FGF1通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬途徑保護對乙酰氨基酚誘導(dǎo)的小鼠肝損傷

張謝 宋毓飛 張學(xué)松 王小芳 吳俊男 陳熠媛 陳碩崴

對乙酰氨基酚（APAP）是世界上最流行和安全的止痛藥之一，然而如過量使用會導(dǎo)致嚴(yán)重的肝損傷，甚至急性肝衰竭[1-2]。正常情況下，APAP在經(jīng)消化吸收后通過與葡萄糖醛酸結(jié)合被排出體外，但當(dāng)機體攝入過量的APAP后，會產(chǎn)生毒性代謝物N-乙酰-對苯醌亞胺（NAPQI），可引起急性的、嚴(yán)重的肝細(xì)胞損傷[1-4]。成纖維細(xì)胞生長因子1（FGF1）又名酸性成纖維細(xì)胞生長因子（aFGF），是龐大的生長因子家族中一員，在胚胎發(fā)育、血管生長、創(chuàng)傷愈合等過程中發(fā)揮重要作用[5-6]，目前已作為促進燒傷創(chuàng)面愈合的藥物上市，但在肝損傷方面有何作用無詳細(xì)報道。本研究通過建立APAP誘導(dǎo)的小鼠肝損傷模型，探究FGF1對APAP引起肝損傷的保護作用及相應(yīng)機制，為開發(fā)治療藥物性肝損傷的新藥提供理論依據(jù)和參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物 雄性C57BL/6小鼠30只，SPF級，體重18~22g，8周齡，由溫州醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供[合格證號：SCXK（浙）2015-0001]。在溫州醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心分籠飼養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑 FGF1由溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院提供；對乙酰氨基酚片（國藥準(zhǔn)字：H22022435）、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白 78（GRP78）、蛋白二硫鍵異構(gòu)酶（PDI）、Beclin1 抗體購自美國Abcam公司；C/EBP同源蛋白（CHOP）、X-框結(jié)合蛋白 1（XBP-1）、微管相關(guān)蛋白 1 輕鏈 3（LC3）、3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）抗體均購自美國Santa Cruz公司；激活轉(zhuǎn)錄因子6（ATF6）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Caspase3）、自噬基因相關(guān)蛋白7（ATG7）、自噬基因相關(guān)蛋白5（ATG5）抗體均購自美國Bioworld公司；丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）試劑盒購自南京建城生物工程研究所。

1.1.3 主要儀器 熒光倒置顯微鏡（日本Nikon公司，Ti-U型）；高速冷凍離心機（美國Thermo Fisher公司，micro21R型）；超純水（美國Millipore公司，Direct-Q3型），凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-rad公司，chemidoc XRS+型）等。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及模型制備 將30只小鼠按隨機數(shù)字表法分為APAP+FGF1處理組、APAP組及正常對照組3組，每組10只。APAP+FGF1組：腹腔注射APAP 500mg/kg 0.5h后，腹腔注射FGF1 1.0mg/kg；APAP組：腹腔注射APAP 500mg/kg；正常對照組：給予同等劑量PBS作為對照。所有小鼠在給予APAP 24h后均經(jīng)頸椎脫位法處死。造模24h后小鼠血漿ALT水平顯著升高，表示造模成功。

1.2.2 ALT水平檢測 采用ELISA法。3組小鼠給藥后24h眼眶采血，3 000r/min離心10min，取血漿，按照試劑盒說明書進行檢測。

1.2.3 病理檢查 處死小鼠后，取各組小鼠肝組織約4g，4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，5μm切片，作HE染色，顯微鏡下觀察肝組織病變情況。

