乳酸菌發(fā)酵黃芪多糖制劑在肉雞生產(chǎn)上的應(yīng)用

王 濤，樊克鋒，湯法銀*，王坤麗

（1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河南鄭州 450046；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南鄭州 450046）

乳酸菌發(fā)酵黃芪多糖制劑在肉雞生產(chǎn)上的應(yīng)用

王 濤1，樊克鋒1，湯法銀1*，王坤麗2

（1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河南鄭州 450046；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南鄭州 450046）

本試驗(yàn)旨在研究一種乳酸菌發(fā)酵的黃芪多糖（APS）制劑及其對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能、血清免疫球蛋白IgG、IgA含量及腸道菌群的影響。首先提取APS，測(cè)定乳酸菌對(duì)其發(fā)酵的可能性，確定最適宜的添加量；其次選擇500只1日齡體重相近的健康A(chǔ)A＋肉仔雞，隨機(jī)分為5組，每組100只。Ⅰ組為對(duì)照組，飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組分別在基礎(chǔ)日糧中添加20% APS 0.1 ɡ/kg和0.1、0.2、0.3 mL/kg的乳酸菌發(fā)酵制劑。試驗(yàn)期為6周。結(jié)果表明：乳酸菌在添加20% APS的液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最優(yōu)；與對(duì)照組相比，試驗(yàn)Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組肉雞的生長(zhǎng)性能顯著提高（P＜0.05），其中以Ⅳ組效果最好；與對(duì)照組相比，試驗(yàn)Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組肉雞血清IgG、IgA含量顯著提高（P＜0.05），試驗(yàn)組肉雞腸道微生物體系均有改善，盲腸大腸桿菌數(shù)量顯著降低（P＜0.05），盲腸乳酸菌數(shù)量顯著升高（P＜0.05）。綜合考慮，肉雞日糧中乳酸菌發(fā)酵APS制劑的最佳添加量為0.2 mL/kg。

乳酸菌；黃芪多糖；生長(zhǎng)性能；IgG；IgA；腸道菌群

乳酸菌是一類能發(fā)酵碳水化合物、產(chǎn)生乳酸的革蘭氏陽(yáng)性菌的總稱，具有抗菌、維持腸道菌群平衡、促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收、增免等多種功能[1]。黃芪為常用補(bǔ)氣中藥，性微溫、味甘，含多糖、皂甙、氨基酸等多種有效成分，具有提高動(dòng)物生產(chǎn)性能，增強(qiáng)機(jī)體免疫力等作用[2]。黃芪多糖（Astragalus Polysacharin，APS）是黃芪中發(fā)揮作用的主要成分，可作為免疫促進(jìn)劑或調(diào)節(jié)劑，同時(shí)具有抗病毒、抗腫瘤、抗應(yīng)激等作用。本研究利用乳酸菌發(fā)酵APS，以乳酸菌活菌數(shù)為指標(biāo)，選擇APS的合適添加量，制成發(fā)酵制劑，并研究其對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能、血清免疫球蛋白含量及腸道菌群的影響，為生產(chǎn)應(yīng)用提供技術(shù)支持和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

1.1.1 主要材料 乳酸菌菌種由河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院益生菌發(fā)酵中藥實(shí)驗(yàn)室提供；試驗(yàn)用黃芪購(gòu)于鄭州國(guó)藥大藥房；MRS培養(yǎng)基、無(wú)水乙醇、IgG和IgA試劑盒均購(gòu)于試劑公司。

1.1.2 主要儀器 精宏DHG-9246A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海）；賽多利斯BSA124S電子天平（德國(guó)）；申安LDZM-60KCS立式壓力蒸汽滅菌器（上海）；印溪DHP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海）；鑫天XSP91-06E-1電光源顯微鏡（上海）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理 本試驗(yàn)采用單因子隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將體重相近的500只1日齡AA＋肉仔雞，隨機(jī)分為5組，每組100只。Ⅰ組為對(duì)照組，飼喂基礎(chǔ)日糧（表1），Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組為試驗(yàn)組，飼喂基礎(chǔ)日糧的基礎(chǔ)上分別添加20%APS 0.1 ɡ/kg和0.1、0.2、0.3 mL/kg的乳酸菌發(fā)酵制劑。試驗(yàn)期為6周。1～2周為每籠50只，3～4周為每籠20只，5～6周為每籠10只。本試驗(yàn)在河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院試驗(yàn)基地進(jìn)行，試驗(yàn)雞各組分籠飼養(yǎng)，做好標(biāo)記，全程自由采食和自由飲水。嚴(yán)格控制雞舍內(nèi)的光照、溫度和濕度，定期消毒、免疫。詳細(xì)記錄各指標(biāo)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌種的活化 從-20℃冰箱取出凍存的屎腸球菌和植乳桿菌菌種，分別接入已滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h。然后將2種菌分別以5%的接種量接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h，鏡檢。等量混合即得發(fā)酵所用的混合液體菌種。

