鄱陽湖與青海湖地區(qū)野鳥H9N2亞型禽流感病毒的生物學(xué)特性

（中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

鄱陽湖與青海湖地區(qū)野鳥H9N2亞型禽流感病毒的生物學(xué)特性

蔣文明，侯廣宇，彭 程，王素春，李金平，陳繼明

（中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

為了解我國野鳥中H9N2亞型禽流感病毒的分布與特征，2015—2016年對鄱陽湖與青海湖地區(qū)野鳥中的H9N2病毒進(jìn)行監(jiān)測，結(jié)果共分離到12株H9N2亞型禽流感病毒。對分離的病毒進(jìn)行HA和NA基因序列測定、受體分析和SPF雞、Balb/c小鼠的感染性試驗(yàn)，結(jié)果顯示：12個(gè)分離株的HA裂解位點(diǎn)基序均為PSRSSR/ GLF，符合低致病性禽流感病毒的分子特征；HA蛋白受體結(jié)合位點(diǎn)處第226位氨基酸殘基為亮氨酸（L），具有結(jié)合人樣流感病毒受體的分子特征；受體結(jié)合試驗(yàn)表明，分離毒株既能結(jié)合禽樣受體，也能結(jié)合人樣受體；SPF雞攻毒試驗(yàn)表明，分離株為低致病性毒株；Balb/c小鼠的感染性試驗(yàn)表明，分離株只在小鼠的上呼吸道鼻甲和肺中有限復(fù)制，未見明顯臨床癥狀。

禽流感病毒；H9N2；野鳥感染性

野鳥在禽流感病毒（Avian inf l uenza viruses，AIVs）進(jìn)化和傳播過程中發(fā)揮重要的作用，是AIVs的自然儲存庫[1-2]，H1～H16和N1～N9亞型的A型AIVs都曾在野鳥中被發(fā)現(xiàn)[3]。通常，野鳥感染低致病性AIVs后無癥狀，或僅表現(xiàn)出亞臨床癥狀[4]。隨著野鳥的遷徙，AIVs可被長距離傳播。AIVs多定植于遷徙水禽的腸道中，因此水禽糞便中含有的高濃度病毒[5-6]，可通過糞-口途徑或污染的水，在野生水禽之間或野生水禽與家禽之間傳播[2，7]。

H9N2 AIVs為低致病性病毒，只引起家禽的溫和臨床癥狀。但是自20世紀(jì)90年代末以來，我國發(fā)生了多起人H9N2感染病例。一些H9N2病毒表現(xiàn)出人流感病毒樣受體特性因此H9N2亞型AIVs被認(rèn)為是引起人流感大流行的可能毒株之一。野鳥在一些新型流感事件中被認(rèn)為發(fā)揮了主要作用[2]。研究發(fā)現(xiàn)，19世紀(jì)出現(xiàn)的人流感大流行毒株中含有來自于野鳥源AIVs的基因片段[8]。2013年出現(xiàn)的新型重組人H7N9流感病毒，含有來自于韓國野鴨源AIVs的NA基因，其內(nèi)部基因都來自于禽源H9N2病毒[9]。2014年在江西省出現(xiàn)的人新型H10N8病毒[10]中的H10基因后來被證明是通過鄱陽湖遷徙的野鴨傳入到家養(yǎng)鴨中的，其內(nèi)部基因也都來自于禽源H9N2病毒[11]。因此，監(jiān)測野鳥中的AIVs，對于理解潛在流行毒株的進(jìn)化和出現(xiàn)十分重要。本研究于2015—2016年對鄱陽湖和青海湖地區(qū)的野鳥進(jìn)行了H9N2亞型禽流感監(jiān)測，并對分離的H9N2病毒進(jìn)行了生物學(xué)特性分析，以期了解該亞型病毒在野鳥中的分布、進(jìn)化和生物學(xué)特性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源。2015—2016年在鄱陽湖和青海湖收集野鳥糞便，置于含抗生素的PBS-甘油中，低溫運(yùn)輸、保存。

