GeneXpert MTB/RIF在脊柱結(jié)核診斷中的應(yīng)用

周正，王曉蕾，陳海燕，馬源慧，周西清，景輝，趙躍然

(1濟(jì)南大學(xué)·山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，濟(jì)南250013；2山東省胸科醫(yī)院；3山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)

GeneXpert MTB/RIF在脊柱結(jié)核診斷中的應(yīng)用

周正1,2，王曉蕾2，陳海燕2，馬源慧2，周西清2，景輝2，趙躍然3

(1濟(jì)南大學(xué)·山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，濟(jì)南250013；2山東省胸科醫(yī)院；3山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)

目的 探討GeneXpert MTB/RIF在脊柱結(jié)核診斷中的應(yīng)用價(jià)值。方法 采用GeneXpert MTB/RIF對(duì)臨床及病理檢查確診的72例脊柱結(jié)核患者和20例非脊柱結(jié)核患者的脊柱組織標(biāo)本進(jìn)行檢測，計(jì)算其診斷脊柱結(jié)核的敏感性、特異性、陰性預(yù)測值、陽性預(yù)測值，并與MGIT960液體培養(yǎng)、抗酸涂片染色法進(jìn)行比較；評(píng)價(jià)GeneXpert MTB/RIF檢出利福平(RIF)耐藥性的效能。結(jié)果 GeneXpert MTB/RIF檢測診斷脊柱結(jié)核的敏感性為76.38%(55/72)、特異性為95.00%(19/20)，MGIT 960液體培養(yǎng)診斷診斷脊柱結(jié)核的敏感性為54.60%(39/72)、特異性為90.00 %(18/20)，抗酸涂片染色法診斷診斷脊柱結(jié)核的敏感性為27.77 %(20/72)、特異性為100%(20/20)。GeneXpert MTB/RIF檢測診斷脊柱結(jié)核的敏感性高于MGIT 960液體培養(yǎng)和抗酸涂片染色法(P均<0.05)。結(jié)論 GeneXpert MTB/RIF可輔助診斷脊柱結(jié)核能顯著提高脊柱結(jié)核的檢出率。

脊柱結(jié)核；脊柱組織標(biāo)本評(píng)價(jià)系統(tǒng)；結(jié)核分枝桿菌；利福平；MTB/RIF檢測系統(tǒng)

中國是全球結(jié)核病高發(fā)病率國家之一，結(jié)核病患者數(shù)量僅次于印度[1]。脊柱結(jié)核是結(jié)核病的重要類型之一，占結(jié)核病患者的1%～5%[2]。其中，脊柱結(jié)核占骨結(jié)核的50%[3]。結(jié)核分枝桿菌(MTB)培養(yǎng)和抗酸桿菌染色法是傳統(tǒng)結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。然而，傳統(tǒng)試驗(yàn)存在諸多弊端，如抗酸染色法陽性率偏低，結(jié)核培養(yǎng)周期較長，需3～8周，且對(duì)活菌的要求高。GeneXpert MTB/RIF作為一種快速、有效的分子診斷手段，可在2 h內(nèi)直接從痰液標(biāo)本中檢測MTB和利福平(RIF)耐藥性，其敏感性為67%～98%，特異性為98%[4,5]。本研究采用術(shù)后脊柱病灶組織標(biāo)本，評(píng)價(jià)GeneXpert MTB/RIF在脊柱結(jié)核中的診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2016年1～12月山東省胸科醫(yī)院收治的經(jīng)臨床診斷和病理檢查確診的脊柱結(jié)核患者72例，經(jīng)影像學(xué)檢查明確診斷，排除既往有結(jié)核感染的患者。其中男42例、女30例，年齡11～77歲、平均39.76歲，頸椎結(jié)核2例、胸椎結(jié)核22例、腰椎結(jié)核45例、骶椎結(jié)核3例，癥狀為咳嗽33例、咳痰23例、發(fā)熱15例、咯血8例、胸痛11例、血液傳播2例、繼發(fā)性肺結(jié)核19例，經(jīng)液體藥敏法檢測RIF耐藥38例。選擇同期經(jīng)臨床診斷和病理檢查確診的非結(jié)核患者20例，男11例、女9例，年齡22～45歲、平均37.89歲，椎間盤突出癥11例、其他非結(jié)核疾病9例。兩組均經(jīng)手術(shù)治療，術(shù)中獲取脊椎病灶組織。

