磁性化學(xué)發(fā)光酶免疫法檢測(cè)豬肉中的氯霉素

王 玲，管 笛，周 欣，高書濤，臧曉歡，魏 穎

磁性化學(xué)發(fā)光酶免疫法檢測(cè)豬肉中的氯霉素

王 玲1，管 笛2，周 欣1，高書濤1，臧曉歡1，魏 穎2

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，河北 保定 071001；2.北京市理化分析測(cè)試中心，北京 100089）

建立以磁性微球?yàn)楣潭ㄏ嗟幕瘜W(xué)發(fā)光酶免疫法，定量檢測(cè)豬肉中的氯霉素含量。此方法為在微孔中加入羊抗鼠磁性微球、樣品和抗體，反應(yīng)一定時(shí)間，之后補(bǔ)加酶標(biāo)抗原，繼續(xù)反應(yīng)一定時(shí)間后清洗磁珠，加入發(fā)光液反應(yīng)10 min后分析測(cè)定。通過(guò)磁珠用量、酶標(biāo)抗原量、抗體量和反應(yīng)模式的優(yōu)化，成功建立了一種高靈 敏度、高準(zhǔn)確度的檢測(cè)豬肉中氯霉素的磁性化學(xué)發(fā)光酶免疫方法。該方法的檢出限為0.013 μg/kg，線性范圍在0.060～2.421 μg/kg之間，回收率在85.24%～93.57%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于11.5%。

化學(xué)發(fā)光酶免疫法；氯霉素；磁性微球；豬肉

氯霉素是一類廉價(jià)高效的廣譜抗生素，最初于20世紀(jì)中葉從南美委內(nèi)瑞拉鏈絲菌中提取制得，現(xiàn)可用化學(xué)合成的方法大量生產(chǎn)[1-2]。氯霉素可作用于細(xì)菌核糖核蛋白體的50S亞基，它可以阻撓蛋白質(zhì)的合成，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性、革蘭氏陰性細(xì)菌均有抑制作用[3]。由于氯霉素具有價(jià)格低廉、抗菌性優(yōu)良、藥性穩(wěn)定的特點(diǎn)，一度廣泛用于農(nóng)牧業(yè)和細(xì)菌性治療用藥[4-5]。但隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)氯霉素對(duì)人骨髓和新生兒有較大的毒性。人體長(zhǎng)期攝入含有氯霉素藥物殘留的動(dòng)物源性食品，可引發(fā)多種疾病。輕者破壞人體內(nèi)菌群的平衡，產(chǎn)生耐藥菌珠，危及健康[6-7]，嚴(yán)重時(shí)可干擾骨髓細(xì)胞蛋白的合成，并抑制幼稚細(xì)胞DNA合成，導(dǎo)致粒細(xì)胞減少，引發(fā)再生障礙性貧血、溶血、紫癜等惡性疾病[8-9]。基于以上問(wèn)題，世界許多國(guó)家對(duì)氯霉素的使用問(wèn)題高度重視，歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家均對(duì)氯霉素殘留限量標(biāo)準(zhǔn)做出嚴(yán)格規(guī)定[10-11]。我國(guó)農(nóng)業(yè)部在2001年規(guī)定在馬肝和雞肉等中氯霉素的殘留限量為不得檢出，在2002年進(jìn)一步要求氯霉素及其鹽、酯在所有食品動(dòng)物的所有可食組織中不得檢出[12]。

目前氯霉素的檢測(cè)方法主要有儀器分析法和免疫學(xué)分析法。儀器分析法主要包括氣相色譜-質(zhì)譜法[13-15]、高效液相色譜法[16-18]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[19-21]、毛細(xì)管電泳法[22-23]。以上方法主要用于確證與仲裁檢測(cè)，具有檢測(cè)靈敏度高、準(zhǔn)確性好的優(yōu)點(diǎn)。但是也存在檢測(cè)步驟復(fù)雜，依賴昂貴設(shè)備支撐和對(duì)人員操作要求高等缺點(diǎn)。免疫學(xué)分析法包括酶聯(lián)免疫吸附法[24-27]、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法[28-30]和免疫層析方法[31-35]等。