1.2.4 Western bolt法檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及自噬信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá) BCA法測定肝組織總蛋白濃度，蛋白變性后行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，加入3%牛血漿白蛋白（BSA）封閉液，室溫下孵育 1h，加入 GRP78、ATF6、PDI、XBP-1、Caspase3、CHOP、ATG7、Beclin1、ATG5、LC-3、GAPDH 一抗（1∶1 000），4℃封閉過夜，棄一抗，TBST 洗3遍；加入1∶10 000的二抗，室溫孵育2h后，棄二抗，TBST洗滌3遍，化學(xué)發(fā)光顯色劑顯色，曝光，觀測GRP78、ATF6、PDI、XBP-1、Caspase-3和 CHOP 的表達(dá)量。1.2.5 免疫熒光染色法檢測肝組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及自噬信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá) 處死小鼠后，取各組小鼠肝組織約8g，4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，5μm切片，0.1%檸檬酸鈉緩沖液進行抗原修復(fù)，5%BSA封閉，加入 GRP78，ATG7，LC-3 一抗（1∶200），4℃過夜；加入二抗（1∶500），37℃孵育 1h，PBS 洗滌 3 次，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染核7min，抗熒光淬滅劑封片，顯微鏡下觀察，再將觀察到的目的蛋白熒光圖和染核圖片進行整合（Merge）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用GraphPad 5.0統(tǒng)計軟件。計量資料用表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組小鼠血漿ALT水平比較 ELISA結(jié)果顯示，APAP+FGF1組 ALT 水平為（29.33±5.05）U/L，APAP 組為（48.00±10.93）U/L，正常對照組為（35.60±4.39）U/L，與正常對照組比較，APAP組ALT水平增加，而APAP+FGF1組ALT水平下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.2 3組小鼠肝組織HE染色結(jié)果比較 在APAP注射后24h，與正常對照組比較，APAP組出現(xiàn)明顯的片狀和點狀的肝細(xì)胞壞死，且肝索內(nèi)出血較為顯著，而APAP+FGF1組肝細(xì)胞損傷程度減輕，見圖1（見插頁）。

2.3 3組小鼠肝組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路相關(guān)蛋白檢測結(jié)果比較 Western blot法結(jié)果顯示，與正常對照組比較，APAP 組 GRP78、ATF6、PDI、XBP-1、Caspase-3 和CHOP表達(dá)量均增高，而APAP+FGF1組上述蛋白又降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見圖2、表1。免疫熒光法結(jié)果顯示，與正常對照組比較，APAP組GRP78表達(dá)量顯著增高，而APAP+FGF1組GRP78又明顯下降，見圖3（見插頁）。

圖2 3組小鼠肝組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路相關(guān)蛋白的電泳圖

2.4 3組小鼠肝組織自噬信號通路相關(guān)蛋白檢測結(jié)果比較 Western blot法結(jié)果顯示，與正常對照組比較，APAP 組 ATG7、Beclin-1、ATG5、LC-3Ⅰ/Ⅱ表達(dá)量均明顯增高，而APAP+FGF1組的均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01），見圖4、表2。免疫熒光法結(jié)果顯示，與正常對照組比較，APAP組ATG7、LC-3表達(dá)量均增高，而APAP+FGF1組的均降低，比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見圖 5（見插頁）。

3 討論

近年來，APAP引起的急性肝衰竭成為發(fā)達(dá)國家中急性肝衰竭導(dǎo)致死亡的最常見因素，由此引起了嚴(yán)重的公共健康及安全問題[7-8]。90%~95%的APAP在肝臟代謝，其主要與葡萄醛酸、硫酸及半胱氨酸結(jié)合，在24h內(nèi)以原型、葡萄醛酸、硫酸及半胱氨酸結(jié)合的形式從腎臟排泄[1]。但小部分APAP在肝細(xì)胞內(nèi)由細(xì)胞色素P450（CYP450）代謝轉(zhuǎn)化為NAPQI，NAPQI與親核性物質(zhì)結(jié)合并由此進入細(xì)胞核內(nèi)，引發(fā)肝細(xì)胞毒性[1-4，9]。研究顯示，APAP引起急性肝損傷的病理生理過程主要是由代謝產(chǎn)物被激活、谷胱甘肽消耗及蛋白質(zhì)的結(jié)合造成的[10]。過量或長期服用APAP可引起肝細(xì)胞損傷、淤膽型肝炎，嚴(yán)重者可引起肝性昏迷甚至死亡。部分原因是由于APAP與肝細(xì)胞內(nèi)線粒體功能降低、自由基代謝產(chǎn)物增多及氧化應(yīng)激的密切關(guān)系[11]，同時固有免疫反應(yīng)和炎性應(yīng)答在APAP誘發(fā)的急性肝損傷也發(fā)揮重要作用[12]。然而目前APAP引起肝細(xì)胞損傷具體機制尚不明確。

