玉米赤霉烯酮對IPEC-J2細胞炎癥相關(guān)因子mRNA表達和活性的影響

楊麗革，牟 洋，張 薇，李建平，單安山

（東北農(nóng)業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所，黑龍江哈爾濱 150030）

玉米赤霉烯酮對IPEC-J2細胞炎癥相關(guān)因子mRNA表達和活性的影響

楊麗革，牟 洋，張 薇，李建平*，單安山*

（東北農(nóng)業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所，黑龍江哈爾濱 150030）

本試驗旨在探討玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）對仔豬空腸上皮細胞（IPEC-J2）炎癥相關(guān)因子mRNA表達和活性的影響。試驗選取不同濃度（0～80 μg/mL）ZEN處理IPEC-J2細胞12、24、48 h，CCK-8法檢測細胞存活率并計算得出半數(shù)抑制濃度（IC50）。根據(jù)IC50選取用不同濃度ZEN（0、5、10、15 μg/mL）處理細胞12、24、48 h，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，RT-PCR法測定炎癥相關(guān)因子NF-κB、COX-2、PGES、IL-6、IL-8 mRNA的表達量，ELISA方法檢測炎癥相關(guān)因子的活性。結(jié)果表明：ZEN以時間和劑量依賴性降低IPEC-J2細胞存活率，12、24、48 h ZEN的IC50分別為41.09、28.54、19.85 μg/mL；隨ZEN濃度升高和處理時間的延長，細胞形態(tài)被逐漸破壞；除COX-2的mRNA表達量和活性在12 h隨ZEN濃度升高而升高外（P＜0.05），炎癥相關(guān)因子mRNA表達量和活性均隨ZEN濃度的升高呈先升高后降低（P＜0.05）；ZEN濃度和處理時間對炎癥相關(guān)因子mRNA表達量和活性的影響均有極顯著的交互作用（P＜0.001）。以上結(jié)果表明，ZEN能降低細胞存活率，破壞細胞形態(tài)，ZEN對細胞炎癥相關(guān)因子mRNA表達和活性具有雙向調(diào)節(jié)作用。

玉米赤霉烯酮；IPEC-J2；炎癥相關(guān)因子

玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）是鐮刀菌屬產(chǎn)生的一種普遍存在于谷物和飼料中的霉菌毒素。ZEN具有細胞毒性、免疫毒性、生殖毒性、遺傳毒性，同時與腫瘤產(chǎn)生也有一定的關(guān)聯(lián)，而豬對ZEN尤為敏感。由于胃腸道既是養(yǎng)分消化吸收的主要部位，也是抵御攝入化學藥物、食物污染以及天然毒素的第1道屏障，當ZEN污染過的飼糧被畜禽采食后，腸上皮細胞便成為ZEN首先作用的靶點[1]。仔豬空腸上皮細胞（IPEC-J2）是分離自未吮乳的新生仔豬空腸上皮細胞，屬于非轉(zhuǎn)化性最初的連續(xù)培養(yǎng)小腸細胞系，具有典型的豬小腸上皮細胞特性[2]。因此，本試驗選取IPEC-J2細胞為模型研究ZEN對炎癥相關(guān)因子mRNA表達和活性的影響。

Wan等[3]研究表明，10 μmol/L或40 μmol/L ZEN處理IPEC-J2細胞48 h后能上調(diào)促炎癥細胞IL-1α、IL-6、IL-8、TNF、MCP-1 mRNA的表達進而引起腸道炎癥反應。Taranu等[4]研究表明，10 μmol/L ZEN作用于豬腸上皮細胞（IPEC-1）24 h后，炎癥相關(guān)因子TNF-α、IL-1α、IL-6、IL-8、MCP-1、IL-12p40、CCL20的表達量升高。但是關(guān)于不同濃度的ZEN處理IPEC-J2細胞不同時間后對炎癥相關(guān)因子的影響鮮有報道。本試驗選取不同濃度和不同處理時間探討ZEN對IPEC-J2細胞炎癥相關(guān)因子NF-κB、環(huán)氧合酶2（COX-2）、前列腺素e2合酶（PGES）、白介素6（IL-6）、白介素8（IL-8）mRNA表達的影響，為下一步研究ZEN對細胞炎癥反應作用機理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 IPEC-J2細胞由中國農(nóng)業(yè)大學提供。

1.1.2 主要儀器和試劑 二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；SA3300顯微鏡（北京泰克實驗公司）；酶標儀（美國Tecan公司）；高速低溫離心機（美國Sigma公司）；凝膠成像系統(tǒng)（美國UVP公司）；電泳儀（美國Bio-Rad公司）；7500熒光定量PCR儀（美國ABI公司）等。