化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)因其既具有免疫反應(yīng)的特異性又具有化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的高靈敏性，而被廣泛應(yīng)用。自免疫檢測(cè)技術(shù)問(wèn)世及在其迅速發(fā)展過(guò)程中，固相載體的選擇始終是研究熱點(diǎn)之一。近年來(lái)，在新型固相載體中，磁性微球不僅可以作為反應(yīng)的固定相又可作為分離載體，與傳統(tǒng)的酶標(biāo)板載體相比，具有更大的比表面積，可使免疫反應(yīng)從二維到三維立體反應(yīng)，從而提高抗體與抗原的反應(yīng)效率，同時(shí)具有可自動(dòng)化操作等優(yōu)勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)將磁微粒替代酶標(biāo)板作固定相，應(yīng)用到化學(xué)發(fā)光技術(shù)中檢測(cè)氯霉素以期獲得靈敏高效的檢測(cè)技術(shù)，同時(shí)也為實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行前期研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、Tween-20、2-（N-嗎啡啉）乙磺酸（2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate，MES）、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽（N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide hydrochloride crystalline，EDC）、羊抗鼠抗體美國(guó)S i g m a-A l d r i c h公司；N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS） 美國(guó)Pierce公司；氯霉素單克隆抗體 上海杰一生物技術(shù)有限公司；氯霉素-辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）偶聯(lián)物 美國(guó)Beacon公司；300 nm羧基磁微粒 美國(guó)Quantum量子科學(xué)儀器公司；96 孔可拆卸化學(xué)發(fā)光用微孔板 美國(guó)Corning公司；化學(xué)發(fā)光底物液（主要成分為魯米諾） 湖州英創(chuàng)生物科技有限公司；其他化學(xué)試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

Varioskan Flash多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo公司；THZ-C恒溫振蕩器 太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；DHG-9070A電熱恒溫水浴箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 羊抗鼠磁珠偶聯(lián)物的制備

以p H 4.7、0.1 m o l/L的M E S溶液（稱取1.066 g MES，0.45 g NaCl溶于50 mL純水，調(diào)pH 4.7）作為活化緩沖溶液，取100 μL磁微粒溶液于2 mL離心管中，利用磁鐵吸附，待完全吸附后，棄去液體，加入500 μL活化緩沖溶液，旋渦振蕩器上混勻；磁鐵吸附，待完全吸附后，棄去液體，重復(fù)洗滌兩遍后，向磁微粒中加入0.96 mg EDC、1.15 mg NHS和200 μL活化緩沖溶液，37 ℃，120 r/min，搖床振蕩30 min；用活化緩沖溶液洗滌兩遍，除去未反應(yīng)的活化劑，并更換新的2 mL離心管。將pH 8.5，濃度為50 mmol/L的硼酸緩沖液作為偶聯(lián)緩沖液。用500 μL的偶聯(lián)緩沖液洗滌磁珠兩遍，加入50 μg羊抗鼠抗體至偶聯(lián)緩沖液終體積為400 μL，37 ℃，120 r/min，搖床振蕩3 h。

封閉加入100 μL的BSA溶液（BSA事先溶解在偶聯(lián)緩沖液中）至BSA終質(zhì)量濃度為5 mg/mL，對(duì)免疫磁微粒表面沒(méi)有偶聯(lián)抗體的活化基團(tuán)進(jìn)行封閉，并且通過(guò)BSA的物理吸附，封閉其他空間位點(diǎn)，降低在之后實(shí)驗(yàn)中可能發(fā)生的非特異性吸附。37 ℃、120 r/min，搖床振蕩30 min。利用磁鐵吸附，棄去溶液；用含0.5% BSA的磷酸緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌兩次，加入330 μL 0.5% BSA的PBS，4 ℃保存待用。

