利用硫氰酸鋰水溶液提取云南琥珀蠶繭殼絲蛋白的適宜條件研究

李瓊艷+劉增虎+楊偉克+鐘健

摘要：琥珀蠶（Antheraea assama）是一種具有重要利用價值的經(jīng)濟(jì)昆蟲，其蠶絲特性優(yōu)良，在紡織、生物醫(yī)藥、生物材料等領(lǐng)域有較好的開發(fā)利用潛力。本研究利用硫氰酸鋰水溶液提取琥珀蠶繭殼絲蛋白，結(jié)果表明：部分琥珀蠶絲蛋白可得到提取，且提取效率隨提取溫度的升高而提高。在設(shè)置的最高水浴溫度60℃條件下提取12 h后得到的蛋白濃度為10.257 mg/mL，溶解率為8.91%；在60℃溶解條件下進(jìn)行超聲處理（53 kHZ，500W）12 h，蛋白濃度為14.552 mg/mL，溶解率達(dá)16.93%。SDS-PAGE凝膠電泳檢測提取的絲蛋白，顯示不同處理條件下提取的絲蛋白條帶無明顯差異，絲蛋白無明顯降解。提取的絲蛋白在濃度和質(zhì)量上都可滿足實驗室研究的需要。

關(guān)鍵詞：琥珀蠶；繭殼；絲蛋白；硫氰酸鋰

中圖分類號：S886：TS143.2文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2017）05-0124-05

Suitable Extraction Conditions for Yunnan Antheraea assama

Silk Protein using Aqueous Solution of Lithium Thiocyanate

Li Qiongyan， Liu Zenghu， Yang Weike， Zhong Jian

（Institute of Sericulture and Apiculture， Yunnan Academy of Agricultural Sciences， Mengzi 661101， China）

AbstractAntheraea assama is an important economic insect. Its silk shows excellent features， and has a good potential for development and utilization in the fields of textile， biological medicine， biological material and so on. This research used lithium thiocyanate solution to extract A. assama silk protein. The results showed that some A. assama silk protein could be extracted and the extraction efficiency increased with the increase of temperature. At the set maximum bath temperature of 60℃， the protein concentration was 10.257 mg/mL after dissolved for 12 hours and the extraction rate was 8.91%. When keeping the solution temperature of 60℃ and proceeding ultrasonic treatment （53 kHZ， 500 W） for 12 hours， the protein concentration reached 14.552 mg/mL and the extraction rate was 16.93%. SDS-PAGE gel electrophoresis detection results showed that there was no significant difference in the bands of silk protein extracted under different conditions， and there was no obvious degradation of silk protein. The extracted silk protein in both the concentration and quality could meet the needs of laboratory research.

KeywordsAntheraea assama； Cocoon；Silk protein；Lithium thiocyanate

蠶絲是一種天然蛋白纖維，屬多孔性物質(zhì)，透氣性好、吸濕性極佳，被用于紡織業(yè)已有上千年，另外蠶絲具有無毒、無刺激及良好的生物相溶性，有益于人類及哺乳動物細(xì)胞的附著和增殖，所以也被廣泛用于外科手術(shù)縫合線、創(chuàng)口覆蓋材料、藥物控制釋放載體、組織工程學(xué)支架、皮膚修復(fù)材料、人造骨骼、韌帶修復(fù)材料等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究[1-7]。與家蠶相比大蠶蛾科的非桑蠶通常在野外或半野外飼養(yǎng)，其氨基酸的極性更高，生物活性更強(qiáng)[8-10]。大蠶蛾科的琥珀蠶（Antheraea assama）其絲以耐磨和富有金黃色光澤而聞名，與家蠶絲相比其具有更好的強(qiáng)伸力和吸濕性并具有優(yōu)良的生物學(xué)特性，在紡織、生物醫(yī)藥、生物材料等領(lǐng)域有較好的開發(fā)利用潛力，經(jīng)濟(jì)價值較高。但由于琥珀蠶資源限制，目前琥珀蠶的研究相對滯后，對其蛋白的研究更是鮮有報道。

