán)種子的共同影響上；王首鋒等[9]與徐宏英[10]分別使用不同消毒劑對黃瓜種子與番茄種子的影響進(jìn)行了探討，但僅探討消毒劑對子葉離體培養(yǎng)過程中的生理影響。在國內(nèi)種子萌發(fā)試驗中，培養(yǎng)基質(zhì)多是土壤或濕濾紙，二者均有缺陷，其中，土壤不能充分排除外界因素，如土壤中菌物等對于試驗的干擾；濕濾紙在萌發(fā)過程中不能充分模擬萌發(fā)條件。常用消毒劑為升汞與NaClO。

本試驗在無菌條件下，用MS培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，比較了升汞與NaClO對種子理化特性的影響，并進(jìn)一步討論了不同濃度NaClO對冰菜種子理化特性的影響，旨在為后期育種與生產(chǎn)工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材 料

供試冰菜種子購自河北華煜種子有限公司。

1.2 方 法

挑選顆粒飽滿、無瑕疵的灰褐色種子，先用清水沖洗，去除雜質(zhì)。試驗共設(shè)6個處理，所有處理組均先使用75%酒精浸泡15 s，每個處理加2滴吐溫-80：處理1. 0.1%升汞10 min；處理2. 3% NaClO 10 min；處理3. 5% NaClO 10 min；處理4. 6% NaClO 10 min；處理5. 7% NaClO 10 min；處理6. 10% NaClO 10 min。各處理組均使用滅菌水清洗5次。

將各處理組滅菌種子分別接種到MS培養(yǎng)基上，每個處理組重復(fù)20次，每個培養(yǎng)瓶分別接種10粒，置于20 ℃光照下培養(yǎng)。

1.3 測定項目及方法

處理5 d后，調(diào)查種子萌發(fā)率和種子污染率，測定種子的α-淀粉酶、β-淀粉酶[12]以及蛋白酶活性[13]。

處理7 d后，從各組培養(yǎng)瓶隨機(jī)取出50株幼苗，采用游標(biāo)卡尺測量幼苗的胚軸和胚根長度，用分析天平稱量幼苗鮮質(zhì)量和干質(zhì)量（120 ℃烘箱烘干10 min）。測定種子24 h滲透物質(zhì)電導(dǎo)率[11]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22軟件進(jìn)行方差顯著性分析，采用GraphPad Prism 6進(jìn)行繪圖。

種子萌發(fā)率=種子萌發(fā)數(shù)/種子總數(shù)×100%；種子污染率=污染粒數(shù)/總處理粒數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對種子萌發(fā)率的影響

由圖1可知，在不同消毒方法處理5 d后， 1～6處理組的萌發(fā)率分別為46.5%，56.5%，46.0%，61.0%，62.0%，52.0%。通過顯著性分析可知，升汞組（處理1）的萌發(fā)率與各濃度NaClO組相比，除與5% NaClO組（處理3）無顯著性差異外，與其他組別均有顯著性差異；不同濃度NaClO組別的萌發(fā)率由高到低排列為7% NaClO>6% NaClO>3% NaClO>10% NaClO>5% NaClO，且7% NaClO（處理5）與6% NaClO組（處理4）的萌發(fā)率間的差異不明顯，表明7% NaClO與6% NaClO組種子萌發(fā)率效果較優(yōu)。

2.2 不同處理對種子污染率的影響

由表1可知，升汞組與10% NaClO組（處理6）的污染率最低，僅為0.5%，7% NaClO組（處理5）污染率最高，為3.5%，其他組別間無明顯差異，表明不同濃度NaClO組均能達(dá)到理想的種子滅菌效果。

2.3 不同處理對幼苗的胚軸和胚根長度、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量的影響

由表2可知，不同處理對幼苗的胚軸生長表現(xiàn)出顯著性差異，6% NaClO組（處理4）的胚軸生長情況最好，5% NaClO組（處理3）的胚軸生長較差；不同處理對幼苗的胚根生長影響中，3% NaClO（處理2）的生長較差；不同處理對幼苗的鮮質(zhì)量和干質(zhì)量的影響中，6% NaClO（處理4）的鮮質(zhì)量積累效果最好，而10% NaClO（處理6）的干質(zhì)量積累效果最好。

2.4 不同處理對種子浸出液電導(dǎo)率及α-淀粉酶、β-淀粉酶及蛋白酶活性的影響

由圖2可知，1～6處理24 h種子浸出液電導(dǎo)率分別為68.70，68.36，57.92，44.63，55.10，55.06 μs·cm-1·g-1。種子在萌發(fā)初期，其浸出液的電導(dǎo)率可表明其可溶性物質(zhì)的滲出情況，反映其細(xì)胞膜受損后通透性的變化。6% NaClO組（處理4）的種子浸出液電導(dǎo)率最低，表明其細(xì)胞膜受損情況最?。簧M（處理1）種子浸出液濃度最高，表明升汞對細(xì)胞膜的損害程度最為嚴(yán)重。

種子萌發(fā)過程中分解貯藏物的酶的活性對種子的萌發(fā)與幼苗的生長都具有影響。由表3可知，不同處理下，10% NaClO組（處理6）的α-淀粉酶活性最高；6% NaClO組（處理4）α-淀粉酶活性僅次于10% NaClO組，且6% NaClO組的β-淀粉酶活性與蛋白酶活性最高。