1.3.2 基于磁微粒的氯霉素直接競(jìng)爭(zhēng)化學(xué)發(fā)光法

基于氯霉素單克隆抗體的化學(xué)發(fā)光法在測(cè)定前需要對(duì)化學(xué)發(fā)光微孔板進(jìn)行封閉處理，防止非特異性吸附。向96 孔板每孔中加入300 μL 1.5% BSA溶液，37 ℃孵育2 h，PBST溶液洗板3 次后，拍干板子，4 ℃保存?zhèn)溆?。基于磁微粒的化學(xué)發(fā)光法采用兩種反應(yīng)模式。

反應(yīng)模式1：每孔加入100 μL樣品/標(biāo)準(zhǔn)品溶液，50 μL氯霉素-HRP偶聯(lián)物，50 μL氯霉素單克隆抗體溶液，1 μL羊抗鼠抗體-300 nm磁微粒偶聯(lián)物，37 ℃反應(yīng)20 min。然后用PBST清洗磁微粒3次，清洗方法同文獻(xiàn)[21]。每孔加入100 μL化學(xué)發(fā)光底物，37 ℃反應(yīng)10 min后進(jìn)行發(fā)光測(cè)量。

反應(yīng)模式2：每孔加入100 μL樣品/標(biāo)準(zhǔn)品溶液，50 μL氯霉素單克隆抗體溶液，1 μL羊抗鼠抗體-300 nm磁微粒偶聯(lián)物，37 ℃反應(yīng)10 min后，再加入50 μL氯霉素-HRP偶聯(lián)物，37 ℃反應(yīng)10 min。然后用PBST清洗磁微粒3 次。每孔加入100 μL化學(xué)發(fā)光底物，37 ℃反應(yīng)10 min后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光值測(cè)量。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

取氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行梯度稀釋，利用以上方法分別建立標(biāo)準(zhǔn)曲線?；瘜W(xué)發(fā)光值通過(guò)多功能酶標(biāo)儀測(cè)定，并作圖。橫坐標(biāo)為氯霉素質(zhì)量濃度，縱坐標(biāo)用抑制率表示（抑制率/%=B/B0×100，式中，B為含有氯霉素時(shí)的發(fā)光值，B0為質(zhì)量濃度為0 μg/L時(shí)的發(fā)光值）。測(cè)定結(jié)果用非線性四參數(shù)邏輯斯蒂擬合。方法的檢出限定義為90%抑制率時(shí)所對(duì)應(yīng)氯霉素質(zhì)量濃度。檢測(cè)的線性范圍定義為抑制率在80%～20%之間所對(duì)應(yīng)的氯霉素質(zhì)量濃度。

1.3.4 豬肉樣品中氯霉素提取與回收率的測(cè)定

用均質(zhì)器均質(zhì)豬肉樣本，稱取3.0 g均質(zhì)物至50 mL離心管中，添加氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品至添加量為0.1、0.5 μg/kg和1 μg/kg，加入6 mL乙酸乙酯，用振蕩器振蕩10 min，3 000×g以上、室溫（20～25 ℃）離心10 min；移取4 mL上層有機(jī)相（約相當(dāng)于2 g的樣本）至10 mL干凈的玻璃試管中，于50～60 ℃水浴氮?dú)饬飨麓蹈?；加? mL正己烷，用渦旋儀渦動(dòng)30 s，再加1 mL PBS復(fù)溶，用渦旋儀渦動(dòng)1 min后，3 000×g以上、室溫（20～25 ℃）離心15 min；除去上層有機(jī)相，取下層100 μL用于分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊抗鼠磁珠偶聯(lián)物用量的優(yōu)化

