影響對葉百部堿純化的主要因素及其工藝優(yōu)化

賀艷慧，張 林，張朝鳳，許翔鴻，張 勉

(中國藥科大學(xué) 生藥學(xué)研究室，江蘇 南京 211198)

影響對葉百部堿純化的主要因素及其工藝優(yōu)化

賀艷慧，張 林，張朝鳳，許翔鴻，張 勉*

(中國藥科大學(xué) 生藥學(xué)研究室，江蘇 南京 211198)

目的：通過對影響對葉百部堿純化因素的研究及優(yōu)化，得到對葉百部堿的最佳純化工藝。方法：在建立HPLC-ELSD法測定對葉百部堿含量的基礎(chǔ)上，采用單因素實驗考察不同pH值、萃取溶劑、萃取次數(shù)和結(jié)晶溶劑對葉百部堿分離純化的影響，篩選最佳純化條件。結(jié)果：對葉百部藥材醇提物酸化離心后，取上清液堿化至pH 8左右，以萃取溶劑為石油醚-乙酸乙酯(1∶1)為萃取溶劑萃取1次得到總堿浸膏?？倝A溶于甲醇中結(jié)晶得到純度大于98%的柱狀晶體。結(jié)論：本實驗得到了一種快速高效獲得對葉百部堿的方法。

對葉百部；對葉百部堿；工藝優(yōu)化

對葉百部(StemonatuberosaLour.)為藥典收載的中藥百部的三大來源之一[1]。中醫(yī)學(xué)認為，百部內(nèi)服可治咳嗽；外用可殺蟲止癢[2]。對葉百部堿(tuberostemonine)是對葉百部中的主要特征性成分[3]?，F(xiàn)代藥理研究表明，對葉百部堿具有鎮(zhèn)咳、麻痹蠕蟲運動性和抑制小龍蝦神經(jīng)肌肉接頭興奮傳導(dǎo)的作用[4-6]。而傳統(tǒng)分離對葉百部堿，都是通過硅膠柱層析的方法，容易造成生物堿的死吸附，使得率降低，無法大量獲得對葉百部堿純品。且從對葉百部中提取其主要成分對葉百部堿工藝過程的研究很少。本文對傳統(tǒng)的純化方法進行了改進和優(yōu)化，得到一種快速高效獲得對葉百部堿的方法，此方法也同樣適用于百部中和對葉百部堿結(jié)構(gòu)相似的生物堿。

1 材料與儀器

1.1 材料

對葉百部堿對照品，實驗室自制，純度大于 98%(HPLC)。對葉百部藥材購自河北安國東方藥城，經(jīng)本人鑒定，中國藥科大學(xué)生藥學(xué)教研室張勉教授核對為百部科植物對葉百部(Stemona tuberosa Lour.)的干燥塊根。甲醇、三乙胺為色譜純，其余試劑為分析純，水為娃哈哈純凈水。

1.2 儀器

Agilent 1200 分析型液相色譜儀，Alltech 3300 ELSD 檢測器；Sartorius 電子分析天平；KH-500DE 超聲波清洗器。

2 方法與結(jié)果

2.1 對葉百部堿含量測定方法學(xué)考察

2.1.1 色譜條件 色譜柱 Agilent Extend C18(4.6 mm× 250 mm，5 μm)；流動相：甲醇(A)-0.1%三乙胺水(B)，梯度洗脫(0～3 min，50%～58% A；3～19 min，58%～75% A)，進樣量10 μl，流速1 mL/min；柱溫30 ℃。漂移管溫度 90 ℃，氮氣流速為 2.2 L/min，增益為 8。