1.1.2 主要試劑。QIAamp Viral RNA Mini Kit，購自Qiagen公司；HiScript II One Step RT-PCR Kit，購自Vazyme公司；DNA膠回收試劑盒、pMD19-T載體、質(zhì)粒提取純化試劑盒、α2,3-sialidase，購自Takara公司；SPF雞胚，購自濟(jì)南斯帕法斯家禽有限公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)

擴(kuò)增HA和NA基因的引物，根據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)合成[12]。

1.3 病毒分離

將收集的糞便加入含抗生素的PBS后搗碎，12 000 r/min離心5 min，取上清接種10日齡SPF雞胚，37 ℃孵化，96 h后測定雞胚尿囊液的血凝效價(jià)，血凝陰性者繼續(xù)盲傳3代。

1.4 RNA提取

根據(jù)QIAamp Viral RNA Mini Kit操作說明，提取病毒RNA，置-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 一步法RT-PCR

按照HiScript II One Step RT-PCR Kit說明書和已發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)，進(jìn)行反應(yīng)體系的配置和反應(yīng)條件的設(shè)置。利用DNA膠回收試劑盒純化回收PCR產(chǎn)物，然后與pMD19-T載體連接，將陽性重組質(zhì)粒送上海生工進(jìn)行測序鑒定。

1.6 HA基因序列與遺傳進(jìn)化分析

利用Clustal W軟件和MEGA軟件，對HA基因序列進(jìn)行譜系分析，具體方法和參數(shù)設(shè)置參考文獻(xiàn)[13]。

1.7 受體結(jié)合試驗(yàn)

具體方法參考文獻(xiàn)[14]。用PBS制備10%的鵝紅細(xì)胞懸液（Goose red blood cell，GRBC），每100 μL懸液用1.25 U α2,3-sialidase 37 ℃處理1 h，用PBS洗滌2次后配成0.5%的鵝紅細(xì)胞懸液。同樣制備未經(jīng)處理的0.5%的鵝紅細(xì)胞懸液。將病毒2倍比稀釋后，分別與2種等量的0.5%的鵝紅細(xì)胞懸液混合作用，記錄發(fā)生完全凝集的病毒最大稀釋度。

1.8 致病性試驗(yàn)

1.8.1 SPF雞。選取2株病毒P347和QY1139，將其稀釋10倍后，經(jīng)靜脈無菌接種8周齡SPF雞，每天觀察有無臨床癥狀，并采集咽、肛拭子進(jìn)行病毒分離。觀察期結(jié)束后，剖檢觀察組織病變。

1.8.2 Balb/c小鼠。將EID50為106的病毒經(jīng)鼻腔接種6周齡Balb/c小鼠，分別于感染后3 d和5 d，處死5只小鼠。剖檢觀察病變，并采集肺、鼻竇、脾和腦組織樣品進(jìn)行病毒滴定。

2 結(jié)果

2.1 病毒分離與鑒定

從800份糞便樣品中分離出12份血凝陽性毒株。對分離毒株的HA和NA基因進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，獲得與預(yù)期相符的目的片段（圖1）。HA和NA片段測序分析結(jié)果表明，所有毒株均為H9N2亞型AIVs。

圖1 HA基因的RT-PCR擴(kuò)增

2.2 HA基因遺傳進(jìn)化分析

本次分離到的12株野鳥源H9N2病毒都屬于第9.4.2.5分支（以A/chicken/Guangxi/55/2005為代表）。該分支也屬于目前在我國主要流行的H9亞型禽流感譜系。本研究中2015年分離自鄱陽湖的5株病毒（P130、P224、P347、P448、P549）與越南的A/muscovy duck/Vietnam/ LBM675/2014進(jìn)化關(guān)系較近 ；2016年分離自青海湖的7株病毒（QY1009、QY1123、QY1124、QY1128、QY1134、QY1139、QY1140）與A/chicken/ Shanghai/06/2015、A/wild chicken/Shanghai/C1/2014進(jìn)化關(guān)系較近（圖2）。

氨基酸序列分析結(jié)果表明，12株H9N2病毒的HA裂解位點(diǎn)基序?yàn)椤癙SRSSRGLF”，僅有2個(gè)堿性氨基酸，符合低致病性AIVs的分子特征。HA受體結(jié)合位點(diǎn)分析結(jié)果表明，所有毒株的第226位氨基酸均為亮氨酸（L），與人流感相同，具有人樣受體特性。NetNGlyc 1.0 Server預(yù)測分析結(jié)果表明，P130、P224、P347在29、141、218、298、305、313、492位含有7個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)，其他毒株在218位少了1個(gè)糖基化位點(diǎn)。

