泡型肝包蟲病患者血清炎癥因子的抗體芯片檢測(cè)及分析

邵 軍, 王志鑫, 王 虎, 張靈強(qiáng), 李衍飛, 陽(yáng)丹才讓, 任 利, 侯立朝, 周 瀛, 王海久, 樊海寧

1.青海大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽胰外科,青海 西寧 810001; 2.青海省包蟲病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青海大學(xué)包蟲病省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室; 3.青海省衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)

泡型肝包蟲病患者血清炎癥因子的抗體芯片檢測(cè)及分析

邵 軍1,2, 王志鑫1,2, 王 虎1,3, 張靈強(qiáng)1,2, 李衍飛1,2, 陽(yáng)丹才讓1,2, 任 利1,2, 侯立朝1,2, 周 瀛1,2, 王海久1,2, 樊海寧1,2

1.青海大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽胰外科,青海 西寧 810001; 2.青海省包蟲病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青海大學(xué)包蟲病省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室; 3.青海省衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)

目的 應(yīng)用抗體芯片技術(shù)檢測(cè)并分析泡型肝包蟲病患者血清中炎癥因子的表達(dá)及臨床意義。方法 選取泡型肝包蟲病患者與健康對(duì)照組血清標(biāo)本各3份，利用抗體芯片技術(shù)檢測(cè)血清樣品中炎癥因子的水平，采用AAH-INF-G3數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行分析。結(jié)果 與對(duì)照組比較，泡型肝包蟲病患者血清中多種炎癥細(xì)胞因子(CSF-2/3、IL-1α、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12p70、IL-13、IL-15、IL-17A、MCP-1/2、MIG、IFN-γ、TNF-α/β、TGF-β)表達(dá)水平發(fā)生顯著變化(Fold change>2，<0.5；信號(hào)值>400)。其中IL-1α、IFN-γ、TNF-α/β等細(xì)胞因子升高(2倍以上)，IL-12p70、MCP-2等細(xì)胞因子下降(3倍以上)。結(jié)論 免疫調(diào)節(jié)相關(guān)炎癥因子可能參與泡型肝包蟲病慢性炎癥反應(yīng)，可能是揭示泡型肝包蟲病免疫逃逸機(jī)制的重要切入點(diǎn)。

抗體芯片；泡型肝包蟲??；炎癥細(xì)胞因子

泡型肝包蟲病是由多房棘球絳蟲幼蟲寄生所致的一種人畜共患寄生蟲病，流行于廣大牧區(qū)，危害性極大。目前泡型肝包蟲病以手術(shù)切除及藥物治療為主，但治愈率均低。近年對(duì)于炎癥細(xì)胞因子與該疾病關(guān)系研究頗為深入，細(xì)胞因子在泡型肝包蟲病的發(fā)病機(jī)制也不斷地得到闡述?？贵w芯片是一種檢測(cè)生物樣品中蛋白表達(dá)模式的方法，其具有高通量、平行性、高度特異性等優(yōu)點(diǎn)，因此在細(xì)胞因子研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[1]。本研究主要通過抗體芯片技術(shù)檢測(cè)泡型肝包蟲病炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，分析炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)水平變化與泡型肝包蟲病的免疫學(xué)關(guān)系，進(jìn)一步探索針對(duì)寄生蟲感染新的免疫療法。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象及標(biāo)本處理 選取2015年9月-2015年11月青海大學(xué)附屬醫(yī)院泡型肝包蟲病手術(shù)患者3例，男1例，女2例，均來自牧區(qū)且為藏族，年齡30～47歲，平均年齡38歲。臨床表現(xiàn)、影像學(xué)檢查結(jié)果符合衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(WS 257-2006)泡型肝包蟲病的診斷標(biāo)準(zhǔn)，除外合并感染性疾病及其他慢性疾病。同期健康對(duì)照3名，入選對(duì)象均于清晨采靜脈血2 ml，1 h之內(nèi)離心提取血清，置入-80 ℃冰箱保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 采用廣州瑞博奧生物科技有限公司的AAH-INF-G3試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)流程如下：(1)玻片芯片干燥：將玻片芯片(RayBio?Human Inflammation G3 Microarray slides)(1個(gè)玻片上有4個(gè)或者8個(gè)陣列)取出，室溫平衡20～30 min，打開包裝及封條，將芯片放在真空干燥器或者室溫干燥1～2 h。(2)封閉和孵育：每個(gè)芯片孔中加入100 μl的1×封閉液，室溫?fù)u床上孵育1 h，避免產(chǎn)生氣泡；抽去封閉液，樣品離心13 000 r/min，10 min，每個(gè)孔中添加100 μl樣品(血清2倍稀釋上樣)，4 ℃振蕩過夜孵育；使用Thermo Scientific Wellwash Versa芯片洗板機(jī)清洗玻片，每孔250 μl的1×洗液I，清洗8次，每次震蕩10 s，后換用1×洗液II通道進(jìn)行清洗，每孔250 μl的1×洗液II，清洗5次，每次震蕩10 s。每孔加入70 μl生物素標(biāo)記抗體；室溫孵育2 h；清洗，每孔加入70 μl的1 500倍稀釋的熒光劑-鏈霉親和素，用密封條貼住玻片，然后用鋁箔紙包住玻片避光室溫震蕩孵育1～2 h，清洗。(3)熒光檢測(cè)：采用激光掃描儀(GenePix 4000B Microarray Scanner)掃描信號(hào)(激發(fā)頻率=532 nm)。