1.3.2 APS的制備 稱取適量黃芪，浸泡1～2 h，加入5倍中藥重量的水，大火煎開，沸騰后文火煎煮50 min，真空抽濾，藥渣與藥液分離。將藥渣重復(fù)以上步驟再煎第2次、第3次，合并3次濾液，4 200 r/min離心15 min，棄沉淀，濃縮上清液至1 g/mL。取濃縮液適量，加3倍95%的乙醇，靜置過(guò)夜，離心，將沉淀置于60℃烘干，稱重。研成粉末備用。

1.3.3 APS添加量及發(fā)酵條件的確定 本試驗(yàn)采用液體發(fā)酵，試驗(yàn)組APS添加量分別為10%、20%、30%、40%、50%，以不加APS的MRS培養(yǎng)基為對(duì)照。調(diào)節(jié)各組培養(yǎng)基pH為7，滅菌后按1%的接種量接種，37℃培養(yǎng)36 h。測(cè)定乳酸菌的活菌含量。

1.3.4 乳酸菌活菌計(jì)數(shù) 吸取1 mL樣品勻液于9 mL生理鹽水的試管中，震蕩，制成1:10的樣品勻液，按上述操作依此倍比稀釋至合適濃度。選擇2～3個(gè)合適稀釋度，用無(wú)菌移液管分別吸取每個(gè)稀釋度0.1 mL到2個(gè)MRS瓊脂平板上，涂勻，倒置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（24±2） h。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)成分（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

每毫升樣品中菌落數(shù)=平板上菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)/平板中菌液添加量

1.4 肉雞不同指標(biāo)的測(cè)定

1.4.1 生長(zhǎng)性能指標(biāo)測(cè)定 根據(jù)每天記錄的耗料量計(jì)算平均日采食量。第21、42天對(duì)各組雞空腹稱重，計(jì)算平均日增重。記錄肉雞階段的耗料量和階段的體增重，兩者之比為耗料增重比。

1.4.2 免疫指標(biāo)的測(cè)定 分別在21 、42 d時(shí)，每組隨機(jī)選取3只雞采血，3 000 r/min離心10 min，分離血清，-20℃保存，測(cè)定血清IgG、IgA的含量。

1.4.3 肉雞腸道微生物菌群測(cè)定 第42天時(shí)解剖雞，結(jié)扎腸道，無(wú)菌取空回腸部分內(nèi)容物1 g，置于9 mL生理鹽水的試管中，震蕩、3 000×g離心10 min，上清液倍比稀釋。取合適梯度的菌液分別接種于LB、MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)，計(jì)算大腸桿菌和乳酸桿菌菌落數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析和Duncan's多重比較，P＜0.05為差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié) 果

2.1 APS添加量的確定 乳酸菌可以在APS液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，且隨著APS添加量的增加，乳酸菌活菌數(shù)先升高后降低。當(dāng)APS添加量為20%時(shí)，乳酸菌活菌數(shù)達(dá)到最高，達(dá)到22.72×108CFU/g。

2.2 乳酸菌發(fā)酵APS對(duì)肉仔雞生長(zhǎng)性能的影響 由表2可知，在0～3、4～6、0～6周齡試驗(yàn)組肉雞的增重與對(duì)照組相比差異顯著（P＜0.05），其中Ⅴ組（高劑量組）增重最明顯。0～3周齡Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組肉雞的耗料增重比顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）；4～6周齡Ⅴ組肉雞的耗料增重比顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）；0～6周齡Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組肉雞的耗料增重比顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），Ⅱ組與對(duì)照組相比差異不顯著（P＞0.05）。

