原兒茶酸與原兒茶醛對(duì)小鼠肝臟細(xì)胞色素P450表達(dá)的影響

張曉燕， 許海淼， 王篤軍， 王 凱， 眭丹娟， 魏 淵

(江蘇大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江，212013)

原兒茶酸與原兒茶醛對(duì)小鼠肝臟細(xì)胞色素P450表達(dá)的影響

張曉燕， 許海淼， 王篤軍， 王 凱， 眭丹娟， 魏 淵*

(江蘇大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江，212013)

目的：研究原兒茶酸和原兒茶醛對(duì)小鼠肝臟細(xì)胞色素P450酶主要亞型表達(dá)水平的影響。方法：將C57BL/6小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(0.9%生理鹽水)、原兒茶酸與原兒茶醛給藥組(6 mg/kg)，苯巴比妥誘導(dǎo)組(80 mg/kg)，每24 h給藥一次，連續(xù)給藥2周。提取肝臟中總RNA，RT-PCR技術(shù)考察藥物對(duì)CYP450主要亞型mRNA 表達(dá)的影響；制備肝微粒體，用Western blot技術(shù)考察P450酶主要亞型的表達(dá)。結(jié)果：RT-PCR結(jié)果顯示，在mRNA水平上，與正常對(duì)照組相比，原兒茶酸可誘導(dǎo)Cyp1a2基因的表達(dá)(P<0.05)，對(duì)Cyp2c37、Cyp2d9的mRNA表達(dá)無(wú)誘導(dǎo)作用。原兒茶醛對(duì)Cyp1a2的mRNA的表達(dá)有誘導(dǎo)作用(P<0.05)，對(duì)Cyp2c37和Cyp2d9的mRNA的表達(dá)無(wú)誘導(dǎo)作用。Western blot結(jié)果顯示原兒茶酸對(duì)CYP1A2，CYP2E1表達(dá)有顯著誘導(dǎo)作用，對(duì)其他幾種亞型無(wú)影響。原兒茶醛對(duì)CYP1A2表達(dá)有顯著誘導(dǎo)作用，對(duì)其他幾種亞型無(wú)影響。Western blot結(jié)果與RT-PCR結(jié)果基本一致。結(jié)論：原兒茶酸與原兒茶醛均可以顯著誘導(dǎo)CYP1A2的mRNA以及蛋白表達(dá)，并且原兒茶酸可以顯著誘導(dǎo)CYP2E1的蛋白表達(dá)。

原兒茶酸；原兒茶醛；細(xì)胞色素P450；表達(dá)水平

原兒茶酸 (Protocatechuic acid) 是天然存在于許多蔬菜和果實(shí)中的一種酚酸類(lèi)物質(zhì)，并且是很多中藥中的活性成分，如四季青[1]、丹參[2]、芙蓉[3]等。大量實(shí)驗(yàn)證明，原兒茶酸具有抗菌、抗氧化、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗血小板凝集、降低心肌耗氧量以及神經(jīng)保護(hù)等多方面藥理作用，是一種重要的天然活性物質(zhì)[4-8]。原兒茶醛 (Protocatechuicaldehyde) 存在于四季青、丹參、鼠尾草等中藥中[9]。原兒茶醛有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、降低心肌氧耗量、抑制血小板聚集、抗腫瘤作用、清除自由基和抗脂質(zhì)過(guò)氧化、抗炎等作用[10]。瘀血證患者單核細(xì)胞趨化游走能力增強(qiáng)，原兒茶醛抑制單核細(xì)胞趨化游走[11]和在趨化游走過(guò)程中產(chǎn)生的IL-8 活性[12]，因此，原兒茶醛是活血化瘀類(lèi)中藥中的重要活性成分之一。

細(xì)胞色素P450(Cytochrome P450)是肝微粒體混合功能氧化酶中最重要的一族，在外源性和內(nèi)源性物質(zhì)的代謝中起著極其重要的作用[13-14]。細(xì)胞色素P450可受多種因素的影響，尤其是藥物，能夠顯著影響藥酶的活性，并引起自身或其他藥物的藥代動(dòng)力學(xué)的改變，使得藥效增強(qiáng)(中毒)或減弱(無(wú)效)，從而導(dǎo)致藥物-藥物相互作用[15]。中藥由于其成分復(fù)雜，療程較長(zhǎng)，長(zhǎng)期應(yīng)用有可能對(duì)肝臟的藥物代謝酶產(chǎn)生影響，影響其他藥物的代謝，相互作用可能使毒性增加和產(chǎn)生不良反應(yīng)。藥物間相互作用引發(fā)的一系列不良反應(yīng)，已經(jīng)引起了醫(yī)藥界的極大關(guān)注[16]。因此，研究中草藥對(duì)細(xì)胞色素P450的影響及中草藥-中草藥或中草藥與有效成分并用或組方制劑的藥物相互作用及機(jī)制，對(duì)促進(jìn)合理配伍用藥并最大限度地避免盲目聯(lián)合用藥所導(dǎo)致的不良后果、保證臨床用藥的有效性和安全性無(wú)疑有著重要意義[17]。酚酸類(lèi)化合物原兒茶酸和原兒茶醛廣泛存在于中草藥中，然而在體內(nèi)對(duì)細(xì)胞色素P450酶表達(dá)的影響鮮有報(bào)道，了解原兒茶酸與原兒茶醛對(duì)P450酶系表達(dá)的影響，對(duì)于了解原兒茶酸與原兒茶醛與其他臨床藥物的相互作用，合理指導(dǎo)臨床用藥具有重要意義。

