Elongator復(fù)合物在低濃度氨基酸條件下對TORC1活性的影響

何 格，滕昕辰

Elongator復(fù)合物在低濃度氨基酸條件下對TORC1活性的影響

何 格，滕昕辰

（蘇州大學(xué)藥學(xué)院，蘇州，215000）

目的：研究Elongator復(fù)合物在低濃度氨基酸條件下對TORC1活性的影響。方法：通過生長實(shí)驗(yàn)來觀察Elongator突變體在低濃度氨基酸和低濃度亮氨酸條件下的生長程度；通過免疫印跡法檢測核糖體蛋白S6的磷酸化水平來檢測TORC1的活性；將GFP-ATG8質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到Elongator突變體及野生型酵母菌株WT里，并通過免疫印跡法檢測游離的GFP蛋白的水平來檢測體內(nèi)自噬。結(jié)果：生長實(shí)驗(yàn)顯示Elongator突變體在低濃度氨基酸條件下顯示過度生長的特性，并且這種過度生長可被TORC1抑制劑雷帕霉素所抑制；免疫印跡檢測TORC1活性的實(shí)驗(yàn)以及檢測體內(nèi)自噬實(shí)驗(yàn)顯示Elongator突變體在低濃度氨基酸條件下TORC1活性上升，而自噬進(jìn)程被抑制；進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明Elongator 突變體可特異性忽略低濃度亮氨酸而激活TORC1，抑制自噬，從而持續(xù)生長。結(jié)論：Elongator復(fù)合物在氨基酸信號(hào)下可抑制TORC1的活性，同時(shí)促進(jìn)體內(nèi)自噬進(jìn)程。推測Elongator復(fù)合物可通過抑制TORC1信號(hào)通路確保細(xì)胞內(nèi)蛋白翻譯的準(zhǔn)確性。

Elongator復(fù)合物；TORC1活性；氨基酸信號(hào)

引言

真核生物里的Elongator復(fù)合物最早是由Otero等從酵母中分離出來的[1],它能夠與RNA聚合酶Ⅱ（RNAPII）緊密結(jié)合。因?yàn)檫@種蛋白質(zhì)復(fù)合物與RNAPII的穩(wěn)定結(jié)合依賴于RNAPII的C末端結(jié)構(gòu)域（CTD）的高度磷酸化[2]，而這種磷酸化是轉(zhuǎn)錄延伸的標(biāo)記，所以將這種復(fù)合物命名為延伸（Elongator）復(fù)合物。自其被發(fā)現(xiàn)以來，Elongator復(fù)合物被報(bào)道參與一系列細(xì)胞活動(dòng)，諸如組蛋白乙?；旧|(zhì)的修飾﹑DNA去甲基化﹑參與維持基因的穩(wěn)定性等。Elongator復(fù)合物含有六個(gè)亞基，通常形成兩個(gè)三亞基復(fù)合物，其中較大的核心復(fù)合物是由Elp1﹑Elp2和Elp3亞基組成[1]，另一個(gè)較小的復(fù)合物是由Elp4﹑Elp5和Elp6組成[3,4]。Elongator復(fù)合物的組成亞基在酵母和人之間是高度保守的[5,6]。令人驚奇的是[7,8]，在酒釀酵母[1,3,9]﹑擬南芥[10]以及黑腹果蠅等生物體內(nèi)缺失任何一個(gè)Elongator亞基都會(huì)顯示出相似的表型，說明這六個(gè)亞基中的任意一個(gè)對維持Elongator復(fù)合物的結(jié)構(gòu)完整性及酶活性來說都是必須的。

