生物表面活性劑對紅球菌SY095降解正十六烷及細(xì)胞表面性質(zhì)的影響

張曉青，郝建安，任華峰，司曉光，王靜，張雨山

國家海洋局 天津海水淡化與綜合利用研究所，天津 300192

生物表面活性劑對紅球菌SY095降解正十六烷及細(xì)胞表面性質(zhì)的影響

張曉青，郝建安，任華峰，司曉光，王靜，張雨山

國家海洋局 天津海水淡化與綜合利用研究所，天津 300192

目的：研究紅球菌SY095產(chǎn)生物表面活性劑對正十六烷的溶解性、微生物降解正十六烷的效率、菌體生長及菌體表面疏水性的影響。方法：測定添加不同生物表面活性劑的降解體系中菌體生物量、細(xì)胞表面疏水性、正十六烷含量的變化。結(jié)果：生物表面活性劑對疏水性底物正十六烷具有很強(qiáng)的增溶作用，可以顯著提高正十六烷的表觀溶解度；生物表面活性劑對正十六烷的生物降解具有促進(jìn)作用，添加量為100 mg/L時，96 h正十六烷去除率達(dá)93.32%；生物表面活性劑能明顯促進(jìn)紅球菌SY095生長，添加量為300 mg/L時，菌株32 h生物量為未添加生物表面活性劑對照組的2.7倍；生物表面活性劑還能引起紅球菌SY095菌體表面疏水性明顯增大，添加量為25 mg/L時，菌株對數(shù)生長期BATH值達(dá)66.94%，高于未添加生物表面活性劑對照組的42.99%。結(jié)論：生物表面活性劑可以增加菌體的表面疏水性，促進(jìn)微生物對正十六烷的生物降解。

生物表面活性劑；增溶作用；生物降解；生長促進(jìn)；細(xì)胞表面疏水性

隨著海洋經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展和人們海洋活動的增加，海洋污染正在日益加劇，其中難降解疏水性有機(jī)物的污染問題突出。疏水性有機(jī)物進(jìn)入海洋環(huán)境后，由于其溶解度低，持續(xù)時間長，能通過食物鏈進(jìn)入人體，給海洋環(huán)境和人類健康帶來嚴(yán)重危害。據(jù)統(tǒng)計，2015年春、夏、秋、冬季石油類含量超過第一、二類海水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的海域面積分別為9410、19560、15580和14930平方公里。

微生物修復(fù)技術(shù)具有低成本、高效、環(huán)保等優(yōu)點，已成為去除石油類污染的重要手段，發(fā)展?jié)摿薮骩1]。但石油烴類中疏水性較強(qiáng)的長鏈烷烴和芳香烴等化合物水溶性差限制了其生物修復(fù)效率[2]。表面活性劑可以提高疏水性污染物在水相中的表觀溶解度，增加這類污染物與微生物的接觸面積，加強(qiáng)有機(jī)相和水相的傳質(zhì)，從而提高污染物的生物可利用性[3]。生物表面活性劑是微生物生長代謝的活性產(chǎn)物，與化學(xué)表面活性劑相比具有更好的環(huán)境兼容性，有利于微生物的降解，因此生物表面活性劑作為一種石油助解劑成為研究熱點[4]。目前研究最多的生物表面活性劑為鼠李糖脂，據(jù)文獻(xiàn)報道，鼠李糖脂對疏水性烴類有機(jī)物（如菲、芘等）增溶作用顯著[5-6]，能促進(jìn)降解菌生長[7-8]，改變菌體表面疏水性[9]，從而加快石油烴的生物修復(fù)進(jìn)程。

我們通過研究紅球菌SY095所產(chǎn)生物表面活性劑對疏水性污染物增溶作用，考察添加生物表面活性劑后其對降解菌生長、細(xì)胞表面疏水性及污染物降解效率的影響，探討生物表面活性劑在強(qiáng)化烴類污染物生物降解過程中與微生物的相互作用，為生物表面活性劑在生物修復(fù)中的應(yīng)用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

紅球菌SY095（Rhodococcussp.）由本實驗室分離鑒定，GenBank登錄號為GU184127[10]。正十六烷（純度≥95%，天津艾勒科技公司）；氯仿、甲醇等無機(jī)溶劑（分析純，天津市江天化工技術(shù)有限公司）；正十六烷標(biāo)物（99.9%純度，山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司）。