1.3 數(shù)據(jù)分析及處理 采用AAH-INF-G3的數(shù)據(jù)分析軟件來進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。與對(duì)照組對(duì)比，信號(hào)值>400；Fold change>2，<0.5為差異性表達(dá)因子。

2 結(jié)果

與健康對(duì)照組比較，泡型肝包蟲病患者血清中18種炎癥細(xì)胞因子表達(dá)水平發(fā)生顯著變化(Fold change>2，<0.5；信號(hào)值>400)。熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，與健康對(duì)照組比較，泡型肝包蟲病患者IL-1α、IL-2、IL-6、IL-8、IL-13、IL-15、IFN-γ、TNF-α/β、TGF-β表達(dá)明顯上調(diào)(見表1、圖1)。通過兩組均數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)差比較發(fā)現(xiàn)泡型包蟲病組組間差異相對(duì)較大，而健康對(duì)照組組間差異相對(duì)較小(見圖2)。與健康對(duì)照組比較，泡型肝包蟲病組大部分炎癥細(xì)胞因子表達(dá)上調(diào)，少部分炎癥細(xì)胞因子(IL-12p70、MCP-2)表達(dá)下調(diào)。其中IL-1α、IFN-γ、TNF-α/β等細(xì)胞因子升高(2位以上)；IL-12p70、MCP-2等細(xì)胞因子下降(3倍以上)(見圖3)。

表1 芯片膜上細(xì)胞因子位置列表 (Map of AAH-INF-G3)

Tab 1 List of cytokines on chip film locations (Map of AAH-INF-G3)

ABCDEFGHIJKLM1POS1POS2POS3NEGNEGCCL11CCL24CSF3CSF2ICAM1IFN-γI-309IL-1α2POS1POS2POS3NEGNEGCCL11CCL24CSF3CSF2ICAM1IFN-γI-309IL-1α3IL-1βIL-2IL-3IL-4IL-6sIL-6RIL-7IL-8IL-10IL-11IL-12p40IL-12p70IL-134IL-1βIL-2IL-3IL-4IL-6sIL-6RIL-7IL-8IL-10IL-11IL-12p40IL-12p70IL-135IL-15IL-16IL-17AIP-10MCP1MCP2CSF1MIGMIP-1αMIP-1βMIP-1ōRANTESTGF-β16IL-15IL-16IL-17AIP-10MCP1MCP2CSF1MIGMIP-1αMIP-1βMIP-1ōRANTESTGF-β17TNF-αTNF-βsTNFR1TNFR2PDGF-BBTIMP2NEGNEGNEGNEGNEGNEGNEG8TNF-αTNF-βsTNFR1TNFR2PDGF-BBTIMP2NEGNEGNEGNEGNEGNEGNEG