2.3 受體結(jié)合特性

12株病毒既能與未處理的鵝紅細(xì)胞反應(yīng)，也能與處理過的鵝紅細(xì)胞反應(yīng)。與前者相比，處理后的病毒HA滴度下降了22%～40%（表1），說明這些H9N2亞型AIVs同時(shí)能結(jié)合α2,3-唾液酸和α2,6-唾液酸。

2.4 致病性

圖2 12株野鳥源H9N2病毒HA基因進(jìn)化分析

表1 12株H9N2病毒與α2,3-唾液酸酶處理的鵝紅細(xì)胞（GRBC）反應(yīng)前后HA滴度的變化

將P347和QY1139靜脈接種SPF雞后，在觀察期內(nèi)，SPF雞均無明顯的臨床癥狀，靜脈接種致病指數(shù)（IVPI）為0。剖檢發(fā)現(xiàn)，部分雞心包積液、肝臟腫大、十二指腸充血，個(gè)別雞胸腔內(nèi)有炎性滲出物，其他器官未見明顯肉眼病變。咽肛混合拭子病毒分離為陽性，表明這2株毒株都可感染雞并排毒。

將P347和QY1139鼻腔接種小鼠后，剖檢組織均無肉眼可見病理變化。病毒接種3 d后進(jìn)行病毒分離滴定，在鼻甲和肺中分離到病毒，在其他組織，如腦、肝、脾組織中均未分離到病毒（表2）。

表2 P347和QY1139對雞和小鼠的致病性

3 討論

2013年—2016年6月，我國內(nèi)地共報(bào)告發(fā)現(xiàn)12例人H9N2病例，其中1人死亡。調(diào)查發(fā)現(xiàn)有6人發(fā)病前有活禽市場或活禽環(huán)境暴露史，說明活禽在這些病例的感染中起到了重要作用。野鳥是AIVs的自然儲存庫，病毒可隨其遷徙長距離傳播，并可將病毒傳播給其他水禽和家禽。

為進(jìn)一步了解我國野鳥中H9N2亞型禽流感病毒的感染情況，2015—2016年對鄱陽湖和青海湖地區(qū)的野鳥進(jìn)行了監(jiān)測，共分離到12株病毒。序列分析表明，所有12株病毒的HA裂解位點(diǎn)處僅有2個(gè)堿性氨基酸，屬于低致病性禽流感病毒。HA受體結(jié)合位點(diǎn)分析表明，HA蛋白的第226位大多數(shù)為傾向結(jié)合人源受體的賴氨酸（L）。受體結(jié)合試驗(yàn)也驗(yàn)證了這一點(diǎn)，它們可以同時(shí)結(jié)合人和禽樣受體。為進(jìn)一步分析其生物學(xué)特性，分別選取2株病毒進(jìn)行了感染和致病性試驗(yàn)。SPF雞感染試驗(yàn)結(jié)果表明，2株病毒的靜脈接種指數(shù)（IPVI）均為0，為低致病性禽流感病毒，該結(jié)果與序列分析結(jié)果一致。Balb/c小鼠感染試驗(yàn)結(jié)果表明，病毒可在鼻甲和肺等部分組織中限制性增殖，剖檢組織中均無肉眼可見病理變化，說明這2株病毒對Balb/c小鼠有一定的感染性，但致病性不強(qiáng)。

野鳥是AIVs的重要傳染源[1]，特別是水禽，一直以來都被認(rèn)為是家禽禽流感疫情的潛在感染源[2]，因此監(jiān)測野鳥中的AIVs對于理解潛在流行毒株的進(jìn)化和出現(xiàn)具有重要意義。

[1] YOON S W，WEBBY R J，WEBSTER R G. Evolution and ecology of influenza A viruses[J]. Curr Top Microbiol Immunol，2014，385：359-375.

[2] WEBSTER R G，BEAN W J，GORMAN O T，et al. Evolution and ecology of influenza A viruses[J]. Microbiol Rev，1992，56（1）：152-179.