種子培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，去離子水1 L，初始pH7.0～7.5。

無機(jī)鹽培養(yǎng)液（/L）：K2HPO41.0 g，KH2PO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CO（NH2）22.0 g，大豆油2%，初始pH7.5。

正十六烷培養(yǎng)基：將無機(jī)鹽培養(yǎng)基中的大豆油換成正十六烷，添加量為0.5%。

1.2 種子液的制備

將SY095接種于LB液體培養(yǎng)基中，30℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，D600nm達(dá)1.80±0.05。

1.3 生物表面活性劑的分離與提純

按2%接種量將紅球菌SY095轉(zhuǎn)接到無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，30℃、160 r/min培養(yǎng)48 h，發(fā)酵液用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值為2.0±0.2，4℃靜置過夜；將酸沉淀后的發(fā)酵液10 000 r/min離心10 min，收集離心管中的懸浮物，用同等體積的氯仿∶甲醇（2∶1）抽提2～3次，合并抽提液，在60℃條件下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，最終體積7～10 mL，于70℃烘箱中將有機(jī)溶液完全揮發(fā)，得到表面活性劑制品，儲于4℃冰箱中[11]。

1.4 生物表面活性劑乳化增溶實驗

在100 mL含不同濃度表面活性劑的溶液中加入0.5 mL正十六烷，25℃、160 r/min振蕩24 h，靜置24 h，吸取下層水溶液5 mL，用等體積正己烷萃取2～3次，合并有機(jī)相濃縮至5 mL，利用氣相色譜法測定正十六烷含量。

1.5 生物表面活性劑強(qiáng)化紅球菌SY095降解正十六烷實驗

在100 mL正十六烷培養(yǎng)基（添加量0.5%）中添加生物表面活性劑，其終濃度分別為0、25、50、75、100、50、200、300 mg/L，接種量為4%，30℃、160 r/min搖床培養(yǎng)4 d，定期測定菌體生物量、細(xì)胞表面疏水性和正十六烷的降解率。

1.6 正十六烷測定

正十六烷測定采用安捷倫6890N氣相色譜儀，用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)鑒定并計算正十六烷的降解率。采用毛細(xì)管氣相色譜柱（Phenyl Methyl Siloxane HP-5），載氣為99.99%氮氣，進(jìn)樣口溫度250℃，分流比30∶1，檢測器溫度300℃，氫氣流量30 mL/ min，空氣流量300 mL/min，進(jìn)樣量1μL。初始160℃，保留1 min，以20℃/min升溫至260℃，保留6 min[12]。

1.7 細(xì)胞表面疏水性的測定

菌體表面疏水性采用BATH（bacterial adhesion to hydrocarbons，細(xì)菌對碳?xì)浠衔锏酿じ剑┓椒y定[13]。取不同培養(yǎng)時間的發(fā)酵液，4℃、6000 r/min離心8 min，收集菌體細(xì)胞，用無機(jī)鹽培養(yǎng)基洗滌2次，再重懸于其中，菌懸液D400nm約為1.0；取4 mL菌懸液和1 mL正十六烷加入20 mL離心管中，蓋緊蓋子后快速振蕩60 s，室溫放置30 min，吸取底層水相，測其D400nm值；按下式計算表面疏水性A：

其中T0為吸附前菌液的D400nm值，T1為吸附后菌液的D400nm值。每個樣品測3次，結(jié)果取平均值。

1.8 菌體生物量測定

取不同培養(yǎng)時間的培養(yǎng)液5 m L，8000 r/min離心5 min，收集菌體細(xì)胞，用去離子水洗滌2次，再重懸于等體積的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，測定其D600nm值。

2 結(jié)果

2.1 生物表面活性劑對正十六烷的增溶作用

紅球菌SY095產(chǎn)生物表面活性劑對長鏈烷烴正十六烷的增溶作用見圖1，可知生物表面活性劑的增溶作用明顯，正十六烷在水相中的溶解度隨著生物表面活性劑濃度的增加而增大。生物表面活性劑的濃度低于臨界膠束濃度值（CMC= 68.3 mg/L）時，正十六烷在水相中的溶解度從0.12增大到59.83 mg/L，這主要由于烷烴與表面活性劑疏水基團(tuán)相互作用降低油/水界面張力，從而增加烷烴在水相中的溶解度[14]；生物表面活性劑濃度從臨界膠束濃度值提高到300 mg/L時，正十六烷在水相中的溶解度從59.83增加到125.12 mg/L。

