Pin1與CyclinD1在胃腸間質(zhì)瘤中的表達(dá)及臨床意義

黃子成，陳清，翁曉源，楊振榮，陳惠忠，周永建

（1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州市第一醫(yī)院消化內(nèi)科，福建泉州362200；2.福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院胃外科，福州350001；3.惠安縣醫(yī)院普通外科，福建惠安362100）

Pin1與CyclinD1在胃腸間質(zhì)瘤中的表達(dá)及臨床意義

黃子成1，陳清2，翁曉源2，楊振榮2，陳惠忠3，周永建2

（1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州市第一醫(yī)院消化內(nèi)科，福建泉州362200；2.福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院胃外科，福州350001；3.惠安縣醫(yī)院普通外科，福建惠安362100）

目的檢測Pin1與CyclinD1蛋白和mRNA在胃腸間質(zhì)瘤（GIST）中的表達(dá)情況，探討二者與GIST臨床病理特征的相關(guān)性。方法分別采用免疫組化法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測Pin1與CyclinD1蛋白和mRNA在GIST中的表達(dá)情況。結(jié)果Pin1和CyclinD1蛋白在GIST中的表達(dá)率［64.7%（55/85），42.3%（36/85）］高于癌旁組織［26.7%（4/15），6.7%（1/15）］；Pin1和CyclinD1mRNA在GIST組織中的表達(dá)量為癌旁組織中的7.03倍和5.53倍。Pin1蛋白及mRNA的表達(dá)與患者的臨床病理參數(shù)無明顯相關(guān)性，與GIST的NIH分級和腫瘤直徑大小有關(guān)（均P＜0.05）。GIST組織中Pin1與CyclinD1蛋白和mRNA的表達(dá)呈正相關(guān)。結(jié)論P(yáng)in1與CyclinD1蛋白和mRNA在GIST中表達(dá)增加，且二者的表達(dá)呈正相關(guān)，提示二者在GIST的發(fā)生發(fā)展中起協(xié)同作用。

胃腸間質(zhì)瘤；Pin1；CyclinD1；免疫組化；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

胃腸間質(zhì)瘤（gastrointestinal stromal tumor，GIST）是胃腸道中最為常見的間葉源性腫瘤，其發(fā)病機(jī)制與突變有關(guān)。肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶1（peptidylprolyl cis/trans isomerase，NIMA-interacting 1，Pin1）是一種特異的肽基脯氨酰異構(gòu)酶。細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）基因是一種原癌基因，可調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)行有絲分裂和增殖。CyclinD1是Pin1重要的靶基因之一。二者在GIST中的表達(dá)情況及臨床意義尚未明確。本研究通過免疫組化法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分別從蛋白和mRNA水平研究GIST中Pin1和CyclinD1蛋白及mRNA表達(dá)情況及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集2007年至2014年在福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院行手術(shù)切除的GIST的腫瘤組織及癌旁組織石蠟包埋標(biāo)本85例。研究對象均符合GIST的診斷標(biāo)準(zhǔn)，且經(jīng)病理證實(shí)為原發(fā)性GIST；患者術(shù)前均未行放療或化療等輔助治療；且均無合并其他惡性腫瘤。冰凍組織標(biāo)本均為手術(shù)中取得，放置于-80℃液氮中保存。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化：采用ElivisionTMplus免疫組織化學(xué)法。Pin1抗體（sc-15340）購自美國Santa Cruz公司，工作濃度為1∶200；即用型CyclinD1抗體購自北京中杉金橋試劑公司；ElivisionTMplus二抗（KIT-9901）購自福州邁新生物技術(shù)公司。結(jié)果判斷采用Fromowitz的陽性細(xì)胞半定量分級法，每個(gè)切片隨機(jī)觀察5個(gè)高倍視野（×400），先根據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)占腫瘤細(xì)胞總數(shù)的百分比計(jì)分，≤5%為0分，＞5%～25%為1分，＞25%～50%為2分，＞50%～75%為3分，＞75%為4分；再根據(jù)陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度的深淺計(jì)分，不著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分，最后將二者分?jǐn)?shù)相加，≤3分為陰性，＞3分為陽性。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）：采用SYBR GreenⅠ熒光染料法及相對定量的檢測方法，以βactin作為參照基因。UltraSYBR Mixture（With high ROX）購自福州貝爾曼公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購自Thermo公司；RNAiso plus購自日本TaKaRa公司。qRT-PCR的Pin1及CyclinD1引物序列設(shè)計(jì)參照GenBank中撿索到的Pin1基因序列（NM_006221.2）和CyclinD1基因序列（NM_ 053056.2），用Primer3.0設(shè)計(jì)引物，引物序列見表1；引物由金斯瑞生物科技有限公司合成。qRT-PCR的結(jié)果判斷采用2-△△CT（Livak）法行相對基因表達(dá)分析。目的基因和參照基因的擴(kuò)增效率均接近1.95，計(jì)算公式為1.95-△△CT。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列Tab.1 Primer pairs used for qRT-PCR analysis