之前我們實(shí)驗(yàn)室通過文庫篩選發(fā)現(xiàn)敲除酵母內(nèi)Elongator復(fù)合物的任一亞基均會(huì)導(dǎo)致該突變菌株產(chǎn)生在低濃度氨基酸條件下過度生長的表型。氨基酸不僅是蛋白質(zhì)合成的重要前體，還作為信號(hào)分子被細(xì)胞內(nèi)的感應(yīng)器所感應(yīng)從而參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[11-13]。雷帕霉素靶點(diǎn)蛋白復(fù)合物1（target of rapamycin complex1, TORC1）是細(xì)胞內(nèi)感受氨基酸信號(hào)并調(diào)控細(xì)胞生長的重要機(jī)制[14]。當(dāng)氨基酸富足時(shí)，TORC1活性上升，并進(jìn)一步激活下游靶標(biāo)分子，提高轉(zhuǎn)錄翻譯水平，抑制自噬，促進(jìn)細(xì)胞生長[15]。當(dāng)氨基酸缺乏時(shí)，TORC1活性下降，轉(zhuǎn)錄翻譯被抑制，自噬進(jìn)程被激活，細(xì)胞生長停滯[16,17]。TORC1信號(hào)通路的失調(diào)會(huì)導(dǎo)致環(huán)境營養(yǎng)水平和細(xì)胞生長的脫節(jié)，是許多疾病的成因[18-20]。雖然有研究顯示Elongator復(fù)合物在果蠅細(xì)胞內(nèi)可通過胰島素激活TORC1的信號(hào)通路發(fā)揮作用，但目前并沒有Elongator復(fù)合物與氨基酸信號(hào)通路有直接聯(lián)系的相關(guān)報(bào)道。本文將會(huì)研究探索Elongator突變體在氨基酸缺乏條件下對TORC1活性的影響，將為完善Elongator復(fù)合物的生理功能提供幫助以及因Elongator功能缺失導(dǎo)致的疾病的治療提供分子基礎(chǔ)。也有利于我們進(jìn)一步豐富以及完善TORC1信號(hào)通路，并為研發(fā)以該信號(hào)通路為靶點(diǎn)的藥物做出貢獻(xiàn)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 酵母菌株

所用酵母菌株及其基因型名稱見表1

1.1.2 質(zhì)粒

酵母表達(dá)所用質(zhì)粒見表2

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母常用液體培養(yǎng)基CSH含0.17%酵母氮基（無氨基酸和硫酸銨）（生工，S505），0.5%硫酸銨（生工，A0191），0.2% CSH氨基酸混合物；ME含0.17%酵母氮基（無氨基酸和硫酸銨），0.5%硫酸銨，0.124% ME氨基酸混合物。實(shí)驗(yàn)過程中所使用的CSH及ME氨基酸混合物組分見表3。在液體培養(yǎng)基中添加2%瓊脂即得固體培養(yǎng)基。

1.1.4 化學(xué)試劑

化學(xué)發(fā)光HPR底物及PVDF膜購于MILLIPORE公司；玻璃珠（酸洗過的），蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑購于Sigma公司；蛋白Marker購于Thremo公司；PGK1抗體（22C5D8）購于Abcam公司；GFP 抗體（B-2）購于Santa Cruz公司；Phospho-S6（Ser235/236）抗體，HRP-linked Anti-mouse IgG及HPR-linked Anti-rabbit IgG購于CST公司。

表1 酵母菌株

1.2 方法

1.2.1 檢測酵母TORC1的活性

挑酵母單克隆到3 mL CSH液體培養(yǎng)基中并放在15 mL的無菌培養(yǎng)管在30℃恒溫培養(yǎng)箱中搖過夜。使用紫外可見分光光度計(jì)測量過夜酵母菌液的OD值（吸光度）。用1.5 mL離心管離心6 OD酵母（13000 rpm/min室溫離心1 min），去除上清，然后用6 mL富足培養(yǎng)基CSH使之重懸在15 mL無菌培養(yǎng)管中，于30℃搖床里培養(yǎng)1 h。測量OD值，離心3管2 OD酵母，去上清。其中一管把沉淀存放于-20℃作為0點(diǎn)的樣本。另外兩管分別用1 mL ddH2O洗一次，用2 mL ME 培養(yǎng)基重懸，在30℃搖床中培養(yǎng)3 h和6 h，并在指定的每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)離心2 OD酵母，沉淀存放于-20℃。其中每管2 OD酵母，加200 μL SDS裂解液，在處理時(shí)按1:1000分別現(xiàn)加蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑。加大約100 μL無菌玻璃珠，在漩渦混勻儀高速震蕩45 s × 4，每次在冰上間隔30 s。干式恒溫器100℃煮5 min。進(jìn)行蛋白免疫印記（WB）。用12% SDS-PAGE 膠，每孔上樣15 μL。用p-S6抗體（TORC1活性指示蛋白，1:1000, 二抗兔），PGK抗體（參照蛋白, 1:1000，二抗鼠) 標(biāo)記。