羊抗鼠磁珠偶聯(lián)物用量對(duì)檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性有較大的影響。用量少，有利于降低成本，可是在洗滌過(guò)程中會(huì)損失部分的偶聯(lián)物，存在實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)誤差大以及穩(wěn)定性差的缺陷；偶聯(lián)物用量過(guò)多，不僅會(huì)增加使用成本，而且由于磁珠的吸光效應(yīng)，造成靈敏度及重復(fù)性差。因此合適的羊抗鼠磁珠偶聯(lián)物用量對(duì)于磁性化學(xué)發(fā)光酶免疫法來(lái)說(shuō)非常重要。本研究選取添加0.2、0.5、1.0、1.5、2.5 μL羊抗鼠磁珠偶聯(lián)物進(jìn)行比較研究。加入50 μL稀釋度為1∶3 000的抗體，50 μL氯霉素-HRP，100 μL空白樣品和磁珠后，37 ℃反應(yīng)20 min。然后用PBST清洗磁微粒3 次。每孔加入100 μL化學(xué)發(fā)光底物，37 ℃反應(yīng)10 min后進(jìn)行發(fā)光測(cè)量。由圖1可知，當(dāng)磁珠偶聯(lián)物用量為0.5 μL時(shí)化學(xué)發(fā)光值最高，隨后1.0 μL以上的偶聯(lián)物的化學(xué)發(fā)光值有所降低，但相對(duì)平穩(wěn)。雖然磁珠偶聯(lián)物用量0.5 μL時(shí)的偶聯(lián)物化學(xué)發(fā)光值最高，但是此時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)偏差較大，結(jié)果穩(wěn)定性相對(duì)較差，因此選取1.0 μL為最佳磁珠偶聯(lián)物用量。

圖 1 羊抗鼠磁珠偶聯(lián)物用量對(duì)化學(xué)發(fā)光值的影響Fig. 1 Effect of different amounts of conjugate on chemiluminescence value

2.2 抗體與酶標(biāo)物用量的優(yōu)化

抗體用量對(duì)檢測(cè)方法的靈敏度有較大的影響。抗體用量過(guò)多，會(huì)影響待測(cè)物的競(jìng)爭(zhēng)效果，降低檢測(cè)靈敏度；抗體用量過(guò)少，會(huì)使化學(xué)發(fā)光值過(guò)低，影響檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性。酶標(biāo)抗原（即氯霉素-HRP）作為免疫反應(yīng)中的競(jìng)爭(zhēng)物，其用量多少對(duì)檢測(cè)靈敏度也影響較大。與抗體類似，酶標(biāo)抗原用量過(guò)多，而檢測(cè)較低含量的待測(cè)物時(shí)，會(huì)造成競(jìng)爭(zhēng)效果不明顯，從而降低檢測(cè)靈敏度；而酶標(biāo)抗原用量過(guò)少的，也會(huì)使化學(xué)發(fā)光值過(guò)低，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定性也較差。因此本研究分別對(duì)抗體和酶標(biāo)抗原的用量進(jìn)行了優(yōu)化。

反應(yīng)模式1與反應(yīng)模式2的氯霉素-HRP量的優(yōu)化，分別添加50 μL稀釋度為1∶5、2∶5、3∶5的氯霉素-HRP；抗體添加50 μL，稀釋度均為1∶10 000。結(jié)果見(jiàn)表1，在反應(yīng)模式1中，當(dāng)氯霉素-HRP的稀釋度為2∶5時(shí)，氯霉素添加量為0.5 μg/kg時(shí)具有最低抑制率，為47.3%。表明此時(shí)競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)效果最好，具有更高的檢測(cè)靈敏度，選用此稀釋度為最佳。在反應(yīng)模式2中，氯霉素-HRP的稀釋度為1∶5時(shí)，競(jìng)爭(zhēng)效果最好，靈敏度最高，選用此稀釋度為最佳。

表 1 氯霉素-HRP用量的優(yōu)化Table 1 Optimization of the amount of chloramphenicol-HRP

反應(yīng)模式1抗體量的優(yōu)化，為分別添加50 μL稀釋度為1∶20 000、1∶10 000、1∶5 000的抗體；氯霉素-HRP添加50 μL，稀釋度均為1∶5。反應(yīng)模式2抗體量的優(yōu)化，為分別添加50 μL稀釋度為1∶40 000、1∶20 000、1∶10 000的抗體；氯霉素-HRP添加50 μL，稀釋度均為1∶5。由表2可知，在反應(yīng)模式1中，當(dāng)氯霉素抗體的稀釋度為1∶10 000時(shí)，氯霉素添加量為0.5 μg/kg時(shí)具有最低抑制率，為47.3%。表明此時(shí)競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)效果最好，具有更好的檢測(cè)靈敏度，選用此稀釋度為最佳。在反應(yīng)模式2中，氯霉素抗體的稀釋度為1∶40 000時(shí)，競(jìng)爭(zhēng)效果最好，抑制率為30.5%，靈敏度最高，因此選用此稀釋度為最佳。2.3 反應(yīng)模式1與反應(yīng)模式2化學(xué)發(fā)光的比較