針對(duì)上述情況，本實(shí)驗(yàn)主要考察了原兒茶酸與原兒茶醛對(duì)細(xì)胞色素P450主要亞型mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響，為闡明原兒茶酸與原兒茶醛在臨床上安全合理用藥提供更多數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)采用健康的SPF級(jí)2月齡C57BL/6小鼠購(gòu)買(mǎi)于南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所，動(dòng)物合格證號(hào)SKXK(蘇)2010-0001。雄性，30只，體質(zhì)量(20±2)g，購(gòu)買(mǎi)后在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后用于正式實(shí)驗(yàn)，室溫22～25 ℃，相對(duì)濕度65%，12h明暗交替照明，自由進(jìn)食、飲水。

1.2 主要試劑及儀器

原兒茶酸(批號(hào)：JZ140306，南京景竹 純度 ≥98%)；原兒茶醛(批號(hào)：JZ140510A，南京景竹 純度≥98%)。cDNA合成試劑盒(Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit)購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher公司；熒光定量試劑盒購(gòu)于羅氏公司(Fast Start Essential DNA Green Master)；PCR引物購(gòu)于上海生工生物技術(shù)有限公司；SDS-PAGE緩沖液、蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)、TEMED、BCA蛋白濃度試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所；ECL發(fā)光液購(gòu)于美國(guó)MILLIPORE公司；抗體：兔抗人CYP1A1(H-70)：sc-20772，鼠抗人CYP1A2 (D1tkt5)：sc-53241，兔抗人CYP2A(H-110)：sc-33214，鼠抗人CYP2B(9.14)：sc-73546，鼠抗人CYPOR(F-2)：sc-55477六種一抗購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司；兔抗人CYP2C(EPR6576)ab137015購(gòu)于美國(guó)Abcam公司；兔抗人CYP2D(PAB19502)購(gòu)于臺(tái)灣Abnova公司；兔抗人CYP2E1(BML-CR3271)購(gòu)于美國(guó)Enzo公司。羊抗鼠和羊抗兔HRP二抗LgG(H+L)，購(gòu)于中國(guó)碧云天生物工程公司，其他為分析純或生化級(jí)試劑。熒光定量PCR儀：羅氏Light Cycle 96熒光定量PCR儀。

2 方 法

2.1 動(dòng)物分組及給藥

將C57BL/6小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(生理鹽水)、原兒茶酸和原兒茶醛(6 mg/kg)給藥組，苯巴比妥誘導(dǎo)(80 mg/kg)，每組5只。精密稱(chēng)取藥品溶于生理鹽水中，給藥時(shí)間為2周，每24小時(shí)灌胃給藥1次。正常對(duì)照組采用生理鹽水按體重給予相當(dāng)量的溶劑對(duì)照液；末次給藥后，隔天禁食12 h，二氧化碳窒息法處死小鼠。

2.2 利用熒光定量PCR(RT-PCR)技術(shù)考察原兒茶酸和原兒茶醛對(duì)小鼠Cyp1a2、Cyp2c37、Cyp2d9基因表達(dá)

以TRIzol提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取小鼠肝組織細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)法測(cè)定RNA在A260/A280的比值，純度A260/A280在1.9～2.0，取總RNA 1 μg，分別加入逆轉(zhuǎn)錄試劑至總體積20 μL混合均勻。反轉(zhuǎn)錄條件為42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min，反應(yīng)產(chǎn)物-20 ℃保存待用。取上述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 (L加入RT-PCR反應(yīng)體系：Real SYBR Mixture(with ROX)10 μL，上、下游引物(10 mol/L)各2 μL，cDNA模板各1 μL，加RNase-free水至20 μL。以β-actin作為內(nèi)參基因，進(jìn)行PCR擴(kuò)增的實(shí)時(shí)定量分析，RT-PCR反應(yīng)條件：Preincubation：95 ℃ 300 s；3 Step Amplification：95 ℃ 15 s， 61 ℃ 20 s，72 30 s；Melting：65 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s；Cooling：37 ℃ 30 s。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用2-ΔΔct法分析得出。RT-PCR引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成(見(jiàn)表1)。