表3 CSH及ME培養(yǎng)基中氨基酸組分列表

1.2.2 酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

劃出酵母菌到 YPD 瓊脂板上，放在 30℃恒溫培養(yǎng)箱長兩天后取出瓊脂板。挑單克隆到2 mL YPD液體培養(yǎng)基中，在 30℃搖過夜。測定過夜菌液的OD值，并把濃度稀釋到OD600 = 0.25。搖大約4 h左右,使菌液OD600大約等于0.8，測定OD值。將每個(gè)轉(zhuǎn)染用1.5 mL離心管離心（13000 rpm/ min，1 min）1 mL酵母菌液，并去除上清，將沉淀用1 mL 0.1 M醋酸鋰重懸，離心13000 rpm/min，1 min，去除上清。隨后將沉淀再用100 μL 0.1 M醋酸鋰重懸，這時(shí)得到的就是感受態(tài)酵母。取變性蛙魚精子DNA（其中每個(gè)轉(zhuǎn)染需加入5 μL），在100℃金屬加熱器煮5 min并立刻放在冰上。隨后在先前制備好的100 μL感受態(tài)酵母中按順序加入0.5 μg質(zhì)粒DNA，5 μL蛙魚精子DNA，350 mL PLATE Mix。間歇震蕩直到完全混勻。在30℃搖床中孵育30 min。然后在42℃水浴中加熱10 min。離心并去除上清。用100 μL ddH2O重懸酵母沉淀，并涂到選擇性培養(yǎng)板上。

1.2.3 酵母菌株生長實(shí)驗(yàn)

首先準(zhǔn)備好無菌的平底96孔板，先在每個(gè)孔中加入200 μL符合實(shí)驗(yàn)要求的培養(yǎng)基，按照順序挑單克隆溶在做好標(biāo)記的孔中，在30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。準(zhǔn)備一次性無菌96孔板，用排槍吸取80 μL滅菌水依次放到96孔板中，6列。隨后按照1:5梯度稀釋：用排槍先混勻已經(jīng)培養(yǎng)了48 h的酵母菌，然后吸取20 μL到第一排，混勻一下然后吸取20 μL到第二排，依次進(jìn)行到第6排。這是五倍濃度梯度稀釋菌液。接下來點(diǎn)板，事先準(zhǔn)備好將要用的培養(yǎng)板，從梯度稀釋濃度最低的那一排開始，用排槍依次吸取5 μL菌液點(diǎn)到培養(yǎng)板上。然后把培養(yǎng)板放回培養(yǎng)箱，在30℃培養(yǎng)2～3天。最后在成像儀上拍照。

1.2.4 酵母蛋白的蛋白質(zhì)印記

將用于檢測TORC1活性所制備的樣品裂解后（見1.2.1），用12% SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)移到 PVDF 膜上，用 5%牛奶在試問中封閉 0.5 h，一抗（用1%的牛奶按1:1000稀釋）放置在 4oC下孵育過夜，用 PBST 洗膜4次，每次10分鐘。再用二抗（用1%牛奶按1:20000稀釋）封閉并在室溫下孵育1 h，用 PBST 洗膜5次，每次5分鐘。洗膜完畢之后用化學(xué)發(fā)光液均勻地浸濕膜，大約1-2分鐘，隨后放在在成像儀里成像適當(dāng)?shù)臅r(shí)間，最后處理圖像。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有的數(shù)據(jù)最后都用Mean ± SEM即平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。統(tǒng)計(jì)分析用 GraphPad Prism 5 軟件來進(jìn)行并制作圖表。兩組數(shù)據(jù)之間的統(tǒng)計(jì)采用t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)之間的運(yùn)用 One-way ANOVA進(jìn)行比較，并認(rèn)為p ＜ 0.05 時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Elongator突變體在低濃度氨基酸條件下顯示過度生長特性，并且這種過度生長可以被雷帕霉素抑制

我們從酵母全基因組缺失庫里選取了Elongator復(fù)合物的突變體菌株來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，不同亞基缺失相對應(yīng)的突變體分別是Δelp1﹑Δelp2﹑Δelp3﹑Δelp4﹑Δelp5和Δelp6。我們以野生型酵母菌株WT作為陰性對照，分別在氨基酸富足的培養(yǎng)基CSH﹑低濃度氨基酸培養(yǎng)基ME上進(jìn)行生長實(shí)驗(yàn)。我們發(fā)現(xiàn)，在CSH上WT與Elongator突變體都可以生長良好，但是在ME培養(yǎng)基上，WT菌株的生長受到了抑制，這是因?yàn)榧?xì)胞能夠感知低濃度氨基酸從而停止生長。與WT菌株不同，Elongator突變體似乎可以忽略低濃度氨基酸信號(hào)，仍然持續(xù)生長，表現(xiàn)出了過度生長的表型。由于TORC1復(fù)合物是細(xì)胞中感知氨基酸信號(hào)并調(diào)控細(xì)胞生長的重要機(jī)制，為了鑒定這種過度生長是否和TORC1信 號(hào)通路相關(guān)，我們考察了TORC1抑制劑雷帕霉素對這種過度生長的影響。當(dāng)我們在低濃度氨基酸培養(yǎng)基ME中加入雷帕霉素后，我們發(fā)現(xiàn)Elongator突變體的這種過度生長可以被抑制。這個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果暗示Elongator突變體的過度生長與TORC1信號(hào)通路相關(guān)。