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法進(jìn)行檢驗(yàn)，用Spearman等級相關(guān)分析Pin1及CyclinD1表達(dá)的相關(guān)性。計(jì)量資料用x±s表示，采用配對樣本t檢驗(yàn)或兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，采用雙變量相關(guān)性分析Pin1與CyclinD1表達(dá)的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化結(jié)果

Pin1蛋白和CyclinD1在GIST組織及癌旁組織中的表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中。Pin1和CyclinD1蛋白在GIST中的表達(dá)率［64.7%（55/85），42.3%（36/85）］明顯高于癌旁組織［26.7%（4/15），6.7%（1/15）］（P＜0.05）。

Pin1蛋白的表達(dá)與患者的性別、年齡、核分裂象、NIH分級、腫瘤直徑大小、腫瘤位置、組織學(xué)類型、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均無明顯相關(guān)性（P＞0.05）（表2）。CyclinD1蛋白表達(dá)與NIH分級和腫瘤直徑大小有關(guān)（P＜0.05），與患者的性別、年齡、核分裂象、腫瘤位置、組織學(xué)類型及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無明顯相關(guān)性（P＞0.05）（表3）。

85例GIST組織中Pin1與CyclinD1蛋白均陽性表達(dá)者29例，均陰性表達(dá)者23例。Spearman等級相關(guān)分析結(jié)果表明GIST中Pin1蛋白與CyclinD1蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.284，P＜0.01）。

2.2 qRT-PCR結(jié)果分析

表2 Pin1蛋白表達(dá)與GIST臨床病理參數(shù)的關(guān)系Tab.2 Relationship between Pin1 protein expression and clinicopathological parameters of GIST

GIST組織和癌旁組織中，Pin1的△CT值分別為6.02±1.13和8.94±1.56，CyclinD1分別為5.62±6.93和8.18±2.00，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。2-△△CT（Livak）法公式計(jì)算結(jié)果顯示，Pin1和CyclinD1 mRNA在GIST組織中的表達(dá)量為癌旁組織中的7.03倍和5.53倍。Pin1mRNA的表達(dá)與患者的性別、年齡、核分裂象、NIH分級、腫瘤直徑大小、腫瘤位置、組織學(xué)類型及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均無明顯相關(guān)性（P＞0.05）；CyclinD1mRNA的表達(dá)與NIH分級、腫瘤直徑大小有關(guān)，與患者的性別、年齡、核分裂象、腫瘤位置、組織學(xué)類型及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無明顯相關(guān)性（P＞0.05）（表4）。

使用雙變量相關(guān)性分析對GIST組織中Pin1與CyclinD1表達(dá)（△CT值）的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，Pin1mRNA與CyclinD1mRNA的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.337，P＜0.05）（圖1）。

3 討論

GIST的發(fā)病機(jī)制被認(rèn)為與C-Kit原癌基因及PDGFR基因的突變有關(guān)，CD117和CD34的陽性表達(dá)為目前診斷GIST的重要指標(biāo)。近年來分子靶向藥物及手術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用明顯改善了GIST的治療效果，但仍然有26%的患者在術(shù)后5年內(nèi)復(fù)發(fā)［1］，因此對GIST的發(fā)病機(jī)制及生物學(xué)行為的進(jìn)一步研究十分必要。

Pin1基因是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的在酵母和人類細(xì)胞的有絲分裂中所必需的肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶［2］。Pin1蛋白可特異地催化磷酸化后的絲/蘇-脯氨酸間肽鍵發(fā)生順反異構(gòu)，從而誘導(dǎo)蛋白質(zhì)構(gòu)象及功能發(fā)生改變。JAMIYANDORJ等［3］通過研究2 041個(gè)人類腫瘤樣本和609個(gè)正常組織的樣本發(fā)現(xiàn)：Pin1在60種不同腫瘤中的38種中呈高表達(dá)，這些腫瘤包含了大部分常見的腫瘤，如前列腺癌、乳腺癌、宮頸癌、肝癌、肺癌等。CyclinD1基因是一種致癌基因，對細(xì)胞周期的調(diào)控起重要作用。研究［4］表明CyclinD1在多種腫瘤組織中過度表達(dá)。有研究［5］發(fā)現(xiàn)約51%的GIST患者CyclinD1過表達(dá)，且表達(dá)水平與預(yù)后相關(guān)。CyclinD1是Pin1的重要靶基因之一。Pin1可通過多種途徑使CyclinD1表達(dá)增加，包括通過Ras/Neu-Jun信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)CyclinD1轉(zhuǎn)錄的增加［6-7］，通過直接結(jié)合CyclinD1減少其分解，增加CyclinD1的穩(wěn)定性及其在核內(nèi)的聚積，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期［8］。研究［9］發(fā)現(xiàn)，肺癌和前列腺癌中，Pin1與 CyclinD1的表達(dá)呈正相關(guān)。在敲除Pin1基因的小鼠體內(nèi)CyclinD1呈低表達(dá)，其表型與敲除CyclinD1的小鼠相似［10］。