ZEN、乙腈（美國Sigma公司）；DMEM/F-12（1:1）培養(yǎng)基（美國Hyclone公司）；胎牛血清（美國Gibco公司）；胰酶細胞消化液、青霉素-鏈霉素溶液（江蘇碧云天生物技術(shù)研究所）；CCK-8（日本同仁化學研究所）；總RNA提取試劑盒（上海飛捷生物技術(shù)有限公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RTPCR試劑盒（大連寶生物工程有限公司）；ELISA試劑盒（上海恒遠生物技術(shù)有限公司）。

ZEN加乙腈配制成10 mg/mL溶液，-20℃保存，備用。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) IPEC-J2細胞接種于25 cm2細胞培養(yǎng)瓶中，DMEM/F-12培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔1 d換1次培養(yǎng)基，待細胞貼壁生長到80%～90%時進行傳代。

1.2.2 ZEN對IPEC-J2細胞的毒性作用 取對數(shù)生長期的細胞調(diào)整至5×104/孔接種于96孔板中，每孔100 μL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后棄上清，每孔分別加入100 μL含ZEN（0、2.5、5、10、20、40、80 μg/mL）的無血清培養(yǎng)基，分別繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48 h。培養(yǎng)時間結(jié)束后，每孔加入10 μL CCK-8，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育4 h，培養(yǎng)結(jié)束后用酶標儀在450 nm處測定各孔吸光度值，記錄結(jié)果，同時設空白對照組。所有試驗孔和對照孔每組均設5復孔。

細胞相對存活率（%）=（試驗組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）

1.2.3 顯微鏡下觀察細胞形態(tài)的變化 取對數(shù)生長期的細胞調(diào)整至1×106/孔接種于6孔板中，待細胞貼壁生長至80%左右，分別加入含ZEN（0、5、10、15 μg/mL）的無血清培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱中分別繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48 h，在顯微鏡下觀察其形態(tài)變化。

1.2.4 炎癥相關(guān)因子NF-κB、PGES、COX-2、IL-6、IL-8 mRNA表達量檢測 總RNA的提取按試劑盒說明進行操作，提取的RNA置于-80℃?zhèn)溆?。凝膠電泳檢測RNA完整性，反轉(zhuǎn)錄和實時熒光定量PCR按試劑盒說明進行操作。根據(jù)GenBank上豬的基因序列設計引物采用GenBank Blast同源性檢索后，由上海生工生物有限公司合成，引物詳細信息見表1。mRNA的表達量采用-2△△Ct法計算，GAPDH為內(nèi)參基因。

1.2.5 炎癥相關(guān)因子NF-κB、PGES、COX-2、IL-6、IL-8活性的檢測 取對數(shù)生長期的細胞接種于12孔板中，按1.2.3處理細胞，用ELISA方法檢測上清液中炎癥相關(guān)因子的活性，操作均嚴格按照試劑盒說明操作。

1.3 統(tǒng)計分析 試驗結(jié)果用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，IC50用非線性回歸擬合計算方法計算，采用Duncan's法進行多重比較，ZEN和時間的交互作用采用一般線性模型進行分析，各組數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標準差表示，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標準，P＜0.001作為差異極顯著性判斷標準。

表1 引物序列及參數(shù)

2 結(jié) 果

2.1 ZEN對IPEC-J2細胞的毒性作用 由表2可見，ZEN能顯著降低IPEC-J2細胞的存活率（P＜0.05），并呈時間-劑量依賴關(guān)系。ZEN處理IPEC-J2細胞12、24、48 h后其IC50分別為41.09、28.54、19.85 μg/mL。根據(jù)48 h時IC50選取ZEN濃度為0、5、10、15 μg/mL，研究ZEN對細胞炎癥相關(guān)因子mRNA表達和活性的影響。

2.2 顯微鏡下細胞形態(tài)的變化 由圖1可見，對照組的IPEC-J2細胞呈鋪路石狀，是規(guī)則的腸上皮細胞形態(tài)。5 μg/mL ZEN時，12、24 h細胞形態(tài)呈鋪路石狀，48 h細胞形態(tài)稍有改變。10 μg/mL ZEN時，12 h細胞形態(tài)為鋪路石狀，但細胞間隙變大；24、8 h細胞形態(tài)大小不一、開始出現(xiàn)大量空隙、細胞膜模糊化的形態(tài)。15 μg/mL ZEN時，細胞形態(tài)極其不規(guī)則、分辨不清細胞核、半數(shù)細胞懸浮并裂解成更小的碎片。