圖1 Elongator突變體在低濃度氨基酸條件下顯示過度生長的特性，并且這種過度生長可以被雷帕霉素抑制

WT和Elongator突變體在營養(yǎng)富足（CSH）培養(yǎng)基，低濃度氨基酸（ME）培養(yǎng)基和含5 μg/L 雷帕霉素的ME培養(yǎng)基上的生長實(shí)驗(yàn)，其中菌液分別被五倍濃度梯度稀釋后點(diǎn)在上述三種培養(yǎng)板上。

2.2 Elongator突變體在低濃度氨基酸條件下通過激活TORC1的活性導(dǎo)致過度生長

從上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果中我們發(fā)現(xiàn)雷帕霉素可以抑制Elongator突變體的過度生長。由于雷帕霉素是TORC1的特異性抑制劑，我們認(rèn)為野生型Elongator復(fù)合物可能具有抑制TORC1活性的功能。所以當(dāng)Elongator復(fù)合物的亞基缺失導(dǎo)致突變時(shí)，就解除了對TORC1活性的抑制，從而導(dǎo)致TORC1活性升高，細(xì)胞過度生長。為了驗(yàn)證這個(gè)猜想，我們需要檢測Elongator突變體中TORC1的活性。TORC1可以通過磷酸化激活其下游靶標(biāo)分子——核糖體蛋白S6。當(dāng)TORC1活性增強(qiáng)時(shí)，其下游S6蛋白的磷酸化水平也會(huì)提高，所以可以根據(jù)S6蛋白的磷酸化水平來檢測TORC1的活性。我們采用免疫印跡檢測了不同Elongator亞基缺失菌株在低濃度氨基酸條件下S6蛋白的磷酸化水平。圖2顯示ELP1﹑ELP2﹑ELP3﹑ELP4﹑ELP5﹑ELP6基因缺失菌株在低濃度氨基酸條件下，TORC1的活性都要高于WT酵母菌株。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，Δelp1﹑Δelp2﹑Δelp3﹑Δelp4﹑Δelp5和Δel6的實(shí)驗(yàn)組與WT相比是有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的。以上結(jié)果說明，與WT菌株不同，Elongator突變體在低濃度氨基酸的條件下仍能保持較高的TORC1活性，從而導(dǎo)致細(xì)胞過度生長。

圖2 Elongator突變體在低濃度氨基酸條件下仍保持較高的TORC1活性

（A）在低濃度氨基酸條件下檢測WT菌株與ELP1和ELP2基因缺失菌株的TORC1的活性。Δelp1和Δelp2實(shí)驗(yàn)組(低濃度氨基酸處理3h)與WT對照組(低濃度氨基酸處理3h)相比較，0.001＜**P＜0.01，***P＜0.001有顯著性差異，Δelp1和Δelp2實(shí)驗(yàn)組(低濃度氨基酸處理6h)與WT對照組(低濃度氨基酸處理6h)相比較，0.001＜##P＜0.01有顯著性差異。（B）在低濃度氨基酸條件下檢測WT菌株與ELP3和ELP5基因缺失菌株的TORC1活性，Δelp3和Δelp5實(shí)驗(yàn)組(低濃度氨基酸處理3h)與WT對照組(低濃度氨基酸處理3h)相比較，*P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Δelp3和Δelp5實(shí)驗(yàn)組(低濃度氨基酸處理6h)與WT對照組(低濃度氨基酸處理6h)相比較，0.001＜##P＜0.01，###P＜0.001有顯著性差異。（C）低濃度氨基酸條件下檢測WT菌株與ELP4和ELP6基因缺失菌株的TORC1活性。Δelp4和Δelp6實(shí)驗(yàn)組(低濃度氨基酸處理3h)與WT對照組(低濃度氨基酸處理3h)相比較，0.001＜**P＜0.01，***P＜0.001有顯著性差異，Δelp4和Δelp6實(shí)驗(yàn)組(低濃度氨基酸處理6h)與WT對照組(低濃度氨基酸處理6h)相比較，0.001＜##P＜0.01，###P＜0.001有顯著性差異。作圖及方差分析均用GraphPad Prism5軟件完成，數(shù)據(jù)來源于3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，誤差線為標(biāo)準(zhǔn)方差。