表 2 氯霉素抗體用量的優(yōu)化Table 2 Optimization of the amount of anti-chloramphenicol antibody

將300 nm磁微粒作為承載體，取代酶標(biāo)板引入化學(xué)發(fā)光檢測(cè)中，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。反應(yīng)模式1的反應(yīng)條件為：依次加入羊抗鼠300 nm磁珠，用量為1 μL；氯霉素單克隆抗體稀釋度為1∶10 000，用量為50 μL；酶標(biāo)抗原氯霉素-HRP稀釋度為2∶5，用量為50 μL；標(biāo)準(zhǔn)品體積為100 μL；反應(yīng)時(shí)間為20 min；PBST洗磁珠3 次后，加入發(fā)光底物液，10 min后測(cè)量。反應(yīng)模式2的反應(yīng)條件為：先加入羊抗鼠300 nm磁珠，用量為1 μL；氯霉素單克隆抗體稀釋度為1∶40 000，用量為50 μL；標(biāo)準(zhǔn)品體積為100 μL后，37 ℃反應(yīng)10 min；再加入稀釋度為2∶5的氯霉素-HRP，用量為50 μL；反應(yīng)時(shí)間為10 min；PBST洗磁珠3 次后，加入發(fā)光底物液，10 min后測(cè)量。兩種反應(yīng)模式作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行比較，見(jiàn)圖2。

圖 2 兩種方式的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 2 Standard curves for chloramphenicol

由圖2可知，采用反應(yīng)模式2的磁性化學(xué)發(fā)光酶免疫法的標(biāo)準(zhǔn)曲線相比反應(yīng)模式1的標(biāo)準(zhǔn)曲線更靠近Y軸，擁有更高的檢測(cè)靈敏度。反應(yīng)模式2的檢出限為0.013 μg/kg，方程為：

線性范圍在0.060～2.421 μg/L之間，標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2為0.999 4；反應(yīng)模式1的檢出限為0.114 μg/kg，方程為：

線性范圍在0.186～1.107 μg/L之間，標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2為0.999 3。反應(yīng)模式2較反應(yīng)模式1降低檢出限近8.5 倍。反應(yīng)模式2與反應(yīng)模式1的不同之處在于先讓抗體與樣品液中的標(biāo)準(zhǔn)品充分反應(yīng)后，再加入氯霉素-HRP進(jìn)行反應(yīng)；而不是同時(shí)加入氯霉素和氯霉素-HRP進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，因此能夠顯著提高檢測(cè)靈敏度。

2.4 豬肉樣品中氯霉素添加回收率的測(cè)定

向空白豬肉樣品中添加一定量的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品，添加量分別為0.1、0.5、1.0 μg/kg。經(jīng)過(guò)提取回收，利用上述建立的磁性直接競(jìng)爭(zhēng)化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果見(jiàn)表3，實(shí)驗(yàn)回收率范圍在85.24%～93.57%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于11.5%。由此可見(jiàn)，本實(shí)驗(yàn)建立的磁性化學(xué)發(fā)光酶免疫法具有良好的回收率，并證明磁珠作為承載體能夠應(yīng)用于豬肉樣品中氯霉素的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。

表 3 豬肉樣品中氯霉素添加回收率測(cè)定Table 3 Recoveries of chloramphenicol residues in spiked pork