2.2 生物表面活性劑作用下正十六烷的生物降解

添加不同濃度生物表面活性劑后紅球菌SY095對正十六烷的降解效果見圖2?？梢钥闯?，與未添加生物表面活性劑的降解體系相比，加入一定量的生物表面活性劑可以大大提高正十六烷的降解效率。培養(yǎng)96 h時，添加生物表面活性劑濃度為25、50、75、100、150、200、300 mg/L，培養(yǎng)液中正十六烷的去除率比未添加生物表面活性劑體系分別增加了8.3%、12.8、15.2%、18.4%、18.2%、18.8%和19.9%。高濃度生物表面活性劑（100～300 mg/L）體系中，正十六烷的降解率顯著提高，24 h正十六烷去除率達(dá)30%，72 h降解率都在93%以上。正十六烷降解率的顯著提高，一方面因為生物表面活性劑對正十六烷增溶作用，為菌體和正十六烷的接觸提供有利條件，從而促進(jìn)正十六烷的降解；另一方面可能是生物表面活性劑和降解菌株SY095之間相互作用，使得微生物細(xì)胞表面性質(zhì)發(fā)生改變，更容易攝取難溶疏水性的物質(zhì)，從而促進(jìn)底物的降解[15]。

圖1 紅球菌SY095產(chǎn)生物表面活性劑對長鏈烷烴正十六烷的增溶作用

圖2 生物表面活性劑對正十六烷的生物降解的影響

2.3 生物表面活性劑對紅球菌SY095生長的影響

在紅球菌SY095的正十六烷培養(yǎng)基中加入一定量的生物表面活性劑，不同條件下菌株D600nm值的變化見圖3。培養(yǎng)24 h時，紅球菌SY095生長緩慢，處于生長延滯期，不同條件下菌株生物量D600nm值都在0.3左右；24 h后，菌株適應(yīng)了培養(yǎng)基環(huán)境，進(jìn)入快速生長期，且添加了生物表面活性劑菌株生物量快速增加，其中添加量為300 mg/L菌株培養(yǎng)32 h時D600nm值達(dá)0.824，未添加菌株D600nm值僅為0.305，因此生物表面活性劑可以顯著加快菌株的生長，促進(jìn)菌株快速進(jìn)入對數(shù)生長期；隨后56 h菌株進(jìn)入生長穩(wěn)定期和衰亡期。從圖3還可以看出，菌株最大生物量隨培養(yǎng)液中生物表面活性劑濃度的增加而變大，其中添加量為200和300 mg/L最大生物量（D600nm值）分別達(dá)到1.988和2.022。

2.4 生物表面活性劑對紅球菌細(xì)胞疏水性的影響

圖3 生物表面活性劑對紅球菌SY095生長的影響

圖4 生物表面活性劑對紅球菌SY095菌體細(xì)胞表面疏水性的影響

添加不同濃度的生物表面活性劑，菌株細(xì)胞疏水性隨時間的變化見圖4?？梢钥闯?，在未添加生物表面活性劑培養(yǎng)基中，菌株SY095表面疏水性隨培養(yǎng)時間的增加而逐漸增大，從開始的11.2%增加到72 h的42.99%，之后略有下降，這時細(xì)胞疏水性增大主要是由于疏水性底物正十六烷的誘導(dǎo)作用，菌體細(xì)胞為了適應(yīng)疏水性環(huán)境而改變細(xì)胞性質(zhì)[16]。添加了生物表面活性劑后紅球菌SY095在正十六烷培養(yǎng)基中的BATH明顯增大，當(dāng)添加量為300 mg/L時，菌株在對數(shù)生長期中BATH值高達(dá)79.22%，之后略有下降，96 h時仍為51.03%，均高于未添加生物表面活性劑的BATH。生物表面活性劑可以與菌體細(xì)胞相互吸附，改變菌體表面的吸附特性，從而改變菌體與疏水性有機(jī)物間的親和力，使降解菌株更好地攝取疏水性的底物，加速其降解速率。在菌株生長后期，細(xì)胞表面疏水性下降，這可能是因為隨著微生物進(jìn)入生長衰退期，菌體細(xì)胞表面疏水位點減少，同時分泌一些脂肪酸和脂類物質(zhì)，改變自身表面疏水性[17]。

