大白豬NCOA1和FUT1基因多態(tài)性與繁殖性能的關(guān)聯(lián)分析

李 濤，黃 濤*，胡九英，汪德明，魯慧文，孫敬禮，李衛(wèi)忠，來(lái)紅霞

（1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子 832000；2.新疆正大食品有限公司,新疆五家渠 831301）

大白豬NCOA1和FUT1基因多態(tài)性與繁殖性能的關(guān)聯(lián)分析

李 濤1，黃 濤1*，胡九英2，汪德明2，魯慧文1，孫敬禮1，李衛(wèi)忠1，來(lái)紅霞2

（1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子 832000；2.新疆正大食品有限公司,新疆五家渠 831301）

本研究利用PCR-RFLP技術(shù)檢測(cè)685頭大白母豬NCOA1和FUT1基因多態(tài)性并對(duì)其分型，同時(shí)分析了單個(gè)基因型以及合并基因型與母豬繁殖性能的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果表明：2個(gè)基因都檢測(cè)到了3種基因型；經(jīng)產(chǎn)母豬NCOA1基因中AB型個(gè)體的總產(chǎn)仔數(shù)、總活仔數(shù)、死胎顯著高于AA型個(gè)體（P＜0.05）；經(jīng)產(chǎn)母豬FUT1基因中AA型個(gè)體的總產(chǎn)仔數(shù)、總活仔數(shù)、健仔數(shù)以及初生窩重顯著高于AG型和GG型個(gè)體（P＜0.05）；經(jīng)產(chǎn)母豬合并基因AAAA型和ABAG型個(gè)體的總產(chǎn)仔數(shù)、總活仔數(shù)、健仔數(shù)顯著高于AAAG型個(gè)體（P＜0.05），ABAG型個(gè)體的死胎顯著高于AAAG型個(gè)體（P＜0.05），AAAA型個(gè)體的初生窩重顯著高于AAAG和AAGG型個(gè)體（P＜0.05）。由此可見(jiàn)，NCOA1和FUT1單基因型以及合并基因型對(duì)繁殖性能具有一定的影響，可以用其作為遺傳標(biāo)記輔助選擇。

豬；NCOA1基因；FUT1基因；合并基因型；繁殖性能

豬的繁殖性狀是一個(gè)重要的經(jīng)濟(jì)性狀，其繁殖性能高低對(duì)豬場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)效益起著決定性作用。由于繁殖性狀的低遺傳力，常規(guī)育種進(jìn)展緩慢。標(biāo)記輔助選擇法（Marker-assisted Selection，MAS）為豬繁殖性狀的選育提供了一種新的方法，基于對(duì)候選基因的分子標(biāo)記，篩選出生產(chǎn)性能高且繁殖性能強(qiáng)的母豬，可以大大提高豬的繁殖性能[1]。

斷奶仔豬易患腹瀉和水腫病，是引起斷奶仔豬死亡的重要病因。該病是由腸毒素型大腸桿菌F18（ETECF18）引起，其是否致病取決于豬小腸黏膜上皮細(xì)胞刷狀緣有無(wú)相關(guān)受體。巖藻糖轉(zhuǎn)移酶基因（Fucosyltransferase Gene，F(xiàn)UT1）第307位堿基突變（G→A）,產(chǎn)生2種等位基因G和A,基因型GG和AG的個(gè)體均為斷奶仔豬腹瀉和仔豬水腫病易感型,基因型AA為抗性型,并認(rèn)為可將FUT1點(diǎn)突變作為斷奶仔豬腹瀉和仔豬水腫病的一個(gè)遺傳標(biāo)記[2]。Gogeli等[3]研究發(fā)現(xiàn)，其位于豬6號(hào)染色體上的2α-（1,2） FUT1是豬ETEC F18受體蛋白基因，該基因與母豬的產(chǎn)仔性能具有密切的相關(guān)性。晏學(xué)明等[4]、包文斌等[5]采用PCR- RFLP方法，在FUT1基因M307位點(diǎn)經(jīng)Hin6 I酶切后，均有AA、AG和GG 3種基因型出現(xiàn)。