表3 CyclinD1蛋白表達(dá)與GIST臨床病理參數(shù)的關(guān)系Tab.3 Relationship between CyclinD1 protein expression and clinicopathological parameters of GIST

本研究結(jié)果顯示，Pin1與CyclinD1蛋白及mRNA在GIST中過表達(dá)，提示Pin1與CyclinD1過表達(dá)所導(dǎo)致的細(xì)胞增殖異?？赡茉贕IST的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。CyclinD1的表達(dá)與GIST的NIH分級及腫瘤大小相關(guān)，且隨腫瘤惡性程度和腫瘤直徑的增加而增強(qiáng)，這與相關(guān)文獻(xiàn)［5，11］報(bào)道符合，提示CyclinD1不僅參與了GIST的發(fā)生，可能還與GIST的惡性轉(zhuǎn)變和腫瘤生長相關(guān)。Pin1與CyclinD1蛋白及mRNA表達(dá)呈正相關(guān)，提示Pin1可能通過多種途徑調(diào)節(jié)CyclinD1的表達(dá)，二者相互協(xié)同，對GIST的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生影響。

表4 Pin1和CyclinD1 mRNA表達(dá)與GIST臨床病理參數(shù)的關(guān)系Tab.4 Relationship between expressions of Pin1 and CyclinD1 mRNA and clinicopathological parameters of GIST

圖1 40例GIST患者的CyclinD1△CT與Pin1△CT的散點(diǎn)圖Fig.1 Scatter map of CyclinD1△CT and Pin1△CT in 40 patients with GIST

腫瘤的發(fā)生發(fā)展由多種因素共同作用，本研究結(jié)果表明，Pin1及CyclinD1在GIST的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。近年來的大量研究證明，控制Pin1表達(dá)及其功能可作為治療腫瘤的一個(gè)新途徑，如通過RNA干擾抑制Pin1的表達(dá)可以影響前列腺癌細(xì)胞的增殖速度，降低其轉(zhuǎn)移能力，并可抑制其致瘤性［12］。CyclinD1表達(dá)的檢測可能成為預(yù)測GIST生物學(xué)行為的重要參考指標(biāo)。

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（編輯 王又冬）

Expression and Clinical Significance of Pin1 and CyclinD1 in Gastrointestinal Stromal Tumor

HUANG Zicheng1，CHEN Qing2，WENG Xiaoyuan2，YANG Zhenrong2，CHEN Huizhong3，ZHOU Yongjian2
（1.Department of Gastroenterology，Quanzhou First Hospital of Fujian Medical University，Quanzhou 362200，China；2.Department of Gastric Surgery，Union Hospital，F(xiàn)ujian Medical University，F(xiàn)uzhou 350001，China；3.Department of General Surgery，Hui’an Hospital，Hui’an 362100，China）

Objective To investigate the relationship between Pin1 and CyclinD1 expression and the development of gastrointestinal stromal tumor（GIST）.MethodsThe protein and mRNA expression of Pin1 and CyclinD1 in 85 samples of GIST and adjacent non-cancerous tissues were detected by immunohistochemistry and real-time quantitative polymerase chain reaction.ResultsThe expression rate of Pin1 protein in GIST tissues（64.7%；55/85）was higher than that in adjacent non-cancerous tissues（26.7%；4/15）.Similarly，the expression rate of CyclinD1 protein in GIST tissues（42.3%；36/85）was higher than that in adjacent non-cancerous tissues（6.7%；1/15）.The expression ofPin1andCyclinD1mRNA in GIST tissues was 7.03 and 5.53 times that in adjacent non-cancerous tissues，respectively.There was no obvious correlation between the expression of Pin1 and clinicopathological parameters.The expression of CyclinD1 was positively correlated with the grade of NIH and tumor diameter（P＜0.05）.There was a significant correlation between the expression of Pin1 and CyclinD1 in GIST tissues.ConclusionThe expression of both Pin1 and CyclinD1 was up-regulated in GIST tissues.The significant correlation between the expression of Pin1 and CyclinD1 in GIST tissues suggests that their synergistic effect promotes carcinogenesis and the development of GIST.

gastrointestinal stromal tumor；Pin1；CyclinD1；immunohistochemistry；real-time quantitative polymerase chain reaction

R735.2

A

0258-4646（2017）06-0495-06

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.06.004

國家自然科學(xué)基金（81172380）；福建省衛(wèi)生系統(tǒng)學(xué)術(shù)技術(shù)帶頭人后備人基金（010114201）；國家臨床重點(diǎn)?？平ㄔO(shè)基金［衛(wèi)辦醫(yī)政函（2012）649號］

黃子成（1969-），男，副主任醫(yī)師，本科.

周永建，E-mail：zyjbju@sina.com

2016-10-25

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