2.3 在低濃度氨基酸條件下Elongator突變體體內(nèi)的自噬可以被抑制

由于TORC1活性的變化可以影響體內(nèi)的自噬過程,所以，我們設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)來觀察Elongator突變體體內(nèi)的自噬通路在低濃度氨基酸條件下是否有所改變。我們利用一個(gè)自噬檢測體系——一個(gè)由ATG8啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GFP-ATG8表達(dá)質(zhì)粒。當(dāng)自噬被誘導(dǎo)時(shí)，GFP-ATG8表達(dá)；當(dāng)自噬進(jìn)一步進(jìn)行時(shí)，ATG8蛋白被降解，產(chǎn)生自由的GFP蛋白（圖3A）。

我們分別在Δelp1﹑Δelp2﹑Δelp3﹑Δelp4﹑Δelp5﹑Δelp6這六種突變菌株和WT中轉(zhuǎn)入GFP-ATG8質(zhì)粒，并通過檢測突變體及WT酵母菌株細(xì)胞內(nèi)游離GFP蛋白的表達(dá)量來觀察自噬水平的變化。將WT菌株在6h的GFP蛋白的表達(dá)量設(shè)定為1，其他時(shí)間點(diǎn)的GFP蛋白的表達(dá)量與WT菌株6h的GFP蛋白的表達(dá)量的比值即為%Free GFP的值。由WB結(jié)果（圖3B/3C/3D）可知在低濃度氨基酸條件下，Elongator突變體內(nèi)的游離GFP蛋白的表達(dá)量是明顯低于WT菌株的。這說明在低濃度氨基酸條件下， Elongator突變體體內(nèi)的自噬進(jìn)程被抑制了。這和Elongator突變體中的高TORC1活性是吻合的。

圖3.在低濃度氨基酸條件下Elongator突變體體內(nèi)的自噬可以被抑制

（A）在低濃度氨基酸條件下處理3h和6h之后檢測WT菌株與ELP1和ELP2基因缺失菌株的自噬水平。（B）在低濃度氨基酸條件下處理3h和6h之后檢測WT菌株與ELP3和ELP5基因缺失菌株的游離GFP蛋白的表達(dá)水平。（C）在低濃度氨基酸條件下處理3h和6h之后檢測WT菌株與ELP4和ELP6基因缺失菌株的游離GFP蛋白的表達(dá)水平。

2.4 Elongator突變體可以特異性忽略低濃度亮氨酸從而導(dǎo)致過度生長

目前已有研究報(bào)道顯示，TORC1并不是對所有氨基酸的敏感程度都一樣，亮氨酸對它的激活格外重要。通過比較CSH和ME培養(yǎng)基的氨基酸成分，我們發(fā)現(xiàn)亮氨酸在CSH中的濃度是ME中的10倍以上。因此，我們想進(jìn)一步考察Elongator突變體是否能特異性感應(yīng)低濃度亮氨酸。我們在不改變其他氨基酸濃度的情況下將CSH培養(yǎng)基里亮氨酸含量降低為原來的10%，發(fā)現(xiàn)和野生型酵母菌株相比，Elongator突變體仍然呈現(xiàn)出過度生長的特性，并且這種過度生長也可以被雷帕霉素所抑制。與低濃度氨基酸條件下十分 相似。所以，我們可以初步得到結(jié)論，Elongator突變體可以特異性忽略低濃度亮氨酸從而導(dǎo)致過度生長。

圖4.Elongator突變體可以特異性忽略低濃度亮氨酸從而導(dǎo)致過度生長，并且這種過度生長可被雷帕霉素抑制

WT和Elongator突變體在營養(yǎng)富足（CSH）培養(yǎng)基，低濃度亮氨酸培養(yǎng)基（10%LEU）和含5 μg/L 雷帕霉素的低濃度亮氨酸培養(yǎng)基上的生長實(shí)驗(yàn)，其中菌液分別被五倍濃度梯度稀釋后點(diǎn)在上述三種培養(yǎng)板上。