核受體輔激活蛋白1基因（Nuclear Receptor Coactivator 1 Gene，NCOA1），又稱(chēng)為類(lèi)固醇受體輔激活蛋白基因，是豬繁殖性能候選基因之一，其作用機(jī)制是與DNA上核受體相結(jié)合來(lái)增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性[6]。Melville等[7]根據(jù)人和豬基因的同源性設(shè)計(jì)引物，采用PCR-RFLP方法，分析了豬NCOA1基因的多態(tài)性與繁殖性狀的關(guān)系，進(jìn)行測(cè)序發(fā)現(xiàn)梅山豬存在一個(gè)T/C單核苷酸多態(tài)性。Razeto等[8]還提出NCOA1基因是生殖激素“開(kāi)關(guān)”的觀點(diǎn)，認(rèn)為生殖激素長(zhǎng)時(shí)間打開(kāi)可能是導(dǎo)致豬窩產(chǎn)仔數(shù)增加的原因。

NCOA1和FUT1在繁殖性狀上起著重要作用，但不同研究者報(bào)道的結(jié)果不一致。新疆地區(qū)對(duì)母豬繁殖性狀分子標(biāo)記還缺乏比較系統(tǒng)的研究，尤其是合并基因型的相關(guān)研究較少，鑒于兩基因在繁殖性狀上的重要作用，本實(shí)驗(yàn)采用PCR-RFLP方法分析大白豬NCOA1和FUT1基因的多態(tài)性，分析單基因型和合并基因型與繁殖性能的關(guān)系，旨在為新疆地區(qū)豬的分子育種積累數(shù)據(jù)，為繁殖性狀的分子標(biāo)記輔助選擇提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 統(tǒng)計(jì)2014—2016年新疆正大食品有限公司685頭經(jīng)產(chǎn)、初產(chǎn)大白母豬6胎共2 849胎次的總產(chǎn)仔數(shù)（TNB）、總活仔數(shù)（NBA）、健仔數(shù)（NHB）、死胎、木乃伊胎以及初生窩重等信息，其中初產(chǎn)685胎。采集685頭大白豬耳組織樣，浸泡在75%酒精溶液中。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑、儀器 實(shí)驗(yàn)儀器包括RT-PCR儀、DYY-4穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀、臺(tái)式恒溫振蕩器、Gel DocTM XR電泳凝膠成像系統(tǒng)、微波爐、臺(tái)式高速離心機(jī)。

試劑包括瓊脂糖、Marker DL2000、血液/細(xì)胞/組織基因組DNA抽提試劑盒（購(gòu)自TIANGEN公司）；DNA限制性?xún)?nèi)切酶RsaⅠ、HhaⅠ購(gòu)自TaKaRa-寶生物工程有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 DNA的提取 取豬耳組織樣100 mg于EP管中剪碎，提取按照TIANGEN基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其純度，用Nano 2000測(cè)定DNA濃度，并稀釋至50 ng/μL，-20℃保存，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 引物 引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

1.3.3 PCR擴(kuò)增 反應(yīng)體系15 μL：2×Es Taq Master Mix 7.5 μL，上、下游引物各0.4 μL，模板DNA 0.5 μL，去離子水6.2 μL。NCOA1反應(yīng)條件：94℃變性4 min，35次循環(huán)（94℃，30 s；56℃，30 s；72℃，30 s），72℃延伸5 min，4℃，1 h；FUT1反應(yīng)條件相同，退火溫度為57℃；PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.3.4 PCR-RFLP檢測(cè) NCOA1和FUT1分別用限制性?xún)?nèi)切酶Rsa、HhaⅠ進(jìn)行酶切。酶切反應(yīng)體系：PCR產(chǎn)物13 μL，內(nèi)切酶0.5 μL，10×Buffer 1.5 μL，37℃水浴3 h，酶切產(chǎn)物用2.0%的瓊脂糖電泳檢測(cè)分型，利用凝膠成像系統(tǒng)拍照，判斷基因型。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 對(duì)基因頻率和基因型頻率分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，同時(shí)計(jì)算多態(tài)信息含量（PIC）、有效等位基因數(shù)（NE）、遺傳雜合度（He）和遺傳純合度（Ho）[9-10]。建立最小二乘法分析模型，利用SAS（Version9.1）軟件分別對(duì)實(shí)驗(yàn)豬群多態(tài)位點(diǎn)的單基因型、合并基因型與繁殖性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，并進(jìn)行H-W檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)分析模型：