[3] FOUCHIER R A，MUNSTER V，WALLENSTEN A，et al. Characterization of a novel influenza a virus hemagglutinin subtype（H16）obtained from black-headed gulls[J]. J Virol，2005，79（5）：2814-2822.

[4] JOURDAIN E，GUNNARSSON G，WAHLGREN J，et al. Influenza virus in a natural host，the mallard：experimental infection data[J]. PloS one，2010，5（1）：e8935.

[5] WEBSTER R G，YAKHNO M，HINSHAW V S，et al. Intestinal influenza：replication and characterization of influenza viruses in ducks[J]. Virology，1978，84（2）：268-278.

[6] SLEMONS R D，EASTERDAY B C. Virus replication in the digestive tract of ducks exposed by aerosol to type-A inf l uenza[J]. Avian dis，1978，22（3）：367-377.

[7] ROCHE B，LEBARBENCHON C，GAUTHIER-CLERC M，et al. Water-borne transmission drives avian inf l uenza dynamics in wild birds：The case of the 2005–2006 epidemics in the Camargue area[J]. Infect Genet Evol，2009，9（5）：800-805.

[8] WOROBEY M，HAN G Z，RAMBAUT A. A synchronized global sweep of the internal genes of modern avian influenza virus[J]. Nature，2014，508（7495）：254-257.

[9] LIU D，SHI W，SHI Y，et al. Origin and diversity of novel avian influenza A H7N9 viruses causing human infection：phylogenetic，structural，and coalescent analyses[J]. Lancet，2013，381（9881）：1926-1932.

[10] CHEN H，YUAN H，GAO R，et al. Clinical and epidemiological characteristics of a fatal case of avian inf l uenza A H10N8 virus infection：a descriptive study[J]. Lancet，2014，383（9918）：714-721.

[11] MA C，LAM T T，Chai Y，et al. Emergence and evolution of H10 subtype influenza viruses in poultry in China[J]. J Virol，2015，89（7）：3534-3541.

[12] HOFFMANN E，STECH J，GUAN Y，et al. Universal primer set for the full-length amplification of all influenza A viruses[J]. Arch Virol，2001，146（12）：2275-2289.

[13] 尚飛雪，劉朔，蔣文明，等. 近年來中國H9亞型禽流感分離株譜系分析[J]. 中國動物檢疫，2012，29（4）：51-53.

[14] SUPTAWIWAT O，KONGCHANAGUL A，CHAN-IT W，et al. A simple screening assay for receptor switching of avian inf l uenza viruses[J]. J Clin Virol，2008，42（2）：186-189.

（責(zé)任編輯：朱迪國）

Biological Characteristics of H9N2 Subtype Avian Inf l uenza Virus in Wild Birds in Poyang Lake and Qinghai Lake

Jiang Wenming，Hou Guangyu，Peng Cheng，Wang Suchun，Li Jinping，Chen Jiming
（China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032）

To investigate the distribution and characteristics of H9N2 subtype avian influenza virus（AIV） in wild birds in China，the surveillance was carried out in Poyang Lake and Qinghai Lake during 2015—2016，and 12 avian inf l uenza viruses of subtype H9N2 were isolated. The HA and NA genes of H9N2 isolates were sequenced，the receptor binding assay was conducted，and the infectivity of the isolates were evaluated in SPF chickens and Balb/c mice. Sequence analysis results showed that there was a HA cleavage site of PSRSSR/GLF in all isolates，a characteristic of low pathogenic avian inf l uenza virus. There were esidues Q226 at the HA receptor binding sites in all isolates，a molecular characteristic of influenza virus receptor associated with human like. The receptor binding assay results showed that all isolates could bind not only avian-like but also human-like receptors. The challenge experiment of SPF chickens showed that all isolates were low pathogenic. The infectious experiments results in mice showed that the isolates were able to be replicated only in the nasal turbinate and lungs of mice，and there were no apparent clinical signs.

avian inf l uenza virus；H9N2；wild birds infectivity

S852.65

：A

：1005-944X（2017）06-0010-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.06.003

科技部科技基礎(chǔ)性工作專項(xiàng)（2012FY111000）