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    嘎狗嚕對肢體缺血再灌注損傷大鼠的抗炎作用研究

    2017-06-07 08:24:32王濟緯許榮成鄧連成鄢連和陳科雷后興
    關(guān)鍵詞:炎性肢體炎癥

    王濟緯 蘭 俊 許榮成 鄧連成 劉 斌 鄢連和 陳科 雷后興

    ·藥學(xué)研究·

    嘎狗嚕對肢體缺血再灌注損傷大鼠的抗炎作用研究

    王濟緯 蘭 俊 許榮成 鄧連成 劉 斌 鄢連和 陳科 雷后興

    大鼠;再灌注損傷;嘎狗嚕;炎癥因子

    肢體缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury,IRI)是一種臨床常見損傷,處理不當會引起嚴重的臨床后果。其病理生理機制十分復(fù)雜,包括細胞凋亡、氧化應(yīng)激、鈣超載、血管內(nèi)皮損傷、缺血后的微循環(huán)障礙等方面,而炎癥反應(yīng)在其發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用[1-2],發(fā)生IRI會刺激機體炎性細胞在肢體的聚集,同時表達產(chǎn)生大量的炎性細胞因子,而這些炎性因子反過來刺激更多的炎性反應(yīng),加重再灌注損傷。研究[3]發(fā)現(xiàn),細胞間黏附分子-1(ICAM-1)在其中起著非常重要的作用。文獻[4-5]報道,畬藥嘎狗嚕(地稔,Melastoma dodecandrum Lour,MDL)具有抗炎作用。本實驗觀察畬藥嘎狗嚕水煎液對肢體缺血再灌注損傷大鼠炎癥反應(yīng)的影響及作用機制,報道如下。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物8周齡清潔級健康SD大鼠,體質(zhì)量200~250g,雌雄各15只,溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。許可證號:SYXK(浙)2010-0150。適應(yīng)性飼養(yǎng),雌雄分養(yǎng),實驗前夜禁食,自由飲水。

    1.2 畬藥配置MDL全草由麗水市畬族醫(yī)藥研究所提供。取MDL原藥材1kg,剪碎后分別以10倍量、8倍量、6倍量水煎煮3次,每次30min,合并3次煎煮液濾過、離心,濃縮至1g生藥/mL的MDL濃縮液置于冰箱冷藏備用,實驗用MDL水煎液由MDL濃縮液+純水稀釋配制而成,濃度0.2g/mL。灌胃劑量為1次10mL/kg,1天1次。

    1.3 實驗儀器及試劑南京SOPTOP舜宇顯微鏡ST60,上海手術(shù)器械廠800型離心機,Mutuskan MK3酶標儀。Multi sciences公司生產(chǎn)的細胞間黏附分子-1(ICAM-1,批號238960234)、白細胞介素-6(IL-6,批號230660752)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α,批號238260734)試劑盒。

    1.4 實驗方法

    1.4.1 分組及造模30只SD大鼠分為假手術(shù)組、模型組和藥物組,每組10只。大鼠術(shù)前禁食12h,自由飲水,術(shù)前10%水合氯醛3mL/kg腹腔內(nèi)注射麻醉。每2h追加1次維持麻醉,劑量減半。麻醉成功后,大鼠仰臥位,四肢固定于木板上,取右腹股溝切口,常規(guī)備皮、消毒、鋪巾,剪開皮膚,在手術(shù)顯微鏡下顯露股動、靜脈及股神經(jīng),分離出右側(cè)股動脈。假手術(shù)組僅單純游離股動脈,不阻斷,直接縫合皮膚。模型組和藥物組大鼠用無創(chuàng)動脈夾夾閉右側(cè)股動脈,顯微鏡下確認阻斷動脈血流后,縫合切口兩針,再次消毒。同時予以右大腿根部橡皮帶環(huán)扎,阻斷側(cè)支循環(huán)。4h后松解橡皮帶,拆線,取出動脈夾,并檢查血管是否通暢,以確認恢復(fù)右下肢血流灌注,縫合創(chuàng)口。藥物組造模后第2天開始灌胃中藥,另兩組灌胃等量生理鹽水,每天1次,共喂5天;第6天三組大鼠麻醉后,心尖取血,檢測相關(guān)指標。

    1.4.2 血漿組織細胞因子水平檢測取血4mL入促凝管(促凝劑+分離膠),靜置30min待血清部分析出后,再予離心機離心,3000rpm,10min。分離血清后裝入無菌Epperdorf管置于-75℃超低溫冰箱中保存,統(tǒng)一檢測。ICAM-1、IL-6、TNF-α濃度均采用ELISA法檢測,嚴格按照試劑盒說明書操作。將血清標本從-75℃超低溫冰箱中取出,緩慢恢復(fù)至室溫;準備所有試劑和標準品;復(fù)孔加入100μL兩倍倍比稀釋的標準品;樣本孔加入50μL 1×檢測緩沖液和50μL樣本;每孔加入50μL稀釋的檢測抗體;室溫孵育2h;洗滌6次;每孔加入100μL稀釋的辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素;室溫孵育45min;洗滌6次;每孔加入100μL顯色底物,避光,室溫孵育20min;每孔加入100μL終止液;30min內(nèi),在450nm波長檢測OD值,參考波長630nm。