2.5 Elongator突變體可以通過特異性忽略低濃度亮氨酸來激活TORC1的活性

從上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果中我們發(fā)現(xiàn)雷帕霉素可以抑制Elongator突變體在低濃度亮氨酸條件下導(dǎo)致的過度生長。根據(jù)上述已有實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們認(rèn)為野生型Elongator復(fù)合物可能具有特異性感受低濃度亮氨酸從而抑制TORC1活性的功能。所以當(dāng)Elongator復(fù)合物缺失導(dǎo)致突變時(shí)，就不能感應(yīng)細(xì)胞內(nèi)亮氨酸濃度，從而解除了對TORC1活性的抑制。我們同樣對低濃度亮氨酸處理之后的酵母菌株進(jìn)行免疫印跡分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖5顯示，在低濃度亮氨酸條件下處理3h和6h之后，Elongator突變體的磷酸化S6蛋白的表達(dá)量均高于WT菌株，并通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這說明，在低濃度亮氨酸條件下，Elongator突變體的TORC1活性也是升高的。以上結(jié)果說明，Elongator突變體可以通過特異性忽略低濃度亮氨酸從而激活TORC1的活性，導(dǎo)致細(xì)胞過度生長。

圖5.Elongator突變體可通過特異性感受低濃度亮氨酸來激活TORC1的活性

（A）在低濃度亮氨酸條件下檢測WT菌株與ELP1和ELP2基因缺失菌株的TORC1的活性。Δelp1和Δelp2實(shí)驗(yàn)組(低濃度亮氨酸處理3h)與WT對照組(低濃度亮氨酸處理3h)相比較，0.001＜**P＜0.01有顯著性差異，Δep1和Δelp2實(shí)驗(yàn)組(低濃度亮氨酸處理6h)與WT對照組(低濃度亮氨酸處理6h)相比較，0.001＜##P＜0.01有顯著性差異。（B）在低濃度亮氨酸條件下檢測WT菌株與Elp3和Elp5基因缺失菌株的TORC1活性。Δelp3和Δelp5實(shí)驗(yàn)組(低濃度亮氨酸處理3h)與WT對照組(低濃度亮氨酸處理3h)相比較，0.001＜**P＜0.01，***P＜0.001有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Δelp3和Δelp5實(shí)驗(yàn)組(低濃度亮氨酸處理6h)與WT對照組(低濃度亮氨酸處理6h)相比較，0.001＜##P＜0.01，###P＜0.001有顯著性差異。（C）低濃度亮氨酸條件下檢測WT菌株與ELP4和ELP6基因缺失菌株的TORC1活性，Δelp4和Δelp6實(shí)驗(yàn)組(低濃度亮氨酸處理3h)與WT對照組(低濃度亮氨酸處理3h)相比較，0.001＜**P＜0.01,***P＜0.001有顯著性差異，Δelp4和Δelp6實(shí)驗(yàn)組(低濃度亮氨酸處理6h)與WT對照組(低濃度亮氨酸處理6h)相比較， ###P＜0.001有顯著性差異。作圖及方差分析均用GraphPad Prism5軟件完成，數(shù)據(jù)來源于3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，誤差線為標(biāo)準(zhǔn)方差。

2.6 Elongator突變體可以特異性忽略低濃度亮氨酸從而抑制體內(nèi)的自噬

我們接下來來考察低濃度亮氨酸會(huì)不會(huì)影響Elongator突變體內(nèi)的自噬。選用上述所說的已轉(zhuǎn)入GFP-ATG8質(zhì)粒的WT菌株和Elongator突變體來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并通過檢測細(xì)胞內(nèi)游離GFP蛋白的表達(dá)量來觀察自噬水平的變化。同樣的將WT菌株在6h的GFP蛋白的表達(dá)量設(shè)定為1，其他時(shí)間點(diǎn)的GFP蛋白的表達(dá)量與WT菌株6h的GFP蛋白的表達(dá)量的比值為%Free GFP的值。由WB結(jié)果（圖6A/6B/6C）可知在低濃度亮氨酸條件下，Elongator突變體內(nèi)的游離GFP蛋白的表達(dá)量是明顯低于WT菌株的。這說明Elongator突變體可以通過特異性忽略低濃度亮氨酸來抑制體內(nèi)自噬進(jìn)程。這與上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果Elongator突變體可特異性忽略低濃度亮氨酸從而導(dǎo)致高TORC1活性是相吻合的。

圖6.Elongator突變體可通過特異性感受低濃度亮氨酸來抑制體內(nèi)自噬過程

（A）在低濃度亮氨酸條件下處理3h和6h之后檢測WT菌株與ELP1和ELP2基因缺失菌株的游離GFP蛋白的表達(dá)水平。（B）在低濃度亮氨酸條件下處理3h和6h之后檢測WT菌株與ELP3和ELP5基因缺失菌株的游離GFP蛋白的表達(dá)水平。（C）在低濃度亮氨酸條件下處理3h和6h之后檢測WT菌株與ELP4和ELP6基因缺失菌株的游離GFP蛋白的表達(dá)水平。