其中，y為繁殖性狀（TNB、NBA、NHB）的觀察值；μ為群體的均值；Bi為胎次效應(yīng)；Sj為季節(jié)效應(yīng)；Gk為年度效應(yīng)；eijkl為隨機(jī)殘差。

2 結(jié)果與分析

2.1.1 NCOA1多態(tài)性分析 NCOA1基因PCR產(chǎn)物為440 bp，經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶RsaⅠ酶切后用2.0 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)到3 種基因型（圖1）：440、440/282/158、282/158 bp，分別命名為AA、AB和BB型。

圖1 NCOA1基因擴(kuò)增產(chǎn)物PCR-RFLP電泳圖

2.1.2 FUT1多態(tài)性分析 FUT1基因PCR產(chǎn)物為328 bp，經(jīng)HhaⅠ酶切后用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)到3種帶型（圖2）：328/93、328/241/93/87、對(duì)初產(chǎn)母豬繁殖性狀的影響 由表4可知，初產(chǎn)母豬BB基因型個(gè)體數(shù)小于2，表中不對(duì)BB基因型以及其合并基因型作分析。初產(chǎn)母豬NCOA1基因中AB型個(gè)體的各繁殖性狀呈現(xiàn)出高于AA型個(gè)體的趨勢(shì)，而木乃伊胎與其相反；初產(chǎn)母豬FUT1基因中AG型個(gè)體的TNB、NHB、初生窩重呈現(xiàn)出高于AA型和GG型，而在NBA、死胎、木乃伊胎分布趨勢(shì)則不盡相同；兩基因均未達(dá)到差異顯著水平（P 241/93/87 bp，分別為AA、AG和GG基因型。

表1 PCR引物序列

2.2 大白豬NCOA1、FUT1基因基因遺傳多態(tài)性分析

2.2.1 等位基因頻率、基因型頻率以及遺傳特性分析 由表2可知，NCOA1基因BB型個(gè)體數(shù)小于2，所以在后續(xù)分析中只對(duì)AA和AB基因型進(jìn)行分析；NCOA1基因型頻率呈現(xiàn)出AA＞AB＞BB，AA為優(yōu)勢(shì)基因型；等位基因頻率A＞B，A為優(yōu)勢(shì)等位基因。由表3可知，F(xiàn)UT1其基因型頻率趨勢(shì)為GG＞AG＞AA，GG為優(yōu)勢(shì)基因型；等位基因頻率G＞A，G為優(yōu)勢(shì)等位基因；NCOA1的He為0.13，F(xiàn)UT1的He為0.29，NE分別為1.15和1.41；PIC均小于0.25，說(shuō)明此群體處于低度多態(tài)；χ20.05值均小于5.99，說(shuō)明此群體處于H-W平衡（P＞0.05）。

2.2.2 基因效應(yīng)分析 由表3可見(jiàn)，NCOA1基因在經(jīng)產(chǎn)母豬中表現(xiàn)出正的加性效應(yīng)，而FUT1則相反；NCOA1和FUT1基因在經(jīng)產(chǎn)母豬中都表現(xiàn)出負(fù)的顯性效應(yīng)；在NCOA1基因中，A等位基因在初產(chǎn)母豬中NBA、NHB具有負(fù)效應(yīng)，而B(niǎo)等位基因則相反；B等位基因?qū)?jīng)產(chǎn)母豬TNB、NBA、NHB具有正效應(yīng)；在FUT1基因中，A等位基在初產(chǎn)母豬中對(duì)TNB有負(fù)效應(yīng)，對(duì)NBA和NHB有正效應(yīng)，經(jīng)產(chǎn)母豬中為負(fù)效應(yīng)；G等位基因在初產(chǎn)母豬中表現(xiàn)出負(fù)效應(yīng)，在經(jīng)產(chǎn)母豬中則相反。