2.1.2 對照品溶液的制備 稱取對葉百部堿約11.6 mg，精密稱定，置于10 mL容量瓶中，加適量甲醇溶解并稀釋至刻度，超聲，搖勻，即得1.16 mg/mL的對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取對葉百部藥材粉末約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇 50 mL，超聲提取 30 min，搖勻，濾過，將殘渣用20 mL甲醇洗兩遍，并入提取液，減壓回收溶劑至干。殘渣加少量色譜甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至 10 mL 量瓶中，加色譜甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取對葉百部堿對照品溶液加甲醇依次稀釋為1.16、0.58、0.232、0.116、0.058和0.023 2 mg/mL，進樣量10 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積。分別以峰面積(Y)的對數(shù)值為縱坐標(biāo)，以對葉百部堿對照品濃度(X)對數(shù)值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程lgY=1.642 LgX+4.599，對葉百部堿在 0.232～11.6 μg 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(R=0.999 9)。

2.1.5 精密度試驗 取0.232 mg/mL的對照品溶液，重復(fù)進樣6次，每次10 μL，測定峰面積，計算RSD為3.27%，說明本法精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗 分別取對葉百部樣品6份，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1.1”項下色譜條件測定，計算 RSD 為 2.64%，說明本法重復(fù)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗 取一份供試品溶液，分別在0、2、4、12小時后進樣測定，計算各峰面積RSD為4.21%，說明供試品溶液中對葉百部堿至少在12小時內(nèi)是穩(wěn)定的。

2.1.8 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量(14.92 mg/g)的對葉百部樣品6份，每份約0.25 g，按其含量的50%、100%和150%三個水平分別加入對葉百部堿對照品，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1.1”項下色譜條件測定，計算平均回收率為103.9%，RSD為4.77%，說明該方法回收率較好。

2.2 對葉百部堿純化工藝研究

2.2.1 對葉百部流浸膏的制備 取對葉百部藥材200 g，用70%乙醇加熱回流提取3次，每次1 h，合并提取液，旋至基本無醇，得到流浸膏，加入流浸膏2倍體積的1%鹽酸溶液得到混懸液，離心得上清液。

2.2.2 影響對葉百部堿純化因素的考察

(1)堿化程度的考察。分別取等量上清液3份，用濃氨水調(diào)pH至7～8、9～10和11～12，分別用等量的乙酸乙酯萃取3次，旋干乙酸乙酯萃取部分，用色譜甲醇溶出，定容于50 mL容量瓶中。按“2.1.1”項下方法測定對葉百部堿含量，結(jié)果見表1。

表1 不同堿化程度下對葉百部堿的含量

注：溶液總量為50 mL。下同。

由表1結(jié)果可知當(dāng)堿化程度為7～8時對葉百部堿的含量最高，當(dāng)pH升高到11～12時，TS的量明顯變少，可能堿性過強對葉百部堿不穩(wěn)定，因此在堿化時應(yīng)將pH的值調(diào)到7～8。

(2)萃取溶劑的考察。分別取等量上清液3份，用濃氨水調(diào)至pH 8，分別用氯仿、乙酸乙酯、乙酸乙酯-石油醚(1∶1)等量萃取3次，HPLC測定含量，結(jié)果見表2。

表2 不同萃取溶劑下對葉百部堿的含量

由表2結(jié)果可知，當(dāng)萃取溶劑為乙酸乙酯：石油醚(1∶1)時，對葉百部堿的含量最高，因此選擇石油醚-乙酸乙酯(1∶1)為最佳萃取條件。

(3)有機溶劑萃取次數(shù)考察。取上清液1份，堿化后用石油醚-乙酸乙酯(1∶1)等量萃取，充分振搖，萃取4次，測量每次萃取溶液中對葉百部堿的含量，結(jié)果見表3。

表3 不同萃取次數(shù)下對葉百部堿的含量結(jié)果

由表3結(jié)果可知，對葉百部堿在第1次萃取中基本能萃取完全，從節(jié)約溶劑和時間的角度考慮，選擇萃取1次即可。

(4)結(jié)晶溶劑的考察。取對葉百部藥材按前述優(yōu)化的方法處理后得到干浸膏，分別取3份等量浸膏，在甲醇、乙醇、甲醇-二氯甲烷中結(jié)晶，只有甲醇中析出對葉百部堿結(jié)晶，純度98.9%，因此選擇結(jié)晶溶劑為甲醇。