3 討論

包含6個(gè)亞基（Elp1-6）的Elongator復(fù)合物被報(bào)道在許多細(xì)胞生理活動(dòng)中都發(fā)揮作用，包括轉(zhuǎn)錄﹑蛋白乙?；pDNA的去甲基化﹑包外分泌以及tRNA修飾。然而近年來，越來越多的證據(jù)顯示，Elongator復(fù)合物主要是通過調(diào)節(jié)tRNA的修飾從而來維持翻譯的高保真性[7]。已有數(shù)個(gè)研究顯示Elongator復(fù)合物參與tRNA擺動(dòng)位置處尿嘧啶的早期修飾過程。tRNA的第34位核苷酸位于tRNA反密碼子的第一位擺動(dòng)點(diǎn)，此處的核苷酸修飾往往會(huì)影響tRNA對密碼子的識(shí)別。在釀酒酵母中，11個(gè)tRNA反密碼環(huán)的第34位尿苷酸被修飾成5-甲氧羧甲基尿苷（mcm5U），5-氨基酰胺甲基尿苷（ncm5U）以及二硫-5-甲氧羧甲基尿苷（mcm5s2U）。而有研究表明mcm5U 和 ncm5U會(huì)提高尿苷酸與腺苷酸或鳥苷酸配對的效率。

Elongator復(fù)合物亞基的突變會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病，比如家族性自主神經(jīng)異常（FD）[21]﹑肌萎縮側(cè)索硬化癥（ALS）[22]以及羅蘭多癲癇[23]。盡管我們認(rèn)為Elongator復(fù)合物在神經(jīng)退行性疾病中的角色與它調(diào)控著許多細(xì)胞進(jìn)程有關(guān)，但是關(guān)于此復(fù)合物究竟是直接調(diào)控多種細(xì)胞進(jìn)程還是通過調(diào)控一個(gè)進(jìn)程從而導(dǎo)致不同的下游效應(yīng)仍然不清楚。有報(bào)道顯示，提高細(xì)胞內(nèi)tRNALysUUU和 tRNAGluUUc 這兩種被修飾的tRNA水平可繞過轉(zhuǎn)錄和胞外分泌過程中對Elongator復(fù)合物的需求。而且最近在秀麗隱桿線蟲中的研究發(fā)現(xiàn)Elongator并不是一個(gè)直接的微管蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶，而是通過提高AAA密碼子的數(shù)量并進(jìn)行tRNA修飾在翻譯水平上調(diào)節(jié)微管蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)水平。一般認(rèn)為依賴Elongator復(fù)合物進(jìn)行tRNA修飾的過程出錯(cuò)會(huì)通過兩種不同的方式來擾亂轉(zhuǎn)錄，一種是因?yàn)橘嚢彼嶝S富蛋白如核糖體蛋白的翻譯減少而導(dǎo)致整體蛋白質(zhì)的合成減少，另一種是導(dǎo)致翻譯的不精確以及蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊。Elongator參與的一些其他細(xì)胞生理過程也可能與它對翻譯的調(diào)控有關(guān)。