注：CCL：趨化因子的一類；CSF：集落刺激因子；ICAM：細(xì)胞間黏附分子；IFN：干擾素；I-309：嗜酸粒細(xì)胞趨化蛋白；IL：白細(xì)胞介素；IP-10：CXC趨化因子γ干擾素誘生蛋白10；MCP：?jiǎn)魏思?xì)胞趨化蛋白；MIG：干擾素-γ誘導(dǎo)單核細(xì)胞因子；MIP：巨噬細(xì)胞炎癥蛋白；TGF：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子；TNF：腫瘤壞死因子；sTNFR：腫瘤壞死因子受體；PDGF：血小板衍生的生長(zhǎng)因子；TIMP:基質(zhì)金屬蛋白酶-1抑制劑。

3 討論

包蟲病分布于世界各地，主要分為囊型包蟲病(cysticechinococcosis, CE)和泡型包蟲病(alveolarechinococcosis, AE)，其中AE主要局限于北半球，已經(jīng)成為全球負(fù)擔(dān)性疾病之一[2]。20世紀(jì)50年代AE被描述并在1952年出現(xiàn)正式的文獻(xiàn)報(bào)道[3]。據(jù)報(bào)道，在沒有治療的情況下AE 10年內(nèi)病死率94%以上，已經(jīng)被公認(rèn)為世界上最致命的人畜共患寄生蟲病[4]。中國(guó)是世界上AE高度流行的國(guó)家之一，在我國(guó)新疆、青海、西藏、甘肅、寧夏、內(nèi)蒙古和四川西部流行嚴(yán)重，尤其是青海與四川交界區(qū)域是流行的重要地區(qū)。AE惡性程度高，主要寄生于肝臟，類似惡性腫瘤，呈浸潤(rùn)性、外生性生長(zhǎng)，可發(fā)生肺、腦轉(zhuǎn)移[5]，素有“寄生蟲性肝癌”或“蟲癌”之稱。由于AE患者臨床癥狀出現(xiàn)晚，一般癥狀出現(xiàn)時(shí)已經(jīng)到了晚期[6]，因此治療很困難。

近年來，蛋白質(zhì)芯片技術(shù)常被用于蛋白質(zhì)譜分析、新藥開發(fā)、藥物目標(biāo)識(shí)別、臨床診斷和預(yù)后標(biāo)記篩選?？贵w芯片屬于最常用的一種蛋白質(zhì)芯片，具有高通量、高敏感度、樣品(血液、尿液或組織)消耗少、較全面和準(zhǔn)確地反映疾病發(fā)生、發(fā)展過程中蛋白質(zhì)表達(dá)水平變化等特點(diǎn)，已經(jīng)逐漸發(fā)展成為平行性定性和定量檢測(cè)生物樣品中蛋白質(zhì)分子的重要檢測(cè)手段[7]。盡管抗體芯片已被報(bào)道應(yīng)用于肝細(xì)胞肝癌[8]、感染性疾病[9]等疾病相關(guān)細(xì)胞因子及蛋白水平檢測(cè)中，然而其在泡型肝包蟲病方面的應(yīng)用尚無文獻(xiàn)報(bào)道。與其他寄生蟲感染一樣，泡狀棘球蚴在宿主體內(nèi)成功生存往往需要其對(duì)宿主免疫系統(tǒng)進(jìn)行主動(dòng)的調(diào)節(jié)并逃逸對(duì)其有害的免疫應(yīng)答反應(yīng)，逐漸形成了一系列免疫調(diào)節(jié)機(jī)制[10]。而細(xì)胞因子是炎性疾病重要的調(diào)節(jié)劑，是當(dāng)前關(guān)于發(fā)病機(jī)制的研究熱點(diǎn)之一[11]。近年來細(xì)胞因子在肝包蟲病的作用機(jī)制不斷得到闡述，尤其是IL-6、TNF-α、TGF-β等細(xì)胞因子在肝包蟲病的進(jìn)展中扮演重要角色。因此我們通過抗體芯片技術(shù)檢測(cè)泡型肝包蟲病血清中炎癥因子的表達(dá)，了解炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)在泡型肝包蟲病的慢性疾病進(jìn)程是否存在相關(guān)性。