3 討論與結(jié)論

種子的滅菌應(yīng)注意消毒劑的類型及濃度，關(guān)注消毒劑對種子萌發(fā)影響的后效應(yīng)[9]。本研究結(jié)果表明，不同消毒方法對種子萌發(fā)的影響具有明顯差異，升汞組與不同濃度NaClO組的萌發(fā)率相比較，NaClO組的萌發(fā)率顯著優(yōu)于升汞組，可能是由于升汞在消毒過程中汞離子本身對于種子毒害作用較強(qiáng)，且種子24 h浸出液電導(dǎo)率最高，為68.7 μs·cm-1·g-1，反映了升汞組種子表皮侵蝕性較強(qiáng)，使細(xì)胞膜受損較大。不同濃度的NaClO組別中，萌發(fā)率效果較優(yōu)的是6% NaClO與7% NaClO組；種子24 h浸出液的電導(dǎo)率，6% NaClO組最低，表明其種子表皮及細(xì)胞膜受損情況最低。理論上，不同濃度消毒劑在均能完成外植體滅菌情況下，消毒劑的濃度越低對外植體影響越小，成活率越高。但多次重復(fù)試驗結(jié)果表明，3% NaClO組的萌發(fā)率低于6% NaClO和7% NaClO組，表明NaClO對冰菜種子萌發(fā)的影響，并不隨著濃度的降低而升高，在6% NaClO，7% NaClO組的萌發(fā)率最高，這一現(xiàn)象與梁力哲[14]對辣椒種子與孫成虎等[8]對甘藍(lán)種子的研究結(jié)果一致。

種子萌發(fā)過程中需要大量的能量消耗，而其萌發(fā)過程中能量的唯一來源就是種子內(nèi)貯藏物的氧化分解[15]，分解貯藏物類酶的活性變化是反映消毒劑對于種子萌發(fā)影響的一個重要因素。本試驗通過比較酶的活性發(fā)現(xiàn)，6% NaClO組的β-淀粉酶和蛋白酶活性最高，10% NaClO組的α-淀粉酶活性最高。再通過比較表觀的胚軸、胚根的生長情況以及鮮質(zhì)量、干質(zhì)量的積累情況可知，6% NaClO組的胚軸生長情況最優(yōu)；而3% NaClO組的胚根生長情況較弱，其他組別間無顯著差異；鮮質(zhì)量的積累以6% NaClO組最優(yōu)，干質(zhì)量積累以10% NaClO組最優(yōu)。

綜上所述，不同消毒劑和不同濃度的消毒劑通過侵蝕種子表皮，影響細(xì)胞膜通透性，進(jìn)一步影響種子內(nèi)負(fù)責(zé)分解貯藏物酶的活性，最終影響表觀種子的萌發(fā)和幼苗的生長。本試驗結(jié)果顯示，6% NaClO處理組，在冰菜種子消毒效果、種子萌發(fā)和幼苗生長方面均達(dá)到了一個最優(yōu)的效果。

參考文獻(xiàn)：

[1]PARK K S，KIM S K，CHO Y Y， et al. A coupled model of photosynthesis and stomatal conductance for the ice plant（Mesembryanthemum crystallinum L.）， a Facultative CAM Plant[J].Hortic environ biotechnol， 2016（3）： 259.

[2]劉華敏， 劉威. 冰葉日中花的引種栽培[J].南方農(nóng)業(yè)，2011（8）：12.

[3]唐琳， 劉建國， 馬欣榮. 兩種滅菌方法對番茄種子滅菌效果的評價[J].種子， 2008（9）： 17.

[4]INOUHE M， NEVIUS D J. Auxin -enchanced glucan autohydrolysis in maize coleoptile cell walls [J].Plant physiol， 1991（1）：285.

[5]陳鑫陽， 梁厚果， 王麗萍， 等. 汞對小麥萌發(fā)、生長和某些生理過程的影響[J].蘭州大學(xué)學(xué)報， 1985（1）： 22.

[6]GOUDEY J S ， TITTLE F L ， SPENCER M S. Effecfs of hypochlorite disinfection on the response of barley alourone layer to gib-berellic acid[J]. Physiol plant ， 1987（2）： 295.

[7]KIYOSUE T ， KAMADA H， HARADA H. Inducion of somatic embryogenesis from carrot seeds by hypochlorite treatment[J]. Plant tissue cuiflett ， 1989（6）： 138.

[8]孫成虎， 尚慶茂， 李平蘭. 幾種消毒劑對甘藍(lán)種傳黑斑病和種子理化特性的影響[C]//中國園藝學(xué)會第七屆青年學(xué)術(shù)討論會論文集.泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006： 670-674.

[9]王首鋒， 梁海曼. 升汞和次氯酸鈉對黃瓜種子萌發(fā)及幼苗生長的影響[J].植物生理學(xué)通訊， 1996， 32（1）： 117-119.

[10]徐宏英. 三種消毒劑對種子萌發(fā)及幼苗生長的影響[J].河南科學(xué)， 1999， 17（6）： 113-115.

[11]張淑珍， 徐鵬飛， 吳俊江. 作物種子生理學(xué)實(shí)驗[M].北京： 化學(xué)工業(yè)出版社， 2012： 39-40.

[12]劉子凡. 種子學(xué)實(shí)驗指南[M].北京： 化學(xué)工業(yè)出版社， 2011： 92-94.

[13]丁魯華， 孫淑琴. 蛋白酶活性的快速準(zhǔn)確測定方法[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)， 1998（6）： 112-115.

[14]梁立哲. 次氯酸鈉預(yù)處對辣椒種生真菌及種子發(fā)芽影響的研究[J].種子，1988（2）： 31-32.

[15]中山包. 發(fā)芽生理學(xué)[M].馬云彬， 譯. 北京： 農(nóng)業(yè)出版社， 1998： 89.