1.2 檢測方法 根據(jù)患者病灶不同部位選取疑似結(jié)核病灶組織(膿液、干酪樣組織、肉芽組織等)，將所獲取的脊椎病灶組織進(jìn)行充分粉碎研磨，加入氫氧化鈉、磷酸鹽緩沖液震蕩離心，離心后的沉淀物分成3份待用，分別采用GeneXpert MTB/RIF、MGIT 960液體培養(yǎng)和藥物敏感試驗(yàn)、抗酸涂片染色法進(jìn)行檢測。GeneXpert MTB/RIF檢測：取沉淀物樣本1 mL加入GeneXpert MTB/RIF樣本前處理液2 mL，置于渦旋振蕩器上混勻孵育15 min，取處理液加入反應(yīng)盒后置于GeneXpert檢測模塊中，2 h后判讀結(jié)果。結(jié)果判讀：根據(jù)GeneXpert MTB/RIF探針的循環(huán)閾值(Ct值)，當(dāng)內(nèi)對(duì)照探針Ct值≤38為陽性。MGIT960液體培養(yǎng)和藥物敏感試驗(yàn)：取沉淀物0.5 mL置于添加營養(yǎng)劑和雜菌抑制劑的MGIT960液體培養(yǎng)管中，放于MGIT 960培養(yǎng)儀中，監(jiān)測管中氧氣濃度，當(dāng)氧氣被消耗時(shí)，管底部的熒光顯示劑在特定光源下激發(fā)出熒光，儀器通過數(shù)據(jù)處理得出陽性結(jié)果。對(duì)陽性樣本進(jìn)行RIF(1 μg/mL)藥敏試驗(yàn)?？顾嵬科旧ǎ喊凑铡督Y(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》中的要求進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化操作，當(dāng)涂片結(jié)果≥1+(3～9條抗酸桿菌/100個(gè)視野)時(shí)，該涂片結(jié)果為陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件。以臨床診斷及病理學(xué)檢查為金標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算各類檢查方法診斷脊柱結(jié)核的敏感性、特異性、陰性預(yù)測值、陽性預(yù)測值及其95%置信區(qū)間。以液體藥敏結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)GeneXpert MTB/RIF檢出MTB及RIF耐藥性的準(zhǔn)確性。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GeneXpert MTB/RIF對(duì)脊柱結(jié)核的診斷效能 脊柱結(jié)核患者72例，GeneXpert MTB/RIF 檢測MTB陽性55例、陰性17例，MGIT 960液體培養(yǎng)MTB陽性39例、陰性33例，抗酸涂片染色法MTB陽性20例、陰性52例。非結(jié)核患者20例，GeneXpert MTB/RIF 檢測MTB陽性1例、陰性19例， MGIT 960液體培養(yǎng)MTB陽性2例、陰性18例，抗酸涂片染色法MTB陽性0例、陰性20例。三種檢測方法對(duì)脊柱結(jié)核的診斷效能見表1。

表1 三種檢測方法診斷脊柱結(jié)核的效能比較(%)

注：與MGIT960液體培養(yǎng)、抗酸涂片染色法比較，*P<0.05。

2.2 GeneXpert MTB/RIF對(duì)RIF耐藥性的診斷價(jià)值 GeneXpert MTB/RIF對(duì)38例RIF耐藥患者進(jìn)行檢測，檢出RIF耐藥23例。GeneXpert MTB/RIF對(duì)RIF耐藥的敏感性為81.81%(18/22)，特異性為68.75%(11/16)。