2.3 NCOA1和FUT1單個(gè)基因型以及合并基因型＞0.05）；初產(chǎn)母豬合并基因型中各基因型之間均未達(dá)到顯著水平（P＞0.05），但ABAA基因型的TNB、NBA、NHB以及死胎高于其他基因型，合并基因型的各項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)于單基因型。

圖2FUT1基因擴(kuò)增產(chǎn)物PCR-RFLP電泳圖

表2NCOA1和FUT1基因型頻率及等位基因頻率分布

表3NCOA1和FUT1的基因效應(yīng)

2.4 NCOA1和FUT1單個(gè)基因以及合并基因型對(duì)經(jīng)產(chǎn)母豬繁殖性狀的影響 由表5可見(jiàn)，經(jīng)產(chǎn)母豬合并基因型應(yīng)為9種，但由于BB基因型個(gè)體數(shù)較少，表中只列出7種。經(jīng)產(chǎn)母豬NCOA1基因AB型個(gè)體的TNB、NBA、死胎顯著高于AA型個(gè)體（P＜0.05），AB型個(gè)體的TNB、NBA、死胎比AA型分別多0.49、0.37、0.11頭；經(jīng)產(chǎn)母豬FUT1基因AA型個(gè)體的TNB、NBA、NHB以及初生窩重顯著高于AG型和GG型（P＜0.05），AA型的TNB比AG型和GG型多1.15、1.06頭，NBA多1.23、1.11頭，NHB多1.15、1.01頭，初生窩重重多1.64、1.35 kg；合并基因型AAAA型和ABAG型的TNB、NHB與AAAG型差異顯著（P＜0.05）；AAAA型個(gè)體的NBA比AAAG高1.19頭（P＜0.05）；ABAG型個(gè)體的死胎顯著高于AAAG型（P＜0.05）；AAAA型個(gè)體的初生窩重顯著高于AAAG和AAGG型個(gè)體（P＜0.05）。

表4NCOA1和FUT1不同基因型對(duì)初產(chǎn)母豬繁殖性狀的影響

表5NCOA1和FUT1不同基因型對(duì)經(jīng)產(chǎn)母豬繁殖性狀的影響

3 討 論

繁殖性能與豬場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)效益息息相關(guān)，常規(guī)的育種技術(shù)使豬的許多生產(chǎn)性狀得到了改變，但對(duì)產(chǎn)仔數(shù)等低遺傳力的性狀改變卻很低。核受體輔激活蛋白的作用是通過(guò)其結(jié)合DNA上的核受體相互作用并增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性。組蛋白乙酞基轉(zhuǎn)移酶的活性誘使輔激活蛋白增強(qiáng)核受體的轉(zhuǎn)錄活性，而且可以提供結(jié)合位點(diǎn)而形成穩(wěn)定的起始前復(fù)合物[11]。因此，NCOA1蛋白可以調(diào)節(jié)與豬繁殖性狀有關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，從而影響這些基因的表達(dá)，進(jìn)而影響豬的生產(chǎn)情況。FUT1基因型為AA型的豬能夠抗大腸桿菌F18（ETECF18）的侵染，而AG型與GG型的豬對(duì)ETECF18易感。因此，研究探討其合并基因型對(duì)產(chǎn)仔數(shù)影響的遺傳效應(yīng)將更有利于利用標(biāo)記輔助選擇對(duì)豬種進(jìn)行遺傳改良。