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立了磁性化學(xué)發(fā)光酶免疫法檢測(cè)豬肉樣品中的氯霉素，該研究使用磁珠替代酶標(biāo)板作為固定相，降低了空間位阻，使免疫反應(yīng)進(jìn)行的更加充分。通過(guò)磁珠用量、氯霉素-HRP量、抗體量和反應(yīng)模式的優(yōu)化，最終建立方法的檢出限為0.013 μg/kg，線性范圍為0.060～2.421 μg/L。豬肉樣品添加回收實(shí)驗(yàn)表明，方法的回收率為85.24%～93.57%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于11.5%。綜上，磁性化學(xué)發(fā)光酶免疫法應(yīng)用于豬肉中氯霉素含量的檢測(cè)，具備靈敏度高、準(zhǔn)確度高、檢測(cè)速度快等特點(diǎn)，可為自動(dòng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)研究提供科學(xué)的參考依據(jù)。

[1] 郝俊虎, 王仙琴, 閆永利, 等. 氯霉素殘留對(duì)出口畜產(chǎn)品的危害[J].飼料研究, 2005(5): 8-10. DOI:10.3969/j.issn.1002-2813.2005.05.003.

[2] 馬玲, 關(guān)忠誼, 吳健敏, 等. 氯霉素殘留一步式化學(xué)發(fā)光酶免疫法的建立[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2011, 42(2): 205-208. DOI:10.3969/ j.issn.2095-1191.2011.02.024.

[3] 陳杖榴. 獸醫(yī)藥理學(xué)[M]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 2010: 252-253.

[4] 陳鵬, 羅曉琴. 氯霉素殘留狀況及檢測(cè)方法[J]. 動(dòng)物保健, 2006(10): 41-42. DOI:10.3969/j.issn.1673-8586.2006.10.017.

[5] TAN Z J, XU H, LI G, et al. Fluorescence quenching for chloramphenicol detection in milk based on protein-stabilized Au nanoclusters[J]. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 2015, 149: 615-620.

[6] 王自良, 趙坤, 張改平. 氯霉素的毒性及其在動(dòng)物性食品中的殘留與檢測(cè)[J]. 河南科技學(xué)院學(xué)報(bào), 2005, 33(2): 101-105.

[7] 吳宇伉, 梅勇, 張?chǎng)? 等. 高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用法快速檢測(cè)牛奶中的氯霉素[J]. 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2015, 25(1): 29-31.

[8] 吳曉豐, 楊鷺花. 氯霉素殘留的危害及其檢測(cè)方法[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2004, 25(3): 41-43. DOI:10.3969/j.issn.1007-5038.2004.03.014.

[9] 曹巧玲, 楊凱, 武澤新. 氯霉素的毒性作用和檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J].職業(yè)與健康, 2013, 29(16): 2095-2097.

[10] SHAKILA R J, SARAVANAKUMAR R, SAP V, et al. An improved microbial assay for the detection of chloramphenicol residues in shrimp tissues[J]. Innovative Food Science & Emerging Technologies, 2007, 8(4): 515-518. DOI:10.1016/j.ifset.2007.03.002.

[11] Commission Regulation (EU) No 37/2010 of 22 December 2009 on pharmacologically active substances and their classification regarding maximum residue limits in foodstuffs of animal origin[S]. Official Journal of the European Union, 2010: L15.

[12] 農(nóng)業(yè)部. 動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量: 中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第235號(hào)文件[S]. 2002. 北京: 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社.

[13] 宋宏娟. 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)水產(chǎn)品中氯霉素殘留量[J]. 食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào), 2015(6): 2373-2378.

[14] 胡紅美, 郭遠(yuǎn)明, 雷科, 等. 分散固相萃取凈化-氣相色譜法測(cè)定水產(chǎn)品中氯霉素和氟苯尼考[J]. 食品科學(xué), 2014, 35(8): 231-235. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201408046.

[15] 高潔. 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定肉制品中氯霉素、甲砜霉素殘留[J]. 中國(guó)釀造, 2014, 33(8): 153-155. DOI:10.11882/ j.issn.0254-5071.2014.08.035.