2.3 乳酸菌發(fā)酵APS對(duì)肉仔雞免疫功能的影響 由表3可知，在21 d，各試驗(yàn)組肉雞血清IgG的含量較對(duì)照組顯著提高（P＜0.05），其中Ⅳ組含量最高，但與Ⅴ組相比差異不顯著（P＞0.05）。在42 d，Ⅴ組血清IgG含量最高，較對(duì)照組提高了25.87%（P＜0.05）；總體來(lái)看，發(fā)酵制劑添加量增加時(shí)，肉雞血清IgG的含量隨之增加，前期Ⅳ組最高，后期Ⅴ組最高，綜合考慮添加中劑量更合適。在21 d時(shí)，試驗(yàn)Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組肉雞血清IgA含量較對(duì)照組分別提高了33.3%、52.5%、59.6%（P＜0.05）；Ⅱ組與對(duì)照組相比差異不顯著（P＞0.05）。在42 d，各試驗(yàn)組血清IgA含量與對(duì)照組差異顯著（P＜0.05），其中Ⅴ組含量最高，但與Ⅳ組差異不顯著（P＞0.05）。

2.4 乳酸菌發(fā)酵APS對(duì)肉仔雞腸道菌群的影響 由表4可知，各試驗(yàn)組肉雞的回腸大腸桿菌數(shù)量均在一定程度上低于對(duì)照組，隨著發(fā)酵制劑添加劑量的增大，肉雞回腸大腸桿菌數(shù)量遞減，且各組之間差異顯著（P＜0.05）。試驗(yàn)組肉雞腸道乳酸菌數(shù)量均高于對(duì)照組（P＜0.05），其中Ⅴ組乳酸菌數(shù)量最高，但其與Ⅳ組相比差異不顯著（P＞0.05）。

3 討 論

3.1 乳酸菌發(fā)酵APS對(duì)肉仔雞生長(zhǎng)性能的影響 APS及益生菌發(fā)酵后制劑可提高動(dòng)物生產(chǎn)性能已經(jīng)得到證實(shí)，在不同的試驗(yàn)動(dòng)物和試驗(yàn)條件下，結(jié)果略有不同，但總的趨勢(shì)一致。李樹鵬[3]在基礎(chǔ)日糧中分別添加APS、益生菌劑以及多糖與益生菌制劑復(fù)合，結(jié)果顯示各組均能顯著提高雛雞的生長(zhǎng)性能，其中多糖與益生菌制劑復(fù)合效果最優(yōu)，這與本試驗(yàn)中在基礎(chǔ)日糧的基礎(chǔ)上添加APS乳酸菌發(fā)酵制劑能夠增加肉雞日增重、降低耗料增重比的結(jié)果一致。因此，日糧中添加APS益生菌發(fā)酵制劑可以提高肉仔雞平均日增重，降低耗料增重比，對(duì)肉仔雞的生長(zhǎng)性能有顯著促進(jìn)作用。

3.2 乳酸菌發(fā)酵APS對(duì)肉仔雞免疫功能的影響 免疫球蛋白分為IgG、IgA、IgM、IgD、IgE 5類，主要參與體液免疫，IgG和IgA發(fā)揮主要作用。乳酸菌可以激活特異性免疫應(yīng)答，提高IgG、IgA、IgM的水平，增強(qiáng)體液免疫，促進(jìn)B細(xì)胞、T細(xì)胞的增殖，提高細(xì)胞免疫[4]。Zhu等[5]研究表明，低劑量的靈芝多糖處理對(duì)提高免疫抑制小鼠的免疫效應(yīng)細(xì)胞的活性有很大影響。趙天章等[6]發(fā)現(xiàn)在日糧中添加APS可提高肉雞血清IgG、IgM與IgA濃度，尤其對(duì)IgG的促進(jìn)作用更大。本試驗(yàn)研究表明，日糧中添加一定量的乳酸菌發(fā)酵APS制劑，可以提高肉仔雞血清IgG、IgA含量，進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體免疫功能。3.3 乳酸菌發(fā)酵APS對(duì)肉仔雞腸道菌群的影響 腸道微生態(tài)環(huán)境的穩(wěn)定是維持機(jī)體健康和預(yù)防疾病的重要因素，腸道菌群一旦失調(diào)，勢(shì)必影響機(jī)體健康[7]。APS具有調(diào)整腸道微生態(tài)失調(diào)的作用，促進(jìn)腸道有益菌的增殖。乳酸菌是腸道正常的優(yōu)勢(shì)菌群，通過(guò)與致病菌競(jìng)爭(zhēng)來(lái)抑制其繁殖；同時(shí)刺激腸道的蠕動(dòng)，促進(jìn)糞便排出[8]。梁金花等[9]研究表明，APS對(duì)大鼠潰瘍性結(jié)腸炎作用明顯，治療7 d后，腸道菌群恢復(fù)正常。玄家潔[10]研究表明，乳酸菌復(fù)合物對(duì)大腸桿菌的體外聯(lián)合抑制作用明顯，肉雞腸道菌群恢復(fù)正常。日糧中添加不同益生菌對(duì)菌群種類和數(shù)量都產(chǎn)生了不同程度的影響，這與菌群種類和宿主腸道物質(zhì)代謝都息息相關(guān)。本試驗(yàn)表明，乳酸菌發(fā)酵制劑對(duì)腸道菌群的平衡有促進(jìn)作用，可降低回腸大腸桿菌數(shù)，增加腸道乳酸菌數(shù)量。