本研究以685頭大白豬6胎共2 849胎次為實(shí)驗(yàn)群體，樣本含量及分布符合統(tǒng)計(jì)學(xué)要求，群體處于H-W平衡、低度多態(tài)（PIC＜0.25），2種基因均存在多態(tài)性。NCOA1、FUT1單基因型以及合并基因型遺傳特性，在所檢測(cè)群體中，NCOA1和FUT1基因有AA、AB、BB以及AA、AG、GG基因型。NCOA1、FUT1基因所測(cè)得基因型頻率、基因頻率分布與施啟順等[12]、張新銀等[13]報(bào)道結(jié)果一致。魯慧文等[14]研究結(jié)果表明，NCOA1基因在產(chǎn)仔數(shù)和窩產(chǎn)NBA上出現(xiàn)AA＞AB＞BB；任廣志等[15]研究表明，豫南黑豬在TNB、NBA上呈現(xiàn)AA＞AB＞BB趨勢(shì)。本研究結(jié)果表明，經(jīng)產(chǎn)母豬NCOA1基因型AA型與AB型之間TNB、NBA、NHB差異顯著,且AB高于AA；本研究結(jié)果與其不一致，這可能是因?yàn)榄h(huán)境效應(yīng)，季節(jié)效應(yīng)以及胎次效應(yīng)等因素造成，另外飼養(yǎng)條件以及妊娠管理不當(dāng)也可造成此結(jié)果。包文斌[16]對(duì)豬FUT1基因多態(tài)性與產(chǎn)仔性能進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)AA型個(gè)體產(chǎn)仔數(shù)高于GG和AG型個(gè)體，本研究中經(jīng)產(chǎn)母豬產(chǎn)仔數(shù)與其報(bào)道結(jié)果一致。

NCOA1和FUT1合并基因型分析報(bào)道還未見(jiàn)定論。本研究分析合并基因型后發(fā)現(xiàn)，經(jīng)產(chǎn)母豬中由2個(gè)優(yōu)良基因型合并后的ABAA仍為最優(yōu)基因型；ABAA型個(gè)體的TNB、NBA以及NHB最高；其中AAAA與AAAG在TNB、NBA、NHB以及初生窩重差異顯著，AAAG與ABAG在TNB、NHB差異顯著且ABAG顯著高于AAAG，而在兩基因的死胎卻是AAAG顯著高于ABAG，AAAA和AAGG之間差異顯著,且AAAA顯著高于AAAGG，從上述結(jié)果中可以看出合并基因型的效應(yīng)明顯高于單基因效應(yīng)[17]。

分析結(jié)果表明，初產(chǎn)母豬的合并基因型的TNB、NBA、NHB以及初生窩重的生產(chǎn)性能要高于單基因型，而在死胎和木乃伊胎則表現(xiàn)為相對(duì)單基因型較低的水平；經(jīng)產(chǎn)母豬也表現(xiàn)為相同的趨勢(shì)，而且經(jīng)產(chǎn)母豬在各項(xiàng)生產(chǎn)指標(biāo)均優(yōu)于初產(chǎn)母豬，以合并基因型AAAA型在各項(xiàng)生產(chǎn)指標(biāo)中表現(xiàn)為優(yōu)于單基因型。

本研究從遺傳效應(yīng)、單基因型和合并基因型分析探討NCOA1和FUT1與繁殖性能的關(guān)系，結(jié)果表明NCOA1和FUT1作為標(biāo)記輔助育種的候選基因?qū)ωi的繁殖性能有著重要的影響，可用于分子育種。

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S828.2

A

10.19556/j.0258-7033.2017-06-058

2016-10-12；

2016-12-29

國(guó)家國(guó)際科技合作項(xiàng)目（2014DFA31840）；石河子大學(xué)動(dòng)植物育種專(zhuān)項(xiàng)（gxjs2013-yz06）

李濤（1990-），男，新疆五家渠人，碩士，研究方向?yàn)閯?dòng)物遺傳育種與繁殖，E-mail：982674883@qq.com

* 通訊作者：黃濤（1978-），男，湖北隨州人，博士，副教授，研究方向?yàn)樨i分子育種，E-mail：taohuang@sina.com