不同預后的重癥肺炎患者住院期間血清和肺泡灌洗液TLR4水平、外周血免疫細胞計數(shù)比較

趙丹，寧睿，王春艷，楊國輝

(1貴州大學醫(yī)學院，貴州550000；2貴州省人民醫(yī)院；3貴州省呼吸疾病研究所；4貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院)

不同預后的重癥肺炎患者住院期間血清和肺泡灌洗液TLR4水平、外周血免疫細胞計數(shù)比較

趙丹1，2，3，寧睿4，王春艷4，楊國輝4

(1貴州大學醫(yī)學院，貴州550000；2貴州省人民醫(yī)院；3貴州省呼吸疾病研究所；4貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院)

目的 觀察比較不同預后的重癥肺炎患者住院期間血清和肺泡灌洗液Toll樣受體4(TLR4)水平、外周血免疫細胞計數(shù)[CD3+T、CD4+T、CD8+T、CD19+%、T淋巴細胞+B淋巴細胞+NK細胞計數(shù)(T+B+NK計數(shù))]。方法 內(nèi)科ICU住院治療的重癥肺炎患者43例，根據(jù)住院28 d內(nèi)的轉(zhuǎn)歸(存活或死亡)將患者分為生存組25例、死亡組18例。分別于入院第1、7天采用ELISA法檢測血清及肺泡灌洗液中的TLR4，采用流式細胞儀檢測外周血CD3+T、CD4+T、CD8+T、T+B+NK計數(shù)、CD19+%。結(jié)果 死亡組入院第7天血清、肺泡灌洗液中TLR4水平高于生存組(P均<0.05)。死亡組入院第1天CD19+%高于生存組，入院第7天CD3+T、CD4+T、CD8+T計數(shù)及CD19+%低于生存組(P均<0.05)。結(jié)論 入院28 d內(nèi)死亡的重癥肺炎患者較生存患者TLR4水平升高，CD3+T、CD4+T、CD8+T計數(shù)及CD19+%下降；TLR4水平升高和免疫功能下降的重癥肺炎患者預后不良。

重癥肺炎；Toll樣受體4；免疫細胞

重癥肺炎是臨床常見的急危重癥，可并發(fā)肺部損傷、多器官衰竭、膿毒癥、全身炎癥反應綜合征(SIRS)等，是ICU患者死亡的重要原因之一[1]。重癥肺炎高病死率與患者促炎因子/抗炎因子失衡、免疫功能低下等有關(guān)[2]。Toll樣受體4(TLR4)屬于Ⅰ型跨膜信號轉(zhuǎn)導受體，是連接先天免疫和特異性免疫的紐帶。TLR4通過識別脂多糖(LPS)等病原相關(guān)的分子模式及某些內(nèi)源性配體引發(fā)信號級聯(lián)反應，導致炎癥反應，促進抗原呈遞細胞成熟，調(diào)控獲得性免疫反應[3]。研究表明，TLR4表達水平與糖尿病患者的預后有一定關(guān)聯(lián)[4]。本研究觀察比較了不同預后的重癥肺炎患者TLR4水平、免疫細胞計數(shù)[CD3+T、CD4+T、CD8+T、CD19+%、T淋巴細胞+B淋巴細胞+NK細胞計數(shù)(T+B+NK計數(shù))]，分析重癥肺炎患者TLR4水平及免疫功能對預后的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 在貴州醫(yī)科大學內(nèi)科ICU住院治療的重癥肺炎患者43例，重癥肺炎診斷參照2007年美國感染性疾病協(xié)會(IDSA)/美國胸科協(xié)會(ATS)標準[5]。基礎疾病分別為醫(yī)院獲得性肺炎、慢性阻塞性肺疾病急性加重期、社區(qū)獲得性肺炎、急性呼吸窘迫綜合癥、支氣管哮喘急性發(fā)作。病原學檢查以痰培養(yǎng)為主，依次為銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等。所有研究對象家屬簽署知情同意書。本研究遵循貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院制定的倫理學標準,并得到倫理委員會的批準。根據(jù)住院28 d內(nèi)的轉(zhuǎn)歸(存活或死亡)將患者分為生存組25例、死亡組18例。生存組男14例、女11例，年齡(72.8±14.3)歲；死亡組男10例、女8例，年齡(73.1±15.6)歲。兩組性別、年齡差異無統(tǒng)計學意義。生存組和死亡組入住ICU 24 h內(nèi)急性生理學及慢性健康狀況(APACHE Ⅱ)評分分別為(17.34±5.28)、(24.18±4.09)分，兩組相比，P<0.05。

1.2 血清、肺泡灌洗液中TLR4檢測 分別于入院第1、7天取患者非抗凝的外周靜脈血2 mL，右肺中葉(或影像學檢查所示病灶部位)的肺泡灌洗液20 mL。

將靜脈血及肺泡灌洗液3 000 r/min離心20 min，取上清液1 mL。采用ELISA法檢測TLR4。

1.3 免疫細胞計數(shù)測算 分別于第1、7天取患者抗凝外周靜脈血2 mL，采用流式細胞儀檢測CD3+T、CD4+T、CD8+T、T+B+NK計數(shù)及CD19+%。

2 結(jié)果

2.1 生存組、死亡組血清及肺泡灌洗液TLR4水平比較 死亡組入院第7天血清、肺泡灌洗液中TLR4水平高于生存組(P均<0.05)。同組內(nèi)第1、7天血清、肺泡灌洗液中TLR4水平差異無統(tǒng)計學意義。見表1。