[16] MAMANI M C V, REYES F G R, RATH S. Multiresidue determination of tetracyclines, sulphonamides and chloramphenicol in bovine milk using HPLC-DAD[J]. Food Chemistry, 2009, 117(3): 545-552. DOI:10.1016/j.foodchem.2009.04.032.

[17] ALI I, ABOULENEIN H Y, GUPTA V K, et al. Analyses of chloramphenicol in biological samples by HPLC[J]. Analytical Letters, 2009, 42(10): 1368-1381. DOI:10.1080/00032710902954482.

[18] AMELIN V G, VOLKOVA N M, REPIN N A. Simultaneous determination of residual amounts of amphenicols in food by HPLC with UV-detection[J]. Journal of Analytical Chemistry, 2015, 70(10): 1114-1120. DOI:10.1134/S1061934815100020.

[19] LU Y B, ZHENG T L, HE X, et al. Rapid determination of chloramphenicol in soft-shelled turtle tissues using on-line MSPDHPLC-MS/MS[J]. Food Chemistry, 2012, 134(1): 533-539. DOI:10.1016/j.foodchem.2012.02.115.

[20] WU J B, CHEN L Y, MAO P P, et al. Determination of chloramphenicol in aquatic products by grapheme-based SPE coupled with HPLC-MS/MS[J]. Journal of Separation Science, 2012, 35(24): 3586-3592. DOI:10.1002/jssc.201200617.

[21] 楊黎, 廖夏云, 楊瑋婷, 等. 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定以蜂膠為主要原料的保健食品中氯霉素[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(16): 263-267. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201616043.

[22] 郭丹, 陳娜娜, 晏媛, 等. 高效毛細(xì)管電泳法測(cè)定膚炎康霜中氯霉素的含量[J]. 廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào), 2003, 19(3): 232-233. DOI:10.3969/ j.issn.1006-8783.2003.03.015.

[23] PAJCHEL G, MICHALSKA K, GERMAN R, et al. Assay of the related compounds thiamphenicol, florphenicol, and chloramphenicol by CE[J]. Chromatographia, 2008, 68(7): 587-591. DOI:10.1365/ s10337-008-0771-7.

[24] WANG L, ZHANG Y, GAO X, et al. Determination of chloramphenicol residues in milk by enzyme-linked immunosorbent assay: improvement by biotin-streptavidin-amplified system[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry, 2010, 58(6): 3265-3270. DOI:10.1021/jf903940h.

[25] POSYNIAK A, ZMUDZKI J, NIEDZIELSKA J. Evaluation of sample preparation for control of chloramphenicol residues in porcine tissues by enzyme-linked immunosorbent assay and liquid chromatography[J]. Analytica Chimica Acta, 2003, 483(1): 307-311. DOI:10.1016/S0003-2670(02)01487-3.

[26] 陳霞, 楊曉霞, 駱朋輝, 等. 高靈敏度酶聯(lián)免疫法快速檢測(cè)動(dòng)物源性產(chǎn)品中氯霉素殘留的研究[J]. 中國(guó)畜牧獸醫(yī), 2013, 40(6): 233-236. DOI:10.3969/j.issn.1671-7236.2013.06.054.

[27] 管笛, 潘燦平, 王文, 等. 磁微粒酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定玉米中的伏馬毒素B1[J]. 食品科學(xué), 2014, 35(8): 208-211. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201408041.

[28] 何方洋, 馮月君, 吳鵬, 等. 氯霉素化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法的建立[J]. 中國(guó)獸藥雜志, 2012, 46(3): 25-29. DOI:10.3969/ j.issn.1002-1280.2012.03.009.

[29] XU C L, PENG C F, HAO K, et al. Chemiluminescence enzyme immunoassay (CLEIA) for the determination of chloramphenicol residues in aquatic tissues[J]. Luminescence the Journal of Biological & Chemical Luminescence, 2006, 21(2): 126-128. DOI:10.1002/bio.892. [30] TAO X Q, JIANG H Y, ZHU J H, et al. An ultrasensitive chemiluminescent ELISA for determination of chloramphenicol in milk, milk powder, honey, eggs and chicken muscle[J]. Food & Agricultural Immunology, 2013, 25(1): 137-148. DOI:10.1080/095401 05.2012.753513.