圖1 血清抗體芯片熒光檢測(cè)掃描結(jié)果 A：健康對(duì)照組；B：泡型肝包蟲病組Fig 1 The results of serum antibody chip fluorescence detection scan A: healthy control group; B: hepatic alveolar echinococcosis group

圖2 兩組差異性細(xì)胞因子組間比較情況(Fold change>2，<0.5; 信號(hào)值>400) A：泡型肝包蟲病組；B：健康對(duì)照組

Fig 2 Comparison of the two groups of differentiated cytokines (Fold change>2，<0.5; signal value>400) A: hepatic alveolar echinococcosis group; B: healthy control group

圖3 兩組比較顯著性表達(dá)細(xì)胞因子(Fold change>2，<0.5；信號(hào)值>400) A：泡型肝包蟲病組；B：健康對(duì)照組

Fig 3 The significantly expressed cytokines of two groups (Fold change>2，<0.5；signal value >400) A: hepatic alveolar echinococcosis group; B: healthy control group

泡型肝包蟲病作為一種寄生蟲感染性疾病，其感染的特點(diǎn)大致是Th2型細(xì)胞因子為主導(dǎo)下調(diào)Th1型細(xì)胞因子的誘導(dǎo)和功能，但Th2型細(xì)胞因子在泡型肝包蟲病感染中的分子機(jī)制及生物學(xué)意義尚未明確[12]。Th1細(xì)胞主要產(chǎn)生Th1類細(xì)胞因子IL-2、TNF-β和IFN-γ，而Th2細(xì)胞主要產(chǎn)生IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13[13]。Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞之間平衡狀態(tài)的打破是很多炎癥及自身免疫性疾病發(fā)病的一個(gè)關(guān)鍵因素。Th17可以分泌IL-17、IL-21、IL-22、IL-23、IL-26等多種細(xì)胞因子，而Treg細(xì)胞能夠分泌IL-4、IL-10和TGF-β，參與自身免疫性疾病、移植免疫、腫瘤免疫等方面，Th17細(xì)胞和Treg的分化也呈互相抑制關(guān)系[14]。包蟲病患者中IL-6的升高可以誘導(dǎo)提高NK及細(xì)胞毒T細(xì)胞的殺傷效應(yīng)，達(dá)到殺滅包蟲的作用；IL-2在寄生蟲感染中，對(duì)寄生蟲免疫應(yīng)答起負(fù)向調(diào)節(jié)作用，這就促進(jìn)了寄生蟲的生長(zhǎng)，Klatzmann等[15]研究表明低劑量IL-2能夠激活Treg細(xì)胞群，從而控制自身免疫性疾病和炎癥。IL-1和TNF-α是影響炎癥進(jìn)程的重要細(xì)胞因子。而TGF-β作用復(fù)雜，全身應(yīng)用TGF-β有明顯的負(fù)性免疫調(diào)節(jié)作用，但局部過多的TGF-β則會(huì)加重炎癥；本研究中促炎因子(IL-1α、IL-6、IL-8、IFN-γ、TNF-α/β)與抗炎因子(IL-2、IL-13、IL-15、TGF-β)的表達(dá)均上調(diào)，而這些因子大部分可由Th1、Th2和Th17、Treg細(xì)胞分泌，因此推測(cè)可能存在Th1與Th2和Th17與Treg細(xì)胞之間功能的失衡，而其他炎性細(xì)胞因子(例如CSF、MCP、MIP等)的表達(dá)也存在顯著差異，因此這些炎癥細(xì)胞因子在泡型肝包蟲病中的作用仍需要其他的方法去驗(yàn)證。