    根據(jù)標準品濃度和相應(yīng)的OD450吸光值制定標準曲線;根據(jù)標準曲線計算樣本的ICAM-1、IL-6、TNF-α濃度。

    1.5 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件,計量資料均以均數(shù)±標準差表示,采用t檢驗法,以P< 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 實驗結(jié)果

    模型組ICAM-1含量與假手術(shù)組比較顯著升高(P<0.05),模型組IL-6、TNF-α與假手術(shù)組比較有非常顯著升高(P<0.01)。藥物組ICAM-1、IL-6、TNF-α與模型組比較均有非常顯著降低(P<0.01)。見表1。

    表1 MDL提取液對肢體IRI模型大鼠血清炎性因子的影響

    表1 MDL提取液對肢體IRI模型大鼠血清炎性因子的影響

    注:與假手術(shù)組比較,*P<0.05,**P<0.01;與模型組比較,△△P<0.01. ICAM-1:細胞間黏附分子-1;IL-6:白細胞介素-6;TNF-α:腫瘤壞死因子-α

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    3 討論

    缺血再灌注損傷可在全身多部位發(fā)生,肢體、心臟、肝臟、肺臟、腦部、腎臟、小腸等都是好發(fā)部位[3,6-7],同時這些部位的再灌注損傷又會影響全身相關(guān)重要器官及系統(tǒng),嚴重者會導(dǎo)致全身性炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS),處理不及時可造成持續(xù)的不可控的炎癥反應(yīng),其產(chǎn)生的炎性介質(zhì)會影響內(nèi)皮細胞功能,并影響重要器官微循環(huán),引起凝血功能障礙,導(dǎo)致多臟器功能障礙綜合征(MODS)[8]。

    嘎狗嚕系畬族民間的常用藥物,具有解毒消腫、祛瘀活血之功能。ICAM-1參與免疫應(yīng)答和調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。ICAM-1、IL-6和TNF-α作為經(jīng)典的炎癥因子指標,可以準確表達炎癥反應(yīng)的強弱。本實驗通過鉗夾股動脈及橡皮片捆扎肢體造成大鼠缺血再灌注損傷,造模后相關(guān)指標升高,成功造成肢體缺血再灌注損傷動物模型。本研究發(fā)現(xiàn),MDL水煎提取液能夠明顯減少血液中炎癥因子的表達,表明MDL水煎提取液可以通過降低炎癥因子的表達抑制大鼠炎癥反應(yīng)。

    [1]Furuichi K,Wada T,Kaneko S,et al.Roles of chemo-kines in renal ischemia/reperfusion injury[J].Front Biosci,2008,13:4021-4028.

    [2]Thurman JM.Triggers of inflammation after renal ischemia/ reperfusion[J].Clin Immunol,2007,123(1):7-13.

    [3]徐江,黃曉琳.高壓氧對腦缺血再灌注大鼠核因子-k B及細胞間黏附分子-1表達的影響[J].中華物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)雜志,2005,27(5):259-262.

    [4]雷后興,鄢連和,李水福等.畬藥地稔水煎液的鎮(zhèn)痛抗炎作用研究[J].中國民族醫(yī)藥雜志,2008,3(3):45-47.

    [5]周芳,張興燊,張旖簫,等.地稔水煎液鎮(zhèn)痛抗炎藥效的實驗研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2007,18(10):2370-2371.

    [6]王良榮,金立達,林麗娜,等.糖尿病對肢體缺血再灌注后患者炎癥反應(yīng)和肺功能的影響[J].溫州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2015,45(3):194-196.

    [7]王曉琴,陳麗.舒芬太尼預(yù)處理對老年人肢體缺血再灌注后腫瘤壞死因子-α和心肌肌鈣蛋白I的影響[J].中華臨床醫(yī)師雜志,2016,10(9):1283-1286.

    [8]北京市科委重大項目“MODS中西醫(yī)結(jié)合診治/降低病死率研究”課組.多器官功能障礙綜合征診斷標準、病情嚴重度評分及預(yù)后評估系統(tǒng)和中西醫(yī)結(jié)合證型診斷[S].中國危重癥急救醫(yī)學(xué),2008,20(1):1-3.

    (收稿:2016-10-12修回:2106-10-22)

    浙江省麗水市重點創(chuàng)新團隊項目(No.2012CXTD09-06)

    浙江省麗水市人民醫(yī)院(麗水323000)

    雷后興,Email:zjleihx@163.com

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