琥珀蠶絲蛋白是一種潛在的生物醫(yī)學(xué)材料。Kar等[11]用家蠶、琥珀蠶和印度柞蠶3種絲蛋白膜進(jìn)行人類成骨細(xì)胞MG-63的細(xì)胞附著性和生長性試驗，結(jié)果表明非桑蠶絲蛋白膜的細(xì)胞相溶性模型可與標(biāo)準(zhǔn)模型媲美，琥珀蠶絲蛋白非常適合作為自然生物工程學(xué)的材料。研究表明，琥珀蠶絲和桑蠶絲的氨基酸組成相似，含有大量的甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸等氨基酸[12]以及大量的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽，三肽能提高細(xì)胞的粘附力并促進(jìn)細(xì)胞生長和擴(kuò)繁[1，13]，可作為良好的組織工程學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)基。另外琥珀蠶絲蛋白還具有很好的血液相容性，可用于構(gòu)建血液仿生支架的體系結(jié)構(gòu)[14]。與桑蠶相比，琥珀蠶絲蛋白在生物醫(yī)學(xué)的運(yùn)用上具有優(yōu)越性。

目前對絲蛋白的研究和利用大多是從絲腺提取物中獲得，如此很難進(jìn)行大規(guī)模的運(yùn)用，而直接將蠶繭溶解來獲得絲蛋白，不僅可以獲得大量的絲蛋白還避免了直接從蠶體中取絲腺的道德問題。但絲蛋白高度結(jié)晶，選擇合適的溶劑及適宜的溶解條件來溶解繭殼獲得絲蛋白，對于絲蛋白的研究和利用有極大的意義。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，提取繭殼蛋白主要采用尿素buffer和硫氰酸鋰（LiSCN）溶液[15，16]，其中尿素buffer主要是提取絲膠蛋白，而LiSCN溶液可以提取絲素蛋白，同時也可溶出絲膠蛋白。另有研究分別利用沸騰的Ca（NO3）2和30、40℃的LiSCN溶液提取柞蠶的絲素蛋白，結(jié)果顯示40℃的LiSCN溶液溶解繭殼蛋白的效率較高[17]。因此，本研究利用LiSCN水溶液在不同條件下溶解琥珀蠶繭殼提取絲蛋白，以期獲得利用LiSCN溶液提取琥珀蠶繭殼絲蛋白的適宜條件，為琥珀蠶絲蛋白的研究以及生物材料制備提供基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

選擇形狀為長橢圓形呈黃褐色且大小適中的云南琥珀蠶蠶繭，剪成大約 1～2 mm2碎片備用。琥珀蠶繭殼由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所提供。

1.2不同溫度下溶解琥珀蠶繭殼

取0.5 g繭殼碎片，加入10 mol/L LiSCN水溶液10 mL，分別置于30、40、50、60℃的水浴環(huán)境中溶解繭殼。每隔1 h對溶解液進(jìn)行一次蛋白濃度測定，12 h后取出未溶解的繭殼用蒸餾水多次沖洗，并在100℃下干燥5 h，稱重，計算繭殼的溶解率。繭殼的溶解率計算公式如下：

溶解率（%）=原重-未溶解的質(zhì)量原重×100。

1.3超聲及振蕩條件下溶解琥珀蠶繭殼

取0.5 g繭殼碎片，加入10 mol/L LiSCN水溶液10 mL，在保持60℃的條件下分別進(jìn)行渦旋振蕩和超聲處理（53 kHZ，500 W），同樣每1 h測一次溶解液的蛋白濃度，并在12 h后取出未溶解的繭殼用蒸餾水多次沖洗后，在100℃下干燥5 h，稱重，計算繭殼的溶解率。