有研究表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）的激活是APAP激活的肝毒性反應(yīng)級聯(lián)反應(yīng)中的晚期事件，ATF6通過上調(diào)CHOP在APAP誘導(dǎo)的肝脂肪變性發(fā)病機制中起到關(guān)鍵作用[13]。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下XBP1被需要肌醇的酶-1（IRE1）的核糖核酸酶剪接，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶GRP78和PDI的表達(dá)水平增加[14]，并上調(diào)Caspase 3活性，誘導(dǎo)肝損傷。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以通過激活UPR信號通路從而激活細(xì)胞自噬[15]，自噬也是對抗危險刺激的細(xì)胞防御機制[16]。然而，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激太強或時間過長時，UPR將過度激活自噬，促進細(xì)胞死亡并導(dǎo)致身體損傷[17]。Beclin1等上游因子參與自噬起始和成核，ATG5、ATG7和LC3等下游因子促進自噬膜伸長和閉合[18]。LC3是自噬體膜上的標(biāo)記蛋白。在異煙肼誘導(dǎo)斑馬魚肝損傷的模型中，異煙肼可以增強內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路相關(guān)蛋白（GRP78、ATF6、Perk、IRE1、XBP1S、GRP94和 CHOP）和自噬相關(guān)蛋白（Beclin 1、LC3、ATG3和ATG12）的水平上升，提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與自噬及肝損密切相關(guān)[19]。

FGF1是FGFs家族成員之一，對來源于中胚層及神經(jīng)外胚層的細(xì)胞具有促分裂作用。人類FGF1是位于人體第4號染色體上的單拷貝基因，由2個內(nèi)含子和3個外顯子組成，蛋白由154個氨基酸殘基組成，等電點為5~7個，通過與受體結(jié)合、啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制誘導(dǎo)多種細(xì)胞的分化、增殖[20]。由于它具有營養(yǎng)和保護神經(jīng)元、促進損傷修復(fù)、誘導(dǎo)缺血區(qū)血管形成等多個方面的作用而成為眾多學(xué)者研究的熱點。aFGF主要通過與成纖維細(xì)胞生長因子受體-1（FGFR-1）結(jié)合，啟動絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路，刺激成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞的生長[21]。aFGF與FGFR-2結(jié)合僅起保持MAPK通路活性的作用[22]，同時aFGF也可與FGFR-4（神經(jīng)元高親和受體）結(jié)合，通過甲素核蛋白體基因的轉(zhuǎn)錄，以促進細(xì)胞分裂增殖；同時還通過細(xì)胞內(nèi)蛋白和總RNA的合成表達(dá)，促進神經(jīng)元突起生長[23]。aFGF與FGFR結(jié)合后啟動的MAPK途徑是調(diào)節(jié)各種細(xì)胞趨化應(yīng)答、分化、分裂的重要途徑，是細(xì)胞增殖、分化等信息傳遞途徑的交集點和共同通路。

表1 3組小鼠肝組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路相關(guān)蛋白檢測結(jié)果比較

表2 3組小鼠肝組織自噬信號通路相關(guān)蛋白檢測結(jié)果比較

圖4 3組小鼠肝組織自噬信號通路相關(guān)蛋白的電泳圖

目前，國內(nèi)外針對FGF1的研究主要集中在創(chuàng)傷修復(fù)、調(diào)節(jié)血糖、調(diào)節(jié)代謝及通過與受體結(jié)合啟動MAPK信號通路從而刺激細(xì)胞的分裂及促進細(xì)胞生長、增殖、分化同時進行信息傳遞，而關(guān)于其在肝損傷尤其是藥物性肝損傷方面的研究較少。只有少量的研究顯示FGF1 KO小鼠的肝組織再生能力明顯延緩[24]，APAP會誘導(dǎo)FGF1表達(dá)降低[25]。此外，在各種非酒精性脂肪性肝病小鼠模型中，重組FGF1可有效改善肝臟炎癥和損傷[26]。FGF1還能促進肝源性干細(xì)胞的分化和成熟[27]，提示其在各種肝病中的潛在治療作用。而本研究結(jié)果同樣顯示，當(dāng)生物體攝入過量的APAP時，其在機體內(nèi)轉(zhuǎn)化為毒性代謝產(chǎn)物，該毒性代謝產(chǎn)物進一步通過激發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬引起肝細(xì)胞損傷，而FGF1通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬達(dá)到對肝細(xì)胞的保護作用，說明FGF1有望成為治療藥物性肝損傷的一個新選擇。