表2 發(fā)酵制劑對(duì)0~6周肉仔雞生長(zhǎng)性能的影響

表3 發(fā)酵制劑對(duì)肉雞血清免疫球蛋白的影響 mg/L

表4 發(fā)酵制劑對(duì)肉雞回腸乳酸菌和大腸桿菌數(shù)量的的影響

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，乳酸菌可以在APS液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，APS最適添加量為20%。日糧中添加發(fā)酵制劑對(duì)肉仔雞的生長(zhǎng)性能有顯著促進(jìn)作用，其中以Ⅳ組（20% APS+乳酸菌發(fā)酵制劑0.2 mL/kg+基礎(chǔ)日糧）效果最好；日糧中添加發(fā)酵制劑可以提高肉仔雞血清中IgG、IgA的含量，進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體免疫功能；日糧中添加發(fā)酵制劑可以改善肉雞腸道微生物體系，減少腸道大腸桿菌數(shù)量，并促進(jìn)乳酸菌的定殖，對(duì)腸道菌群的平衡發(fā)揮重大作用。

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Studies on Application of Astragalus Polysacharin Fermented by Lactic Acid Bacteria In Broilers

WANG Tao1, FAN Ke-feng1, TANG Fa-yin1*, WANG Kun-li2
(1.College of Veterinary Medicine, Henan University of Animal Husbandry and Economy, Henan Zhengzhou 450046, China; 2.College of Animal Science and Veterinary Medicine, Henan Agricultural University, Henan Zhengzhou 450046, China)

This study was aimed to prepare of a kind of Astragalus Polysacharin(APS) which fermented by lactic acid and research its influence on the growth of broiler, serum immunoglobulin levels and intestinal flora. Firstly, the preparation of APS, as well as the feasibility of fermenting Astragalus using lactic acid bacteria was determined and the best optimum adding amount. Secondly, 500 1-day-old AA＋broilers were randomly divided into 5groups. Chickens in the control group were fed basal diet, while chickens in the test groups, based upon the basal diet, were added with 0.1 g/kg of the 20% APS and 0.1、0.2、0.3 mL/kg of preparation which fermented by lactic acid. And the experiment lasted for 6 weeks. The results showed that 20% APS has better growth-promoting effects to the lactic acid . During the whole test period, compared with control group, groups Ⅲ, Ⅳ and V was significantly improved the growth performance of broilers (P＜0.05), as well as group Ⅳ was the best; Compared with control group, groups Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ and V was significantly improved the content of IgG and IgA (P＜0.05), groups Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ and V could make the intestinal micro environment better, reduce the number of E.coli in cecum, and increase the number of Lactobacillus in broilers and the effect was significant(P＜0.05). In conclusion, based upon the basal diet, the best addition amount of the preparation which fermented by lactic acid was 0.2mL/kg.

Lactic acid bacteria; Astragalus polysacharin; Growth performance; IgG; IgA; Intestinal bacterial

S831.5

A

10.19556/j.0258-7033.2017-06-102

2017-01-06；

2017-05-15

省骨干教師項(xiàng)目（2013GGJS-191）；自然科學(xué)研究項(xiàng)目（12A23000）

王濤（1971-），男，講師，碩士，研究方向?yàn)樾笄菁纳x病防制，E-mail：153090502@qq.com

* 通訊作者：湯法銀（1977-），男，副教授，碩士，研究方向?yàn)橹蝎F藥研究開發(fā)與應(yīng)用，E-mail：finetang@126.com