表2 ZEN對IPEC-J2細胞存活率的影響

圖1 細胞形態(tài)的變化（10×）

2.3 ZEN對IPEC-J2細胞炎癥相關(guān)因子NF-κB、PGES、COX-2、IL-6、IL-8 mRNA表達的影響 由表3可知，ZEN添加量對NF-κB、PGES、COX-2、IL-6、IL-8 mRNA表達量影響極顯著（P＜0.001）；處理時間對NF-κB影響顯著（P＜0.05），對PGES、COX-2、IL-6、IL-8影響極顯著（P＜0.001）；ZEN添加量與處理時間交互作用極顯著（P＜0.001）。

隨ZEN濃度升高NF-κB mRNA表達量先升高后降低（P＜0.05），10 μg/mL ZEN處理組表達量最高（P＜0.05）。5、10 μg/mL ZEN處理組表達量隨時間增加而降低（P＜0.05），15 μg/mL ZEN處理組12 h表達量顯著高于24、48 h表達量（P＜0.05）。

隨ZEN濃度的升高PGES mRNA的表達量先升高后降低（P＜0.05）；12 h時，10 μg/mL ZEN處理組表達量最高（P＜0.05）；24、48 h時，5 μg/mL ZEN處理組的表達量最高（P＜0.05）。5 μg/mL ZEN處理組24、48 h表達量顯著高于12 h表達量 （P＜0.05），10、15 μg/mL ZEN處理組12 h表達量顯著高于24、48 h表達量（P＜0.05）。

12 h時，COX-2 mRNA表達量隨著ZEN濃度的升高而升高（P＜0.05）；24、48 h時，隨ZEN濃度的升高COX-2 mRNA表達量先升高后降低（P＜0.05）；24 h時，10 μg/mL ZEN處理組表達量最高（P＜0.05）；48 h時，5 μg/mL ZEN處理組表達量最高（P＜0.05）。5 μg/mL ZEN處理組48 h表達量最高（P＜0.05），10 μg/mL ZEN處理組12、24 h表達量顯著高于48 h表達量（P＜0.05），15 μg/mL ZEN處理組表達量隨時間增加而降低（P＜0.05）。

隨著ZEN濃度的升高IL-6 mRNA表達量而先升高后降低（P＜0.05），10 μg/mL ZEN處理組表達量最高（P＜0.05）。5、10 μg/mL ZEN處理組表達量隨時間增加而升高（P＜0.05），15 μg/mL ZEN處理組12 h表達量顯著高于24、48 h表達量（P＜0.05）。

隨著ZEN濃度的升高IL-8 mRNA表達量先升高后降低（P＜0.05）；12、48 h時，10 μg/mL ZEN處理組表達量最高（P＜0.05）；24 h時，5 μg/mL ZEN處理組表達量最高（P＜0.05）。5 μg/mL ZEN處理組24 h表達量最高（P＜0.05），10 μg/mL ZEN處理組表達量隨時間增加而降低（P＜0.05），15 μg/mL ZEN處理組12 h表達量顯著高于24、48 h表達量（P＜0.05）。

表3 ZEN對IPEC-J2細胞炎癥相關(guān)因子mRNA表達的影響

2.4 ZEN對IPEC-J2細胞炎癥相關(guān)因子NF-κB、PGES、COX-2、IL-6、IL-8 活性的影響 由表4可知，ZEN添加量和處理時間對NF-κB、PGES、COX-2、IL-6、IL-8活性影響極顯著（P＜0.001）；ZEN添加量與處理時間交互作用極顯著（P＜0.001）。

隨ZEN濃度升高NF-κB活性先升高后降低（P＜0.05），10 μg/mL ZEN處理組活性最高（P＜0.05）。對照組24 h活性最高（P＜0.05），5、10、15 μg/mL ZEN處理組活性隨時間增加而降低（P＜0.05）。

隨ZEN濃度的升高PGES活性先升高后降低（P＜0.05），10 μg/mL ZEN處理組活性最高（P＜0.05）。對照組24 h活性最高（P＜0.05），5、15 μg/mL ZEN處理組12 h活性最高 （P＜0.05），10 μg/mL ZEN處理組活性隨時間增加而降低（P＜0.05）。

12 h時，COX-2活性隨著ZEN濃度的升高而升高（P＜0.05）；24、48 h時，COX-2活性隨ZEN濃度的升高先升高后降低且5 μg/mL ZEN處理組活性最高（P＜0.05）。對照組12、24 h活性顯著高于48 h活性（P＜0.05），5、10、15 μg/mL ZEN處理組活性隨時間增加而降低（P＜0.05）。