1.4蛋白濃度測定

利用BCA蛋白定量試劑盒（Biomiga，中國）對提取的絲蛋白進(jìn)行定量。首先按照試劑盒說明書將reagent A與reagent B按照1∶50混合，配置成BCA工作液；用水將蛋白標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成0.5 mg/mL；將工作液、蛋白標(biāo)樣及水按照要求加樣到96孔酶標(biāo)板中，混勻，37℃放置30 min，冷卻至室溫，在酶標(biāo)儀（Biotek ELX808IU-PC）中測定562 nm吸光值，測得吸光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將20 μL、10倍稀釋的蛋白樣品加到酶標(biāo)板的樣品孔中，再加入BCA工作液200 μL定量后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算得樣品蛋白濃度。

1.5SDS-PAGE電泳檢測

應(yīng)用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）方法檢測絲蛋白的提取情況及分子量范圍。配制5%濃縮膠和10%分離膠，加樣10 μL，對最終提取的絲蛋白進(jìn)行電泳分離。電泳時濃縮膠電流為10 mA，進(jìn)入分離膠后為20 mA，當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑距分離膠底部1 cm處時，電泳結(jié)束。電泳結(jié)束后固定2 h（固定液：40 mL無水乙醇，10 mL醋酸，50 mL H2O，混勻）；之后分別用70%無水乙醇漂洗2次，水洗1次，20 min/次；0.02% Na2S2O3敏化1 min；水洗3次，20 s/次；硝酸銀染色（染色液：0.4 g AgNO3，20 μL甲醛，100 mL H2O），顯色（顯色液：2 g Na2CO3，10 μL 0.5% Na2S2O3，50 μL甲醛，100 mL H2O）；終止（終止液：1 g甘氨酸，100 mL水）。染色結(jié)束后用透射高精度掃描儀對電泳凝膠進(jìn)行掃描。

1.6數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010 和SPSS 17.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。

2結(jié)果與分析

2.1溫度對絲蛋白提取的影響

如圖1所示，30℃條件下提取的蛋白濃度最低，第2～6 h內(nèi)蛋白濃度變化幅度較小，從第7 h開始逐漸升高，到第12 h濃度達(dá)到6.100 mg/mL；40℃條件下蛋白濃度在12 h內(nèi)變化不明顯，前8 h內(nèi)和50℃條件下提取的蛋白濃度差異較小，從第8 h開始50℃條件下提取的蛋白濃度較40℃高；60℃條件下提取的蛋白濃度在各個時間點都為4個溫度條件下最高，且每小時濃度增大的幅度也較其它3個溫度大，溶解第1 h 蛋白濃度為4.122 mg/mL，已達(dá)到30℃條件下第6 h時的濃度，第12 h濃度達(dá)到10.257 mg/mL。表明相同時間內(nèi)隨著溶解溫度升高提取的蛋白濃度增大，其中60℃條件下提取的蛋白濃度最高。

2.2SDS-PAGE凝膠電泳檢測

SDS-PAGE檢測溶解12 h后提取的絲蛋白，結(jié)果如圖2所示。琥珀蠶絲蛋白連續(xù)分布在整條泳道中，并主要集中在30 kD以上，4個泳道中都能看到在30 kD附近有一條明顯的條帶，95 kD以上的蛋白更加集中并有大量蛋白滯留在膠孔中。為更加清楚地看到分子量較大的絲蛋白的分布，降低分離膠濃度并延長跑膠時間，圖2B結(jié)果顯示，絲蛋白連續(xù)分布在泳道中，主要集中在95 kD以上，且在230 kD處有一條明顯的條帶。從圖2可見4組試驗提取的絲蛋白其蛋白條帶無明顯差異，表明隨著溫度升高，得到的琥珀蠶絲蛋白并沒有發(fā)生明顯降解。因此，本試驗所設(shè)置的4個試驗條件提取琥珀蠶絲蛋白都是可行的。