3 討論

生物表面活性劑是由微生物在一定培養(yǎng)條件下代謝分泌的具有表面生物活性的物質(zhì)，具有低毒、易降解等優(yōu)點，可以顯著提高疏水性污染物在水相中的表觀溶解度，增加疏水性有機(jī)物與微生物的接觸面積，從而提高污染物的生物可利用性。我們選取紅球菌SY095產(chǎn)生物表面活性劑，通過增溶實驗和降解實驗，研究該表面活性劑對正十六烷的增溶作用、降解菌生長、菌體細(xì)胞表面疏水性及疏水性底物降解效率的影響。

本實驗中紅球菌SY095產(chǎn)生物表面活性劑對正十六烷的增溶作用明顯，正十六烷在水相中的溶解度隨生物表面活性劑濃度的增加而增大。當(dāng)濃度較低時，生物表面活性劑主要以單體形式存在，烷烴溶解度增加主要是由于烷烴與生物表面活性劑疏水基團(tuán)間相互作用；當(dāng)濃度大于臨界膠束濃度值時，其親水基團(tuán)向外伸向水相，疏水基團(tuán)向內(nèi)形成膠束，增溶作用主要是通過膠束將疏水性烷烴包裹在膠束內(nèi)核區(qū)域，使其在水相中的表觀溶解度增加[18]。

微生物菌體表面疏水性強(qiáng)有利于微生物與細(xì)胞底物的接觸，增加微生物細(xì)胞與疏水性基質(zhì)之間的親和力，提高其降解速率，而在降解體系中加入生物表面活性劑可以使菌體表面疏水性發(fā)生變化。馬霞[12]等研究表明，在石油烴生物降解過程中，鼠李糖脂能夠促進(jìn)菌株生長，增加菌體的表面疏水性，加快烴類的傳質(zhì)速率，從而加速環(huán)境的生物修復(fù)速度。姜萍萍[14]等發(fā)現(xiàn)鼠李糖脂可顯著促進(jìn)降解菌GP3生長，且在降解初期細(xì)胞表面疏水性顯著增加，有利于微生物攝取有機(jī)底物，加速芘的生物降解。在本研究中，與未添加生物表面活性劑的降解體系相比，加入一定量的生物表面活性劑可以提高正十六烷的降解效率，加快菌株的生長，促進(jìn)菌株快速進(jìn)入對數(shù)生長期，且菌株最大生物量隨培養(yǎng)液中生物表面活性劑濃度的增加而變大。同時，培養(yǎng)基中添加了生物表面活性劑后紅球菌SY095在正十六烷培養(yǎng)基中的BATH值明顯增大。因此，紅球菌SY095產(chǎn)生物表面活性劑可以顯著提高正十六烷表觀溶解度，促進(jìn)降解菌生長，改變降解菌細(xì)胞表面疏水性，使菌體更好攝取疏水性底物，從而提高正十六烷的生物降解效率。

[1]馬超,劉光全,趙林,等.表面活性劑在油污土壤修復(fù)中的應(yīng)用[J].污染防治技術(shù),2013,26(5):55-59.

[2]朱生鳳,梁生康,吳亮,等.鼠李糖脂及其產(chǎn)生菌對原油生物降解影響研究[J].環(huán)境科學(xué)與技術(shù),2010,33(5): 15-20.

[3]Mulligan C N,Yong R N,Gibbs B F.Surfactant-enhanced remediation of contaminated soil:a review[J]. Eng Geol,2001,60(4):371-380.

[4]Bognolo G.Biosurfantants as emulsifying for hydrocarbons[J].Colloids Surfaces A,1999,15(1-2):41-52.

[5]李琦,黃廷林,宋進(jìn)喜.生物表面活性劑對疏水性有機(jī)物的增溶特性[J].化學(xué)工程,2011,39(9):1-5.

[6]Doong R A,Lei W G.Solubilization and mineralization of polycyclic aromatic hydrocarbons by pseudomonas putida in the presence of surfactant[J].J Hazardous Materials,2003,96(1):15-27.

[7]Sotirova A,Spasova D,Vasileva-Tonkova E,et al.Effects of rhamnolipid biosurfactant on cell surface of Pseudomonas aeruginosa[J].Microbiol Res,2009,164(3): 297-303.

[8]陳廷君,王紅旗,王然,等.鼠李糖脂對微生物降解正十六烷以及細(xì)胞表面性質(zhì)的影響[J].環(huán)境科學(xué),2007, 28(9):2117-2122.