IL-6活性隨著ZEN濃度的升高而先升高后降低（P＜0.05），10 μg/mL ZEN處理活性最高（P＜0.05）。對照組活性隨時間增加而降低（P＜0.05），5、10 μg/mL ZEN處理組活性隨時間增加而升高（P＜0.05），15 μg/mL ZEN處理組24 h活性最高（P＜0.05）。

隨著ZEN濃度的升高IL-8活性先升高后降低（P＜0.05）；12、24 h時，10 μg/mL ZEN處理組活性最高（P＜0.05）；48 h時，5 μg/mL ZEN處理組活性最高（P＜0.05）。對照組、5 μg/mL ZEN處理組24 h活性最高（P＜0.05），10 、15μg/mL ZEN處理組活性隨時間增加而降低（P＜0.05）。

3 討 論

IC50是指被測量的拮抗劑的半抑制濃度，是反映細胞對化學藥效的一個重要指標。因此本試驗首先觀察ZEN對細胞存活率的影響，為ZEN對細胞毒性效應的研究提供理論基礎(chǔ)。研究表明，ZEN對不同動物種屬、不同細胞均會產(chǎn)生細胞毒性，且IC50隨不同細胞和不同處理時間會有所變化[5]。本試驗得出，12、24、48 h ZEN的IC50分別為41.09、28.54、19.85 μg/mL。

NF-κB是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，參與炎癥的發(fā)生，在機體的組織和細胞中廣泛存在，能誘導多種細胞因子和炎癥介質(zhì)的基因表達，調(diào)控炎癥級聯(lián)效應，還可調(diào)控免疫反應，參與細胞內(nèi)信號傳導[6]。COX-2在腸道炎癥反應過程中發(fā)揮著十分重要的作用，與NF-κB的結(jié)合位點存在于COX-2的啟動子部位[7]，因此COX-2的轉(zhuǎn)錄激活必須經(jīng)由NF-κB位點調(diào)控。目前存在的3種PGES相關(guān)酶包括cPGES、mPGES1、mPGES2，促炎癥細胞因子能上調(diào)培養(yǎng)細胞中的mPGES-1和COX-2并能通過COX-2/mPGES1途徑生成PGe2，進而引起炎癥反應[8]。IL-6是由多種免疫細胞或非免疫細胞產(chǎn)生的多效的前炎癥細胞因子。IL-8是由吞噬細胞或間沖質(zhì)細胞通過炎癥、感染、局部缺血等刺激下產(chǎn)生的趨化分子。NF-κB表達量上調(diào)時，可誘導產(chǎn)生多種促炎癥細胞因子（如IL-6、TNF-α、IL-1、IL-8等）[9]。本試驗結(jié)果表明，ZEN能通過上調(diào)炎癥相關(guān)因子的活性的從而發(fā)生炎癥反應。高濃度ZEN或作用時間延長PGES、COX-2和IL-6 mRNA的表達與對照組相比顯著降低，但蛋白活性沒有顯著降低。mRNA表達水平與蛋白活性之間的差異，可能是受到分子轉(zhuǎn)錄后或翻譯后調(diào)控機制影響，或是應用于蛋白質(zhì)定量試驗技術(shù)的靈敏度沒有轉(zhuǎn)錄水平測定mRNA含量的靈敏度高[10]。