2.3超聲及振蕩處理對提取絲蛋白的影響

通過以上試驗可知，不同溫度提取的絲蛋白濃度存在差異， 60℃條件下提取的絲蛋白濃度最高，且通過檢測發(fā)現(xiàn)在60℃高溫條件下提取的絲蛋白并無明顯降解。為進(jìn)一步提高絲蛋白的提取效率，本試驗在60℃且保持相同溶劑濃度、浴比條件下分別增加53 kHZ（500 W）超聲及振蕩處理，每隔1 h測定溶解液的蛋白濃度。結(jié)果（圖3）顯示，增加超聲和振蕩處理后，蛋白濃度都有一定程度的增大，且超聲處理的效果更加明顯。增加超聲處理后第1 h的濃度為6.081 mg/mL，已超過無超聲處理第3 h的濃度；第8 h的濃度為10.536 mg/mL，已超過無超聲處理組第12 h時的濃度；第12 h的濃度達(dá)到14.552 mg/mL，是無超聲處理組的1.42倍。說明，增加超聲處理能夠提高蛋白的溶解效率。另外，對增加超聲和振蕩處理后提取的絲蛋白進(jìn)行電泳檢測，結(jié)果（圖4）顯示，其電泳條帶沒有明顯變化，這表明隨著溶解條件的加劇，得到的絲蛋白濃度增大但無明顯降解，說明可通過增加超聲處理來提高絲蛋白的提取效率。

2.4琥珀蠶繭殼的溶解率

不同處理條件下溶解12 h后繭殼的溶解率結(jié)果（表1）顯示，在30～60℃溫度條件下溶解12 h繭殼的溶解率分別達(dá)到5.29%、6.82%、7.71%、8.91%，且隨著溶解溫度的升高溶解率增大，但差異未達(dá)到顯著水平。在60℃條件下增加振蕩處理12 h后其溶解率提高到11.72%，但與60℃溫度處理差異不顯著。在60℃條件下增加超聲處理12 h之后其溶解率提高到16.93%，顯著高于其它處理。溫度升高有利于琥珀繭殼的溶解，超聲和振蕩能提高溶劑在繭殼中的擴(kuò)散，增加溶劑與繭殼的接觸從而增加繭殼的溶解效率，且超聲處理下效果更好。

討論與結(jié)論

本研究結(jié)果表明，LiSCN水溶液能溶解部分琥珀蠶絲蛋白，通過提高溫度及增加超聲能提高溶液在繭殼中的擴(kuò)散速度，從而提高繭殼的溶解度。

大蠶蛾科野蠶的絲素蛋白僅由絲素重鏈fib-H及多聚丙氨酸形成二聚體，而不含絲素輕鏈（fib-L）及P25蛋白[18]。Adarsh等[19]研究結(jié)果顯示，琥珀蠶fib-H基因編碼230 kD的絲素蛋白。絲素重鏈蛋白是琥珀蠶絲蛋白中最重要的蛋白質(zhì)，SDS-PAGE凝膠電泳檢測顯示，230 kD附近有一條明顯的條帶，推測為琥珀蠶絲素重鏈（Aafib-H）蛋白，說明本試驗方法可以提取到琥珀蠶絲素重鏈蛋白。

提取時間較長，絲蛋白之間的次級鍵如氫鍵、疏水鍵、二硫鍵等容易被破壞，所以在提取過程溫度過高、條件太激烈時都有可能引起絲蛋白降解。從圖2和圖4中可以看出，在不同條件下提取的絲蛋白其蛋白條帶差異不明顯，說明在本試驗設(shè)置的條件下絲蛋白間的共價鍵、次級鍵沒有被明顯破環(huán)，蛋白沒有明顯降解。

綜上所述，LiSCN水溶液提取琥珀蠶絲蛋白的方法可行，且在60℃、53 kHZ（500 W）超聲條件下溶解效率最高，溶解12 h后絲蛋白濃度達(dá)到14.552 mg/mL，溶解效率為16.93%，提取的絲蛋白質(zhì)量可滿足普通實驗需要。

參考文獻(xiàn)：

[1]Minoura N， Aiba S， Higuchi M，et al. Attachment and growth of fibroblast cells on silk fibroin[J]. Biochemical & Biophysical Research Communications， 1995， 208（2）： 511-516.