[9]姜萍萍,郭楚玲,黨志,等.鼠李糖脂與疏水性底物及其降解菌的相互作用[J].環(huán)境科學(xué),2011,32(7):2144-2150.

[10]任華鋒,張雨山,王靜,等.石油烴降解菌的分離鑒定及其產(chǎn)生乳化劑條件[J].化學(xué)工業(yè)與工程,2010,27(3): 189-194.

[11]張曉青,郝建安,司曉光,等.響應(yīng)面法優(yōu)化紅球菌產(chǎn)生物表面活性劑的發(fā)酵條件[J].生物加工過程,2016,14 (4):10-13.

[12]馬霞,聶麥茜,盧健,等.鼠李糖脂對銅綠假單胞菌NY3表面特性及其烴降解效率的影響[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報,2014,34(10):2462-2468.

[13]Zhang Y,Miller R M.Effect of a pseudomonas rhamnolipid biosurfactant on cell hudrophobicity and biodegradation of octadecane[J].Appl Environ Microlobiol,1994,60(6):2201-2106.

[14]姜萍萍,黨志,盧桂寧,等.鼠李糖脂對假單胞菌GP3A降解芘的性能及細(xì)胞表面性質(zhì)的影響[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報,2011,31(3):485-491.

[15]Owsianiak M,Szulc A,Chrzanowski L,et al.Biodegradation and surfactant-mediate biodegradation of dieselfuel by 218 microbial consortia are not correlated to cell surface hydrophobicity[J].Appl Microbiol Biotechnol,2009,84:545-553.

[16]Whyte L G,Slagmna S J,Pietrantonio F,et al.Physiological adaptations involved in alkane assimilation at a low temperature by Rhodococcussp.strain Q15[J]. Appl Environ Microbiol,1999,65(7):2961-2968.

[17]趙晴,張甲耀,陳蘭洲,等.疏水性石油烴降解菌細(xì)胞表面疏水性及降解特性[J].環(huán)境科學(xué),2005,25(5):132-136.

[18]郭利堅,蘇榮國,梁康生,等.鼠李糖脂生物表面活性劑對多環(huán)芳烴的增溶作用[J].環(huán)境化學(xué),2009,28(4): 510-514.

Effects of Biosurfactant Produced by Rhodococcus SY 095 on the Biodegradation of n-Hexadecane and the Cell Surface Hydrophobicity

ZHANG Xiao-Qing,HAO Jian-An,REN Hua-Feng, SI Xiao-Guang,WANG Jing*,ZHANG Yu-Shan

Institute of Seawater Desalination and Multi-purpose Utilization,SOA,Tianjin 300192,China

*Corresponding author,E-mail:Wang_nana@163.com

Objective:To study the effects of biosurfactant produced byRhodococcusSY095 on the biodegradation efficiency of n-hexadecane,the solubility of n-hexadecane,the growth of bacteria and the cell surface hydrophobicity.Methods:The cell biomass ofRhodococcusSY095,cell surface hydrophobicity and n-hexadecane content in different biosurfactant degradation systems were determ ined.Results:The results showed that the solubility of n-hexadecane was enhanced significantly by biosurfactant.The degradation of n-hexadecane was accelerated with biosurfactant.With 100 mg/L of biosurfactant,the average degradation rate of n-hexadecane in 96 h could reach 93.32%.The biosurfactant could promote the growth ofRhodococcusSY095.Compared with the control group,the biomass ofRhodococcusSY095 increased 2.7 times in 32 h by adding 300 mg/L biosurfactant.The cell surface hydrophobicity ofRhodococcusSY095 was enhanced significantly also by adding biosurfactant.The cell sur-face hydrophobicity reached 66.94%in logarithmic growth phase by adding 25 mg/L biosurfactant,while that the absence of biosurfactant was only 42.99%.Conclusion:The biosurfactants could enhance the cell surfaces hydrophobicity of SY095 and promoted the biodegradation of the n-hexadecane.

biosurfactant;solubility enhancement;biodegradation;growth promotion;cell surface hydrophobicity

Q939.9

A

1009-0002（2017）03-0328-05

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.03.017

2016-12-06

海洋公益性行業(yè)科研專項（201305022）；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項（K-JBYWF-2015-G16，K-JBYWF-2015-T11，K-JBYWF-2016-T9）

張曉青（1983-），女，工程師，（E-mail）radicle@163.com

王靜，（E-mail）Wang_nana@163.com