(5)純化工藝驗證。分別取對葉百部藥材3份，每份50 g，分別用70%乙醇加熱回流提取3次，每次1 h，旋至無醇味，得到流浸膏，加入流浸膏2倍體積的1%鹽酸溶液得到混懸液，離心得上清液。上清液用濃氨水調(diào)至pH8，用乙酸乙酯-石油醚(1∶1)萃取1次，得到有機層部分，旋干，即得總堿浸膏。總堿浸膏在甲醇中結(jié)晶，得到對葉百部堿單體，分別測定對葉百部堿的純度。總堿浸膏得率的RSD為4.42%，結(jié)晶析出量的RSD為4.43%，對葉百部堿的平均得率為藥材的0.352%，結(jié)果見表4。

表4 純化工藝驗證結(jié)果

3 討 論

本文通過對影響對葉百部堿純化的關(guān)鍵因素的研究，建立了一種快速分離純化對葉百部堿單體的方法。本課題組前期對同批次藥材通過總堿硅膠柱層析得到對葉百部堿，得率約為0.1%，優(yōu)化后工藝的得率為0.352%，得率有較大提高且方法更加簡便。傳統(tǒng)提取對葉百部堿一般堿化到pH10，然而對葉百部中的生物堿一般堿性都較小，本實驗表明堿化到pH 8生物堿已經(jīng)可以游離出來；傳統(tǒng)萃取時一般用乙酸乙酯或氯仿萃取3次，但氯仿毒性較大，本實驗表明用乙酸乙酯-石油醚(1∶1)萃取1次就可基本將對葉百部堿全部萃取出來。百部生物堿類一般極性較小，在甲醇中的溶解度隨著溫度和溶劑量的增加有較大增加，適合作為結(jié)晶溶劑。對葉百部中的生物堿結(jié)構(gòu)都較相似，故本文提供的方法對百部中其他生物堿的提純也具有一定的借鑒意義。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：132-133.

[2] 江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典：上[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1986，858.

[3] GREGER H.Structural relationships，distribution and biological activities of Stemona alkaloids[J].Planta Med，2006，72：99-113.

[4] SHINOZAKI H，ISHIDA M.Inhibitory actions of tuberostemonine on the excitatory transmission at the crayfish neuromuscular junction[J].Brain Research，1985，334：33-40.

[5] TERADA M，SANO M，ISHII A I，et al.Studies on chemotherapy of parasitic helminths(III).Effects of tuberostemonine from Stemona japonica on the motility of parasitic helminths and isolated host tissues[J].Nippon Yakurigaku Zasshi，1982：79：93-103.

[6] ZHOU X，LEUNG P H H，LI N，et al.Oral absorption and antitussive activity of tuberostemonine alkaloids from the roots of Stemona tuberosa.[J].Planta Med，2009，75：575-580.

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Study on Tuberostemonine Purification by Optimizing the Main Influencing Factors

He Yanhui，Zhang Lin，Zhang Chaofeng，Xu Xianghong，Zhang Mian*

Objective：To obtain a quick and efficient way to get tuberostemonine by optimizing key factors in this process.Methods：An HPLC-ELSD method was employed to determine the tuberostemonine content inStemonatuberosaextract.The contents of tuberostemonine were compared under different pH values，extract solvent，extract times and crystalline solvent.Results：The optimal purification conditions were as follows：the acidified ethanol extract was alkalized with ammonia to pH 8，and partitioned with ethyl acetate-petroleum ether(1∶1)for one time to obtain the total alkaloid extract(TAE).The columnar crystals of tuberostemonine could be directly obtained after dissolve the TAE in methanol with the purity more than 98%.Conclusion：A rapid and efficient purification method of tuberostemonine was obtained.

Stemonatuberosa;tuberostemonine;process optimization

10.3969/j.issn.1006-9690.2017.02.005

2016-08-12

國家自然科學(xué)基金資助項目(30772702)。

賀艷慧(1990—)，女，在讀碩士研究生，研究方向：中藥活性成分和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。E-mail：15298376084@163.com

*通訊作者：張勉，女，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：生藥活性成分和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。

R284.2

A

1006-9690(2017)02-0017-03