3 討論

近年來，我國脊柱結(jié)核患者日趨增多，并且耐多藥的患者比例較高，約占22%[6]。傳統(tǒng)的結(jié)核培養(yǎng)和抗酸染色涂片方法敏感性較低，常誤診[7]。WHO對(duì)結(jié)核病控制的重點(diǎn)是快速準(zhǔn)確的診斷結(jié)核病尤其是提高耐多藥結(jié)核的診斷能力。在結(jié)核病的分子診斷技術(shù)中，檢測MTB的DNA可提高試驗(yàn)的有效性和準(zhǔn)確性[8]。GeneXpert MTB/RIF以半巢式實(shí)時(shí)定量PCR為基礎(chǔ)，檢測MTB中rpoB基因，檢測周期為2 h左右，并且可以檢測RIF的耐藥性。其在痰標(biāo)本中檢測結(jié)核病以及RIF耐藥性的敏感性和特異性較高，成為WHO推薦的檢測結(jié)核病的方法[9]。本研究以臨床診斷和病理檢查為金標(biāo)準(zhǔn)，使用的標(biāo)本類型為脊柱結(jié)核病灶組織，比較GeneXpert MTB/RIF、MGIT960液體培養(yǎng)、抗酸涂片染色法三種方法對(duì)檢測脊柱結(jié)核的效能。結(jié)果顯示，GeneXpert MTB/RIF的敏感性遠(yuǎn)優(yōu)于MGIT960液體培養(yǎng)、抗酸涂片染色法。Sun等[10]報(bào)道, GeneXpert MTB/RIF結(jié)果敏感性為80%，與本研究的76.38%相符，遠(yuǎn)高于結(jié)核桿菌固體和液體培養(yǎng)。本研究利用GeneXpert MTB/RIF分別與MGIT960液體培養(yǎng)、抗酸涂片染色法合并診斷脊柱結(jié)核，取得較好研究結(jié)果。其中，單獨(dú)使用抗酸涂片診斷結(jié)核病的敏感性僅為27.77%，但與GeneXpert MTB/RIF合并后診斷的敏感性提升至51.85%，使用GeneXpert MTB/RIF聯(lián)合抗酸涂片診斷能顯著的降低了抗酸涂片的假陰性率。使用GeneXpert MTB/RIF聯(lián)合抗酸涂片染色法可以在2 h內(nèi)檢測出MTB和RIF耐藥性的結(jié)果，大大縮短診斷結(jié)核病的TAT時(shí)間[11,12]。本研究中在確診脊柱結(jié)核患者中仍有17例標(biāo)本的GeneXpert MTB/RIF結(jié)果顯示陰性，此假陰性出現(xiàn)的原因可能為脊柱結(jié)核患者在術(shù)前已經(jīng)使用大量的抗結(jié)核藥物，并且手術(shù)后取得的標(biāo)本被其他菌污染，干擾儀器的檢測。

李力韜等[13]用GeneXpert MTB/RIF試驗(yàn)檢測脊柱結(jié)核患者的敏感性和特異性均達(dá)到98%以上，明顯高于本實(shí)驗(yàn)，與以下原因有關(guān)：①李力韜等研究中使用結(jié)核培養(yǎng)陽性的標(biāo)本進(jìn)行GeneXpert MTB/RIF試驗(yàn)，而本實(shí)驗(yàn)直接使用臨床標(biāo)本，未使用結(jié)核培養(yǎng)陽性標(biāo)本菌株。②本實(shí)驗(yàn)樣本量較少，并且病例中有兒童病例，有國外文獻(xiàn)報(bào)道，GeneXpert MTB/RIF 試驗(yàn)檢測兒童結(jié)核患者時(shí)，其敏感性和特異性明顯低于成人[14]。③Arman等[15]試驗(yàn)結(jié)果為重復(fù)試驗(yàn)兩次以上后記錄的最后檢測結(jié)果，而本實(shí)驗(yàn)僅檢測一次。因此，GeneXpert MTB/RIF 檢測次數(shù)的增加會(huì)在一定程度上可以加大其檢測MTB的敏感性和特異性。

本研究以液體藥敏結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，GeneXpert MTB/RIF檢測RIF的敏感性為81.81%，此結(jié)果與國外結(jié)果基本一致。然而特異性為68.75%，有5例標(biāo)本未能檢測出耐藥基因的突變，原因可能為標(biāo)本類型為術(shù)后組織標(biāo)本，標(biāo)本類型差異較大，組織標(biāo)本含菌量較低，粉碎組織不徹底，并且其他組織雜質(zhì)較多，標(biāo)本的采集及運(yùn)輸中存在污染，從而影響GeneXpert MTB/RIF儀器中DNA的擴(kuò)增。

本研究顯示，GeneXpert MTB/RIF是一種快速、準(zhǔn)確診斷脊柱結(jié)核及RIF耐藥性的方法。由于樣本量較少，本文僅就GeneXpert MTB/RIF對(duì)脊柱結(jié)核的診斷價(jià)值進(jìn)行了總體研究，未對(duì)頸椎、胸椎、腰椎、骶椎結(jié)核的診斷進(jìn)一步分析。因此，驗(yàn)證GeneXpert MTB/RIF對(duì)脊柱不同部位結(jié)核的早期診斷意義將是未來的研究方向。

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趙躍然(E-mail：yrzhao@sdu.edu.cn)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.17.032

R529.2

B

1002-266X(2017)17-0090-03

2017-02-24)