[31] BAI Z H, LUO Y B, XU W T, et al. Development of a new fluorescence immunochromatography strip for detection of chloramphenicol residues in chicken muscles[J]. Journal of the Science of Food & Agriculture, 2013, 93(15): 3743-3747.

[32] XU N F, XU L G, MA W, et al. An ultrasensitive immunochromatographic assay for non-pretreatment monitoring of chloramphenicol in raw milk[J]. Food & Agricultural Immunology, 2015, 26(5): 1-10. DOI:10.1080/09540105.2014.998640.

[33] BYZOVA N A, ZVEREVA E A, ZHERDEV A V, et al. Rapid pretreatment-free immunochromatographic assay of chloramphenicol in milk[J]. Talanta, 2010, 81(3): 843-848. DOI:10.1016/ j.talanta.2010.01.025.

[34] ZHOU C N, ZHANG X Y, HUANG X X, et al. Rapid detection of chloramphenicol residues in aquatic products using colloidal gold immunochromatographic assay[J]. Sensors, 2014, 14(11): 21872-21888. DOI:10.3390/s141121872.

[35] HSIEH K H, LIN C P, CHENG C C, et al. Screening procedures for chloramphenicol residue determination in serum, milk, and feedstuff using immunochromatographic assay[J]. Food Biotechnology, 2013, 27(4): 328-341. DOI:10.1080/08905436.2013.838784.

Development of Magnetic Bead-Based Chemiluminescent Enzyme Immunoassay for Chloramphenicol Detection in Swine Muscle

WANG Ling1, GUAN Di2, ZHOU Xin1, GAO Shutao1, ZANG Xiaohuan1, WEI Ying2
(1. College of Science, Hebei Agricultural University, Baoding 071001, China; 2. Beijing Center for Physical and Chemical Analysis, Beijing 100089, China)

A chemiluminescent enzyme immunoassay based on magnetic beads was developed for quantitative determination of chloramphenicol (CAP) residues in pork samples. Sample, anti-chloramphenicol antibody, and magnetic beads coated with goat anti-mouse antibody were mixed on the microwell plate. After reacting for a certain period of time, CAP-horseradish peroxidase (HRP) was added and incubated. Then chemiluminescence substrate solution was added after washing the magnetic beads three times. Ten minutes later, the results were recorded by a microplate reader. Besides, the amount of magnetic beads coated with goat anti-mouse antibody, CAP-HRP, antibody concentration and reaction pattern were optimized. A sensitive and accurate magnetic bead-based chemiluminescent enzyme immunoassay for CAP was successfully developed. The limit of detection was 0.013 μg/kg, and good linear relationship was observed in the concentration range between 0.060 and 2.421 μg/kg. The recoveries of spiked pork samples varied from 85.24% to 93.57%, with relative standard deviation of less than 11.5%.

chemiluminescent enzyme immunoassay; chloramphenicol; magnetic beads; swine muscle

10.7506/spkx1002-6630-201710049

TS207.3

A

1002-6630（2017）10-0305-05

王玲, 管笛, 周欣, 等. 磁性化學(xué)發(fā)光酶免疫法檢測(cè)豬肉中的氯霉素[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(10): 305-309. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201710049. http://www.spkx.net.cn

WANG Ling, GUAN Di, ZHOU Xin, et al. Development of magnetic bead-based chemiluminescent enzyme immunoassay for chloramphenicol detection in swine muscle[J]. Food Science, 2017, 38(10): 305-309. (in Chinese with English abstract)

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201710049. http://www.spkx.net.cn

2016-10-21

河北省科技廳科技支撐重點(diǎn)項(xiàng)目（肉類及豆制品中有害物質(zhì)的殘留檢測(cè)）（14227115D）

王玲（1963—），女，教授，本科，研究方向?yàn)榉治龌瘜W(xué)。E-mail：wanglinghbnd@163.com