表1 生存組、死亡組血清及肺泡灌洗液中TLR4水平比較

注：與生存組相比，*P<0.05。

2.2 生存組、死亡組免疫細胞計數(shù)比較 死亡組入院第1天CD19+%高于生存組，入院第7天CD3+T、CD4+T、CD8+T計數(shù)及CD19+%低于生存組(P均<0.05)。同組內(nèi)第1、7天相比差異無統(tǒng)計學意義。見表2。

表2 生存組和死亡組CD3+T、CD4+T、CD8+T、T+B+NK計數(shù)及CD19+%比較

注：與生存組相比，*P<0.05。

3 討論

重癥肺炎引起強烈的SIRS和代償性抗炎反應綜合征(CARS)，誘發(fā)多臟器功能障礙綜合征(MODS)。病原菌感染是肺炎的主要病因，約占80%以上[6]。TLRs的信號傳導通過MyD88依賴途徑和MyD88非依賴途徑，MyD88依賴途徑是信號轉(zhuǎn)導的經(jīng)典途徑，主要通過介導NF-κB和促炎細胞因子的產(chǎn)生激發(fā)下游炎癥效應。TLR4作為天然免疫跨膜信號轉(zhuǎn)導受體，與其特異性配體結(jié)合后在細胞內(nèi)募集MyD88，通過其特異的接頭蛋白(MAL)與MyD88橋接，接受信號蛋白IL-1受體相關(guān)激酶(IRAK)，與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TRAF6)相互作用，產(chǎn)生TNF-α、IL-6等多種炎癥因子，導致NF-κB激活[7]，觸發(fā)細胞內(nèi)信號傳遞，合成并釋放一系列細胞因子和炎性介質(zhì)，誘發(fā)炎癥反應[8]。王婷等[9]研究發(fā)現(xiàn)，重癥肺炎導致腎衰竭患者外周血TLR4水平高于正常。本研究中死亡組入院第7天血清、肺泡灌洗液中TLR4水平明顯升高，考慮與機體重癥感染時天然免疫跨膜信號轉(zhuǎn)導受體表達上調(diào)，導致下游促炎因子大量釋放，進一步加重病情有關(guān)。

重癥肺炎時致病微生物引起肺部上皮細胞及間質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能損害，另一方面機體防御反應過度，可出現(xiàn)代償性免疫功能障礙，通過多因素、多環(huán)節(jié)改變引發(fā)瀑布級聯(lián)反應，后者是患者死亡的重要原因[10]。細菌感染可導致CD4+T細胞分化成為Th1細胞，激活并放大免疫反應[11]。T細胞的免疫調(diào)節(jié)作用主要通過CD4+T細胞、CD8+T細胞完成。CD3+T細胞分布于所有成熟的T細胞膜上，協(xié)助T細胞抗原受體轉(zhuǎn)導抗原信息，活化T細胞。CD19在B細胞活化過程中不消失，其表達水平代表B細胞功能水平。研究[12]報道，重癥肺炎患兒的CD3+T、CD3+CD4+T及CD3+CD8+T計數(shù)下降顯著。本研究結(jié)果顯示，重癥肺炎死亡患者CD3+T、CD4+T、CD8+T、T+B+NK計數(shù)均下降，CD19+%下降。CD4+T細胞減少時介導細胞免疫及局部炎癥效應減弱，清除細胞內(nèi)病原體的能力下降。CD8+T細胞減少后，抑制細胞毒性的作用減弱，引起更嚴重的病理損害。CD3+T細胞減少，T細胞活化減少，機體細胞免疫功能進一步降低。CD19+%下降說明合并體液免疫功能減弱。同時，病原菌不斷激活TLR4，T細胞誘導共刺激分子(ICOS)表達上調(diào)[13]，免疫偏移[14]，病情進一步惡化。

局部TLR4的激活可引發(fā)適度而協(xié)調(diào)的炎癥反應，使感染局限。TLR4表達缺陷或反應低下可導致機體對革蘭陰性細菌易感，但TLR4強烈激活則會引起瀑布級聯(lián)反應[15]。研究[16]表明，肺炎克雷伯菌感染可以上調(diào)氣道上皮TLR2、TLR4的表達。本研究結(jié)果顯示，重癥肺炎患者死亡組入院第7天血清及肺泡灌洗液中TLR4水平明顯升高，考慮重癥肺炎狀態(tài)下TLR4識別革蘭陰性菌的磷壁酸、熱休克蛋白(HSP)60、呼吸道合胞病毒的融合蛋白等多種內(nèi)源性和外源性配體[17]，TLR4強烈激活，釋放大量的炎癥因子(TNF-α、IL-1、IL-6等)、脂質(zhì)炎性介質(zhì)(血栓素、血小板激活因子、白三烯等)、一氧化氮、氧自由基等，從而加重細胞和組織損傷，加劇病情，預后不良[18]。

綜上，重癥肺炎患者TLR4水平升高、細胞免疫功能下降，往往導致預后不良。抑制TLR4介導的炎癥瀑布效應，提高患者細胞免疫及體液免疫功能，對減少重癥肺炎病死率、改善預后具有重要意義。但本研究入選患者數(shù)有限，檢測的免疫指標較少，結(jié)論難免有局限性，期待進一步研究證實。

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貴陽市科技合作計劃資助項目(2011103)。

楊國輝(E-mail: guohuiy2006@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.15.030

R563.1

B

1002-266X(2017)15-0096-03

2017-01-05)