[2]Gotoh Y， Tsukada M， Minoura N. Effect of the chemical modification of the arginyl residue in Bombyx mori silk fibroin on the attachment and growth of fibroblast cells[J]. Journal of Biomedical Materials Research，1998， 39（3）： 351-357.

[3]Inouye K， Kurokawa M， Nishikawa S，et al. Use of Bombyx mori silk fibroin as a substratum for cultivation of animal cells[J]. Journal of Biochemical & Biophysical Methods， 1998， 37（3）： 159-164.

[4]Sofia S， Mccarthy M B， Gronowicz G，et al.Functionalized silk-based biomaterials for bone formation[J]. Journal of Biomedical Materials Research， 2001， 54（1）： 139-148.

[5]Altman G H， Diaz F， Jakuba C，et al.Silk-based biomaterials[J]. Biomaterials， 2003， 24（3）： 401-416.

[6]Chiarini A， Petrini P， Bozzini S，et al. Silk fibroin/poly（carbonate）-urethane as a substrate for cell growth： in vitro interactions with human cells[J]. Biomaterials， 2003， 24（5）： 789-799.

[7]Dal P I， Petrini P， Chiarin A，et al.Silk fibroin-coated three-dimensional polyurethane scaffolds for tissue engineering： interactions with normal human fibroblasts[J]. Tissue Engineering， 2003， 9（6）： 1113-1121.

[8]Sen K， Murugesh B K. Studies on Indian silk. I. Macrocharacterization and analysis of amino acid composition[J]. Journal of Applied Polymer Science， 2004， 92（2）： 1080-1097.

[9]Lucas F， Shaw J T B， Smith S G. Comparative studies of fibroins ： I. The amino acid composition of various fibroins and its significance in relation to their crystal structure and taxonomy[J]. Journal of Molecular Biology， 1960， 2（6）： 339.

[10]Goujon N， Rajkhowa R， Wang X，et al. Effect of solvent on ionic liquid dissolved regenerated Antheraea assamensis silk fibroin[J]. Journal of Applied Polymer Science， 2013， 128（6）：4411-4416.

[11]Kar S， Talukdar S， Pal S. Silk gland fibroin from Indian muga silkworm Antheraea assama as potential biomaterial[J]. Tissue Engineering and Regenerative Medicine， 2013， 10（4）： 200-210.

[12]Freddi G， Gotoh Y， Mori T，et al. Chemical structure and physical properties of Antheraea assama silk[J]. Journal of Applied Polymer Science， 1994， 52（6）： 775-781.

[13]Pierschbacher M D， Ruoslahti E. Cell attachment activity of fibronectin can be duplicated by small synthetic fragments of the molecule[J]. Nature， 1984， 309： 30-33.

[14]Kasoju N， Bora U. Antheraea assama silk fibroin-based functional scaffold with enhanced blood compatibility for tissue engineering applications[J]. Advanced Engineering Materials， 2010， 12（5）： 139-147.

[15]Oyama F， Mizuno S， Shimura K. Studies on immunological properties of fibroin heavy and light chains[J]. Journal of Biochemistry， 1984， 96（6）： 1689-1694.

[16]Wadbua P， Promdonkoy B， Maensiri S，et al.Different properties of electrospun fibrous scaffolds of separated heavy-chain and light-chain fibroins of Bombyx mori[J]. International Journal of Biological Macromolecules， 2010， 46（5）： 493-501.

[17]Tao W， Li M， Zhao C. Structure and properties of regenerated Antheraea pernyi silk fibroin in aqueous solution[J]. International Journal of Biological Macromolecules， 2007， 40（5）： 472-478.

[18]Yonemura N， Sehnal F. The design of silk fiber composition in moths has been conserved for more than 150 million years[J]. Journal of Molecular Evolution， 2006， 63（1）： 42-53.

[19]Adarsh G K， Mita K， Arunkumar K P，et al. Molecular architecture of silk fibroin of Indian golden silkmoth， Antheraea assama[J]. Scientific Reports， 2015， 5：1-16.