綜上所述，目前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可推測(cè)炎性相關(guān)細(xì)胞因子在泡型肝包蟲病慢性炎癥進(jìn)展中扮演重要角色，Th1與Th2和Th17與Treg細(xì)胞相關(guān)的促炎和抗炎因子均有所上調(diào)，提示泡型肝包蟲病的進(jìn)程中可能存在Th1與Th2型細(xì)胞、Th17與Treg細(xì)胞的功能失衡。由于Th1與Th2型、Th17與Treg細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的作用機(jī)制尚未明確，進(jìn)一步探索細(xì)胞因子的作用機(jī)制及生物學(xué)意義，對(duì)免疫療法在泡型肝包蟲病以后的應(yīng)用研究有重要參考意義。

[1]王艷艷. 抗體芯片分析氯喹對(duì)巨噬細(xì)胞炎性細(xì)胞因子分泌的影響[J]. 重慶醫(yī)學(xué), 2012, 41(3): 214-215. Wang YY. Effect of chloroquine on inflammatory cytokines secretion mouse macrophages by antibody chips [J]. Chongqing Medicine, 2012, 41(3): 214-215.

[2]Torgerson PR, Keller K, Magnotta M, et al. The global burden of alveolar echinococcosis [J]. PLoS Negl Trop Dis, 2010, 4(6): e722.

[3]Drozdova OS. Association of alveolar and unilocular echinococcosis of the liver [J]. Khirurgiia (Mosk), 1952, 5: 76-77.

[4]Wang Q, Huang Y, Huang L, et al. Review of risk factors for human echinococcosis prevalence on the Qinghai-Tibet Plateau, China: a prospective for control options [J]. Infect Dis Poverty, 2014, 3(1): 3.

[5]郭永忠, 丁木拉提, 朱馬拜, 等. 肝泡狀棘球蚴病合并肺、腦轉(zhuǎn)移[J]. 中華肝膽外科雜志, 2005, 11(7): 493-494. Guo YZ, Dingmu LT, Zhu MB, et al. Alveolar Hydatid disease complicated with lung and brain metastases [J]. Chin J Hepatobiliary Surg, 2005, 11(7): 493-494.

[6]Avens HJ, Bowman CN. Development of fluorescent polymerization-based signal amplification for sensitive and non-enzymatic biodetection in antibody microarrays [J]. Acta Biomater, 2010, 6(1): 83-89.

[7]Gao DM, Sun L, Guo K, et al. Applicability of the multiplex quantitative antibody array system for early diagnosis of hepatocellular carcinoma [J]. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi, 2012, 20(10): 785-788.

[8]Zhou Q, Mao YQ, Jiang WD, et al. Development of IGF signaling antibody arrays for the identification of hepatocellular carcinoma biomarkers [J]. PLoS One, 2012, 7(10): e46851.

[9]Natesan M, Ulrich RG. Protein microarrays and biomarkers of infectious disease [J]. Int J Mol Sci, 2010, 11(12): 5165-5183.

[10]馬爾旦·馬合木提, 吐爾洪江·吐遜, 馬海長(zhǎng), 等. IL-17 mRNA在肝臟泡型包蟲病中的表達(dá)及其臨床意義[J]. 中國(guó)現(xiàn)代普通外科進(jìn)展, 2014, 17(10): 771-774. Maerdan MHMT, Tuerhongjiang TX, Ma HC, et al. Expression of IL -17 mRNA in patients with alveolar echinococcosis and its clinical significance [J]. Chin J Curr Adv Gen Surg, 2014, 17(10): 771-774.

[11]Huang X, Grüner B, Lechner CJ, et al. Distinctive cytokine, chemokine, and antibody responses in Echinococcus multilocularis-infected patients with cured, stable, or progressive disease [J]. Med Microbiol Immunol, 2014, 203(3): 185-193.

[12]Siracusano A, Riganò R, Ortona E, et al. Immunomodulatory mechanisms during Echinococcus granulosus infection [J]. Exp Parasitol, 2008, 119(4): 483-489.