表1 RT-PCR引物

2.3 Western blot法分別測(cè)定細(xì)胞色素P450酶中主要亞型的表達(dá)

隨機(jī)抽取正常對(duì)照組，原兒茶酸，原兒茶醛和苯巴比妥劑量組各3只小鼠，將小鼠肝臟取出稱(chēng)量，用冰冷的0.15 mol/L的KCl沖洗干凈，并用吸水紙吸干，稱(chēng)取適量肝組織剪碎，加入50 mmol/L PBS溶液(含KCl 150 mmol/L，蔗糖250 mmol/L，pH 7.5)，制成5%的組織勻漿。9000×g冷凍離心20 min，上清液100000×g冷凍高速離心60 min，沉淀為肝微粒體。將肝微粒體蛋白中加入80 mmol/L PBS，重懸微粒體，手動(dòng)勻漿器研磨，-80 ℃保存待用。BCA法準(zhǔn)確測(cè)定蛋白濃度，微粒體蛋白提取方法采用的是差速離心法，無(wú)法采用GAPDH和β-actin作為內(nèi)參。按照Western blot法測(cè)定細(xì)胞色素P450酶亞型的表達(dá)，采用Quantity One軟件對(duì)免疫熒光條帶進(jìn)行光密度值分析，比較細(xì)胞色素P450酶亞型表達(dá)的相對(duì)變化。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 小鼠肝臟中細(xì)胞色素P450酶主要亞型mRNA表達(dá)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)采用RT-PCR法考察了原兒茶酸和原兒茶醛對(duì)小鼠肝臟中細(xì)胞色素P450酶主要亞型mRNA的表達(dá)，如圖1中A所示，原兒茶酸對(duì)Cyp1a2的mRNA表達(dá)有上調(diào)作用，說(shuō)明原兒茶酸能夠誘導(dǎo)Cyp1a2的mRNA表達(dá)增加，對(duì)Cyp2c37、Cyp2d9的mRNA表達(dá)無(wú)調(diào)節(jié)作用(圖1 B、C所示)。

圖1 原兒茶酸對(duì)C57BL/6小鼠肝臟中細(xì)胞色素P450 酶主要亞型mRNA的表達(dá)l.)

如圖2中A所示，原兒茶醛對(duì)Cyp1a2的mRNA的表達(dá)有上調(diào)作用，但作用不顯著，說(shuō)明原兒茶醛也可能誘導(dǎo)Cyp1a2的mRNA表達(dá)增加，原兒茶醛對(duì)Cyp2c37、Cyp2d9的mRNA表達(dá)無(wú)調(diào)節(jié)作用(圖2B、C所示)。

圖2 原兒茶醛對(duì)C57BL/6小鼠肝臟中細(xì)胞色素P450 酶主要亞型mRNA的表達(dá)l.)

圖3 原兒茶酸對(duì)C57BL/6小鼠肝臟細(xì)胞色素P450 酶亞型蛋白表達(dá)的影響± S，n=3)

圖4 原兒茶醛對(duì)C57BL/6小鼠肝臟細(xì)胞色素P450 酶亞型蛋白表達(dá)的影響± S，n=3)

3.2 細(xì)胞色素P450酶主要亞型表達(dá)的結(jié)果

通過(guò)免疫熒光結(jié)果結(jié)合吸光度值分析發(fā)現(xiàn)，如圖3中1A2，2E1所示，原兒茶酸對(duì)CYP1A2與CYP2E1蛋白的表達(dá)有誘導(dǎo)作用，且能誘導(dǎo)CYP1A2與CYP2E1表達(dá)顯著升高，說(shuō)明原兒茶酸能夠顯著誘導(dǎo)CYP1A2與CYP2E1蛋白的表達(dá)，對(duì)其他蛋白亞型均無(wú)誘導(dǎo)或者抑制作用。

如圖4中1A2所示，原兒茶醛對(duì)1A2蛋白的表達(dá)有誘導(dǎo)作用，能使CYP1A2蛋白顯著增高，說(shuō)明原兒茶醛能夠顯著誘導(dǎo)1A2蛋白的表達(dá)，對(duì)其他幾種蛋白亞型無(wú)誘導(dǎo)或抑制作用。