在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，酵母菌株的Elongator復(fù)合物中任意一個(gè)亞基發(fā)生缺失突變都會(huì)導(dǎo)致在氨基酸缺乏條件下TORC1活性的增加以及自噬的降低。這說明Elongator復(fù)合物與氨基酸介導(dǎo)的TORC1信號(hào)通路存在著一定的聯(lián)系。TORC1信號(hào)通路在酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞里是高度保守的，其中哺乳動(dòng)物細(xì)胞里的RagA/B蛋白相對應(yīng)的酵母里的同源蛋白是Gtr1p，RagC/D相對應(yīng)的酵母里的同源蛋白是Gtr2p，并且RagA/B和RagC/D以及Gtr1p和Gtr2p都是以異二聚體的形式存在[20]。當(dāng)環(huán)境中的氨基酸含量充足時(shí)，TORC1的活性就會(huì)被Rag/Gtr復(fù)合物激活，從而激活下游的一些信號(hào)通路比如翻譯來促進(jìn)細(xì)胞的生長。當(dāng)環(huán)境中的氨基酸受到限制時(shí)，GATOR1/SEACIT復(fù)合物作為RagA/Gtr1的GTPase活化蛋白（GTPase-activing protein,GAP）會(huì)使RagA/Gtr1處于非活化狀態(tài)[19]，從而來抑制TORC1的活性并誘導(dǎo)自噬。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Elongator發(fā)生缺失突變的酵母菌株不能通過感應(yīng)低濃度氨基酸信號(hào)來降低TORC1的活性。所以我們認(rèn)為Elongator對于細(xì)胞感應(yīng)氨基酸信號(hào)分子并作出相應(yīng)的應(yīng)答是必不可少的。目前普遍認(rèn)為能夠感應(yīng)氨基酸水平對于維持細(xì)胞的正常生長是至關(guān)重要的[17]。而且越來越多的證據(jù)顯示氨基酸介導(dǎo)的信號(hào)通路失調(diào)將會(huì)造成細(xì)胞生長和營養(yǎng)因子信號(hào)脫節(jié)，導(dǎo)致許多疾病的產(chǎn)生，包括癌癥﹑糖尿病﹑組織肥大﹑神經(jīng)退化以及加速老化等。因?yàn)镋longator在維持翻譯的準(zhǔn)確性里扮演著必不可少的角色，所以Elongator很有可能通過抑制TORC1的活性來防止因過度翻譯而產(chǎn)生錯(cuò)誤折疊的蛋白。盡管關(guān)于Elongator復(fù)合物是通過怎樣的分子機(jī)制來調(diào)節(jié)氨基酸介導(dǎo)的TORC1信號(hào)通路仍然不是很清楚，但是我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)有趣的現(xiàn)象，Elongator發(fā)生缺失突變的酵母菌株在只缺乏亮氨酸的條件下也顯示出較高的TORC1活性。目前已有相關(guān)報(bào)道表明單一亮氨酸足便以激活TORC1。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞里亮氨酰-tRNA合成酶（leucyl-tRNA synthetase，LRS）可作為細(xì)胞內(nèi)亮氨酸的感應(yīng)器[24]，通過與RagD相互作用來激活mTORC1。在酒釀酵母中，Elongator可以修飾亮氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體反密碼子環(huán)的第34位核苷酸形成tRNALeuncm5UmAA，而亮氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體很有可能是作為一個(gè)中間分子調(diào)節(jié)調(diào)細(xì)胞內(nèi)亮氨酸水平和TORC1活性兩者之間的關(guān)系，當(dāng)然這還需要更多的實(shí)驗(yàn)去證明。

4 結(jié)論

本課題運(yùn)用生物化學(xué)及遺傳基因?qū)W等方法探討Elongator復(fù)合物在低濃度氨基酸條件下對TORC1活性的影響。我們發(fā)現(xiàn)Elongator突變體在低濃度氨基酸條件下顯示過度生長的特性，并且這種過度生長可被TORC1抑制劑雷帕霉素（Rapmycine）所抑制。免疫印跡結(jié)果顯示Elongator突變體在低濃度氨基酸條件下TORC1活性上升，而自噬進(jìn)程被抑制。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)顯示Elongator 突變體可特異性忽略低濃度亮氨酸而激活TORC1，抑制自噬，從而持續(xù)生長。我們認(rèn)為野生型Elongator復(fù)合物有抑制TORC1活性的功能，從而防止因TORC1活性過高導(dǎo)致過度翻譯而產(chǎn)生錯(cuò)誤折疊的蛋白。

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The Ef f ec of Elongator Complex on TORC1 in Condition with Low Concentration Amino Acid

He Ge, Teng Xinchen
(College of Pharmaceutical Sciences, Soochow University, 215000)

Aim: To investigate the effect of Elongator complex on TORC1 activity in response to low amino acids.Methods: Determine the growth level of Elongator mutant yeast in low amino acids and low leucine by growth assays; Determine TORC1 activity by immunoblotting phosphorylated ribosomal protein S6; Transform GFP-ATG8 plasmid in Elongator mutant and the wild type yeast cells, and determine the autophagy flux by quantifying the free GFP.Results: Elongator mutant yeast show overgrowth phenotype in low amino acids and such overgrowth phenotype can be abolished by TORC1 inhibitor rapamycin; Elongator mutant cells show elevated TORC1 activity and decreased autophagy flux; Further experiments show that the Elongator mutant cells specifically ignore low leucine signal to maintain high TORC1 activity and inhibit autophagy, thus keep growing.Conclusion: Elongator complex can inhibit TORC1 activity and promote autophagy in response to amino acid signal.It is hypothesized that Elongator complex may inhibit TORC1 signaling pathway to ensure translational fidelity.

Elongator complex; TORC1 activity; amino acid-sensing

R341 [Document Code] A

10.11967/2017150207

R341

A DOI： 10.11967/2017150207

江蘇省青年基金（BK2014318）

何格（1992-），女，碩士研究生，腫瘤藥理學(xué)。

滕昕辰（1980-），女，特聘副教授，腫瘤藥理學(xué)。E-mail:xcteng@suda.edu.cn