[13]姚金晶，陳宜濤. Th1/Th2平衡調(diào)節(jié)與疾病發(fā)生的研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2009, 9(13): 2597-2600 Yao JJ, Chen YT. Advances of regulation Th1/Th2 type cytokines balance in human diseases [J]. Progress in Modern Biomedicine, 2009, 9(13): 2597-2600.

[14]陳淑增, 白劍鵬, 謝永華, 等. 強(qiáng)直性脊柱炎患者外周血Th17、Treg、Th1免疫失衡及其與疾病活動(dòng)相關(guān)性研究[J]. 中國(guó)免疫學(xué)雜志, 2013, 29(8): 834-838. Chen SZ, Bai JP, Xie YH, et al. Expression of transcription factor Th17, Treg and Th1 in peripheral blood from patients with ankylosing spondylitis and its correlation with disease activity [J]. Chinese Journal of Immunology, 2013. 29(8): 834-838.

[15]Klatzmann D, Abbas AK. The promise of low-dose interleukin-2 therapy for autoimmune and inflammatory diseases [J]. Nat Rev Immunol, 2015, 15(5): 283-294.

(責(zé)任編輯：王全楚)

Antibody microarray analysis of the serum inflammatory cytokines in patients with hepatic alveolar echinococcosis

SHAO Jun1,2, WANG Zhixin1,2, WANG Hu1,3, ZHANG Lingqiang1,2, LI Yanfei1,2, YANGDAN Cairang1,2, REN Li1,2, HOU Lizhao1,2, ZHOU Ying1,2, WANG Haijiu1,2, FAN Haining1,2

1.Department of Hepatopancreatobiliary Surgery, the Affiliated Hospital of Qinghai University, Xining 810001; 2.Qinghai Province Key Laboratory of Hydatid Disease Researsh, Qinghai University Provincial Key Laboratory of Hydatid Disease; 3.Qinghai Province Health & Family Planning Commission, China

Objective To detect and analyze the expressions and clinical significances of serum inflammatory factors in patients with hepatic alveolar echinococcosis by antibody arrays. Methods The serum samples of hepatic alveolar echinococcosis patients and healthy controls for each of three copies were selected and the antibody microarray technique was used to detect the serum samples of inflammatory cytokines. Data was analyzed by AAH-INF-G3 software. Results Compared with control group, the expression levels of various inflammatory cytokines (CSF-2/3, IL-1α, IL-2, IL-6, IL-8, IL-12p70, IL-13, IL-15, IL-17A, MCP-1/2, MIG, IFN-γ, TNF-α/β, TGF-β) in patients with hepatic alveolar echinococcosis were significantly changed (Fold change>2, <0.5; signal value>400). IL-1α, IFN-γ, TNF-α/β were increased more than twice times and IL-12p70, MCP-2 were decreased more than 3 times. Conclusion Immunoregulatory-related inflammatory factors may be involved in the chronic inflammatory response of hepatic alveolar echinococcosis, which may be an important entry point for revealing the immune escape mechanism of hepatic alveolar echinococcosis.

Antibody microarray; Hepatic alveolar echinococcosis; Inflammatory cytokines

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.05.024

青海省科技廳項(xiàng)目(2012-N-536，2012-Z-728)；青海省臨床重點(diǎn)建設(shè)?？祈?xiàng)目-肝膽胰外科(青財(cái)社字〔2015〕1714號(hào))；青海大學(xué)中青年課題(2014-QYT-1); 2015年度衛(wèi)生計(jì)生委員會(huì)指導(dǎo)性課題(青衛(wèi)科〔2015〕18號(hào))

邵軍，在讀碩士研究生，研究方向：普外科基礎(chǔ)與臨床研究及包蟲病。E-mail：shj0203@163.com

王虎，教授，碩士生導(dǎo)師。E-mail：whqhxn@126.com;樊海寧,教授，博士生導(dǎo)師。E-mail：fanhaining@medmail.com.cn

R575

A

1006-5709(2017)05-0566-04

2016-09-02