4 討 論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)蛋白質(zhì)印記和定量PCR的手段探究藥物對(duì)CYP450酶表達(dá)水平的影響。mRNA的表達(dá)對(duì)酶的含量有影響同時(shí)對(duì)酶的活性有一定的作用，通過(guò)mRNA表達(dá)結(jié)果可以間接了解P450酶的活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明原兒茶酸與原兒茶醛對(duì)CYP450酶幾種主要亞型的mRNA表達(dá)的影響的結(jié)果與其對(duì)蛋白表達(dá)影響的結(jié)果基本一致。原兒茶酸與原兒茶醛對(duì)CYP1A2蛋白的誘導(dǎo)作用明顯，CYP1A2 參與約8.9%臨床藥物的代謝，有咖啡因、非那西丁、氯氮平、茶堿、他克林、丙米嗪、多環(huán)芳烴類(lèi)致癌物以及咪唑喹啉哌等20多種藥物[18]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示與該類(lèi)藥物聯(lián)合使用時(shí)應(yīng)該注意原兒茶酸與原兒茶醛可能導(dǎo)致肝藥酶含量增加，從而降低了藥物半衰期，應(yīng)該適當(dāng)增加給藥劑量。

同時(shí)，原兒茶酸對(duì)CYP2E1蛋白的誘導(dǎo)作用明顯，CYP2E1的外源性底物超過(guò)70 余種, 大部分具有中性、相對(duì)分子質(zhì)量低(< 100)及親脂性較高的特點(diǎn)。CYP2E1也參與代謝和糖異生相關(guān)的多種內(nèi)源性物質(zhì)(酮體和脂肪酸)。CYP2E1酶功能活性可被其底物或非底物的內(nèi)、外源性化合物調(diào)控，如胰島素和乙醇等。CYP2E1被認(rèn)為是機(jī)體對(duì)環(huán)境和工業(yè)毒物或致癌物敏感程度的重要決定因素[19]。此外，一些鹵化麻醉劑包括氟烷，恩氟烷、異氟醚和七氟醚，以及對(duì)乙酰氨基酚、氯唑沙宗、三甲雙酮等多種藥物也主要通過(guò)CYP2E1代謝[20]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示與該類(lèi)藥物聯(lián)合使用時(shí)應(yīng)該注意原兒茶酸可能導(dǎo)致肝藥酶含量增加，從而降低了藥物半衰期，應(yīng)該適當(dāng)調(diào)整給藥劑量。

綜上所述，原兒茶酸與原兒茶醛可顯著誘導(dǎo)CYP1A2的mRNA和蛋白表達(dá)，且原兒茶酸使CYP2E1的蛋白表達(dá)量升高。兩種化合物對(duì)小鼠細(xì)胞色素P450酶的表達(dá)影響，為后續(xù)研究與這兩種化合物相關(guān)的藥物間的相互作用提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。由于藥物對(duì)肝臟代謝酶的影響存在種屬差異等問(wèn)題, 有關(guān)研究還待繼續(xù)深入。

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Effects of Protocatechuic Acid and Protocatechualdehyde on the Expression of Mouse Hepatic Cytochrome P450s

Zhang Xiaoyan, Xu Haimiao, Wang Dujun, Wang Kai, Sui Danjuan, Wei Yuan*

(School of Pharmacy, Jiangsu University，Zhenjiang 212013，China)

Objective: To investigate the modulatory effects of protocatechuic acid and protocatechualdehyde on the expression of mouse hepatic cytochrome P450s in both mRNA and protein levels. Methods: C57BL/6 mice were randomly divided into control (0.9% saline), protocatechuic acid and protocatechualdehyde (6 mg/kg), and phenobarbital (80 mg/kg) groups. The mice were administered by oral gavage every 48 hours for two weeks. Total mRNA was extracted from liver tissue and reverse transcript for RT-PCR analysis. Liver microsome was also prepared for protein analysis. Results: RT-PCR results showed that theCyp1a2 mRNA was significantly induced by protocatechuic acid and protocatechualdehyde compared with control group (P<0.05). Western blot results showed that CYP1A2 protein was significantly induced by protocatechuic acid and protocatechualdehyde. CYP2E1 protein was also induced by protocatechuic acid. No effects were observed on other P450s. Conclusion: Mouse hepatic CYP1A2 expression could be significantly induced by protocatechuic acid and protocatechualdehyde in mRNA and protein expression. CYP2E1 protein expression was also induced by protocatechuic acid.

potocatechuic acid; protocatechualdehyde; cytochrome P450; expression levels

10.3969/j.issn.1006-9690.2017.01.006

2016-03-18

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81102522，811373480，81202793)；江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(BK2011473)。

張曉燕(1990—)，女，碩士生，研究方向：中藥藥理和毒理學(xué)研究。E-mail：991066470@qq.com

*通訊作者： 魏淵(1981—)，男，博士，副教授，研究方向：細(xì)胞色素P450酶系相關(guān)的藥物代謝與毒理，藥物基因組學(xué)。

R963

A

1006-9690(2017)01-0018-04

E-mail：ywei@ujs.edu.cn