表4 ZEN對IPEC-J2細胞炎癥相關(guān)因子活性的影響

關(guān)博[11]研究表明，0～25 μg/mL ZEN處理雞脾臟淋巴細胞48 h后，NF-κB、COX-2 mRNA的表達量均隨毒素濃度升高而升高；Jia等[12]研究表明，用（0.3～146.0 mg/kg）ZEN飼喂妊娠期SD大鼠20 d后，腎臟中IL-6和NF-κBp65 mRNA和蛋白表達量隨ZEN濃度增加而增加；Bouhet等[13]研究表明，0～100 μmol/L伏馬菌素B1（Fumonisin B1，F(xiàn)B1）處理IPEC-1細胞72 h后，IL-8的mRNA和蛋白表達量均隨濃度增加而降低；范小龍等[14]研究表明，低濃度ZEN（1 μg/mL）能顯著促進小鼠脾臟淋巴細胞分泌IL-10，而高濃度ZEN（10、25 μg/mL）均能極顯著抑制小鼠脾臟淋巴細胞分泌IL-10。史嘉瑜[15]研究表明，SD大鼠腹腔注射ZEN 3-96 h后卵巢中NF-κB的蛋白表達量在3 h時最高；Krishnaswamy等[16]研究表明，10 μmol/L DON處理人結(jié)腸癌細胞（HT-29）1～6 h后，NF-κB的蛋白表達量先升高后下降，處理10～24 h后，COX-2的表達量同樣先升高后降低?？梢钥闯霾糠置咕舅氐牟煌瑵舛群吞幚頃r間對炎癥相關(guān)因子的影響具有雙向調(diào)節(jié)作用，低濃度的霉菌毒素或處理時間較短能促進炎癥相關(guān)因子的產(chǎn)生，高濃度的霉菌毒素或處理時間較長反而抑制其產(chǎn)生。本試驗關(guān)于ZEN濃度或者作用時間對炎癥相關(guān)因子產(chǎn)生的結(jié)果與前人研究結(jié)果一致?？赡苁怯捎诘蜐舛鹊亩舅啬苌险{(diào)細胞因子、趨化因子、炎癥相關(guān)基因的表達同時發(fā)生免疫刺激，高濃度毒素或處理時間較長可能通過誘導細胞凋亡而抑制免疫細胞、免疫因子及抗體的形成等方式發(fā)生免疫抑制[17]。

為了更深一步探究ZEN對細胞炎癥相關(guān)因子表達的影響，可以選擇更多時間和濃度范圍來研究，從而系統(tǒng)地得出不同濃度ZEN處理不同時間炎癥相關(guān)因子的表達規(guī)律，為下一步研究ZEN對細胞炎癥反應作用機理提供理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

ZEN以時間依賴性和劑量依賴性降低IPEC-J2細胞存活率，在12、24、48 h的IC50分別為41.09、28.54、19.85 μg/mL。隨ZEN濃度升高和處理時間的延長，細胞形態(tài)被逐漸破壞。ZEN對細胞炎癥相關(guān)因子mRNA表達和活性具有雙向調(diào)節(jié)作用。

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Effect of ZEN on mRNA Expression and Activity of Inflammation Related Factors in IPEC-J2 Cells

YANG Li-ge, MU Yang, ZHANG Wei, LI Jian-ping*, SHAN An-shan*
(College of Animal Science and Technology, Northeast Agricultural University, Heilongjiang Harbin 150030, China)

The purpose of this study was to evaluate the effects of ZEN on mRNA expression of inflammation related factors in IPEC-J2. Cells were treated with different concentrations of ZEN (0～80 μg/mL) for 12, 24, 48 h. Cell viability was estimated by CCK-8 assay and the IC50 was calculated. After cells were treated with different concentrations of ZEN (0, 5, 10, 15 μg/mL) for 12, 24, 48 h, the changes of cells morphology were observed and the mRNA expression of NF-κB, PGES, COX-2, IL-6, IL-8 were detected by RT-PCR. The results showed as follows: the cell viability was reduced in a dose/time-dependent manner, IC50 of ZEN were 41.09, 28.54 and 19.85 μg/mL, respectively. With the increasing of ZEN concentrations and the extension of treatment time, the morphology of cells was gradually destroyed. In addition to the COX-2 mRNA expression increased with dose dependent of ZEN at 12h (P＜0.05), the mRNA expression increased first then decreased with the concentration increased (P＜0.05). When ZEN concentration was 5 μg/mL, the NF-κB in 12 h, PGES and IL-8 in 24 h, IL-6 and COX-2 in 48 h mRNA expression highest; when ZEN concentration was 10 μg/mL, the NF-κB, PGES and IL-8 in 12 h, COX-2 in 24 h, IL-6 in 48 h mRNA expression highest; when ZEN concentration was 15 μg/mL, all inflammation related factors mRNA expressed highest in 12 h. The interactions of ZEN concentration and treatment time on the expression of inflammatory cytokine mRNA was highly significant (P＜0.001). The current findings indicated that ZEN could reduce cell viability and destroy cell morphology, ZEN had dual regulatory functions in expression of inflammation related factors.

Zearalenone; IPEC-J2; Inflammation related factors

S828.5

A

10.19556/j.0258-7033.2017-06-075

2016-11-29；

2017-01-20

國家重點研發(fā)計劃（2016YFD0501207）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設專項（CARS-36）；動物普通疾病防治重點實驗室開放課題

楊麗革（1990-），女，河南濮陽人，碩士研究生，主要從事動物營養(yǎng)與飼料科學研究，E-mail：ylgpy123456@

163.com

* 通訊作者：李建平，副教授，碩士生導師，E-mail：ljpneau @163.com；單安山，教授，博士生導師，E-mail：asshan@ neau.edu.cn