126例子宮內(nèi)膜癌中Lynch綜合征的初步篩查

楊通印，易 韋，褚明亮，張著學(xué)，林永順

126例子宮內(nèi)膜癌中Lynch綜合征的初步篩查

楊通印，易 韋，褚明亮，張著學(xué)，林永順

目的 探討hMSH2、hMSH6、hMLH1、hPMS2蛋白缺失情況和hMLH1基因啟動子甲基化狀態(tài)及Lynch綜合征患者的家系分析，初步進(jìn)行Lynch綜合征相關(guān)子宮內(nèi)膜癌篩查。方法 采用免疫組化SP法檢測126例子宮內(nèi)膜癌中hMSH2、hMSH6、hMLH1、hPMS2蛋白表達(dá)，并用甲基化特異性PCR檢測hMLH1蛋白表達(dá)缺失病例的hMLH1基因啟動子甲基化狀態(tài)。結(jié)果 免疫組化結(jié)果顯示22%(28/126)的病例出現(xiàn)MMR蛋白缺失表達(dá)，其中12例hMLH1-/hPMS2-、6例hPMS2-、4例hMSH2-/hMSH6-，hMSH6-和hMLH1-各3例，以hMLH1和hPMS2蛋白缺失表達(dá)為主。甲基化特異性PCR檢測有hMLH1蛋白表達(dá)缺失的15例子宮內(nèi)膜癌中hMLH1基因啟動子甲基化狀態(tài)，證實9例存在hMLH1基因啟動子甲基化，提示其為子宮內(nèi)膜癌的散發(fā)性病例。結(jié)論 對子宮內(nèi)膜癌患者行MMR蛋白免疫組化SP法染色，結(jié)合甲基化特異性PCR檢測hMLH1基因啟動子甲基化狀態(tài)，是初步篩查Lynch綜合征的有效策略。

子宮內(nèi)膜腫瘤；Lynch綜合征；錯配修復(fù)基因；免疫組織化學(xué)

Lynch綜合征是一種由堿基錯配修復(fù)(mismatch repair, MMR)基因缺陷引起的常染色體顯性遺傳病，具有較高的癌癥傾向。腫瘤的發(fā)生主要與hMSH2、hMSH6、hMLH1及hPMS2的DNA MMR基因胚系突變有關(guān)。在女性Lynch綜合征患者中，惡性腫瘤的高發(fā)部位主要為子宮內(nèi)膜，稱之為Lynch綜合征相關(guān)子宮內(nèi)膜癌，MMR基因的種系突變決定該病的診斷，Lynch綜合征相關(guān)子宮內(nèi)膜癌占子宮內(nèi)膜癌的比率較少(<5%)[1]。目前，診斷Lynch綜合征相關(guān)性子宮內(nèi)膜癌的最可靠方法是分析四種常見的MMR基因，即應(yīng)用hMLH1、hMSH2、hMSH6和hPMS2基因的胚系突變來診斷Lynch綜合征[2]。由于MMR基因突變的異質(zhì)性，突變分析花費(fèi)高、費(fèi)時費(fèi)力，且預(yù)期的陽性率較低；因此對高危患者在進(jìn)行MMR基因突變分析前進(jìn)行預(yù)篩查非常重要。本文著重探討四種常見的MMR基因在Lynch綜合征相關(guān)子宮內(nèi)膜癌中篩查的有效性。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集貴州省人民醫(yī)院2013年1月1日～2015年6月30日確診為子宮內(nèi)膜癌標(biāo)本126例，其中包括子宮內(nèi)膜樣癌82例、21例漿液性癌、14例透明細(xì)胞癌及9例肉瘤樣癌。

1.2 主要試劑 兔抗人hMLH1、hMSH2、hMSH6和hPMS2抗體購自北京中杉金橋公司，工作濃度為1 ∶50；SP試劑盒及DAB顯色劑均購自北京中杉金橋公司。DNA提取試劑盒購自德國QIAGEN公司，甲基化修飾試劑盒及甲基化陽性(陰性)對照均購自美國ZYMO公司，甲基化特異性PCR反應(yīng)試劑ROX購自日本TaKaPa公司，Mix購自上海輝睿生物公司。核酸蛋白質(zhì)濃度測量儀B-500購自上海創(chuàng)萌生物公司，Mx3000P定量PCR擴(kuò)增儀購自美國Stratagene公司。

1.3 HE及免疫組化染色 新鮮標(biāo)本均用10%中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，常規(guī)HE染色及免疫組化SP法染色。免疫組化SP法染色主要操作步驟：切片脫蠟水化，經(jīng)3%H2O2溶液37 ℃水浴浸泡20 min；經(jīng)高壓鍋加熱煮沸4 min，冷卻至室溫；正常羊血清封閉，37 ℃水浴浸泡15 min；滴加一抗，4 ℃過夜，37 ℃ 1 h；滴加二抗，37 ℃水浴放置30 min；加入辣根過氧化物酶，37 ℃水浴放置30 min，PBS沖洗3次，每次5 min；DAB顯色6～8 min，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封固。以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4 結(jié)果判斷 hMLH1、hMSH2、hMSH6和hPMS2蛋白在癌細(xì)胞的表達(dá)，細(xì)胞核被染成強(qiáng)弱不等的棕黃色，出現(xiàn)全核著色、核異質(zhì)性或亞克隆性著色(癌細(xì)胞巢中呈核著色或無著色)和全核無著色的3種表達(dá)模式[3-4]；以全細(xì)胞核不著色判斷為陰性，另2種為陽性。

1.5 基因組DNA提取 按照TIANGEN組織DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行DNA提取，提取后經(jīng)紫外分光光度計法檢測DNA的濃度及純度，-20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 DNA亞硫酸氫鈉修飾及純化回收 按照EZDNA Methylation-GoldTM kit試劑盒(D5005)說明書的操作要求對DNA進(jìn)行修飾及純化，回收純化的DNA。

1.7 甲基化特異性PCR 取修飾后的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，具體步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行。hMLH1甲基化及非甲基化引物：反應(yīng)總體積25 μL，上、下游引物各1 μL，已修飾的DNA模板2 μL，10×Buffer 3 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，TransTaqTMHiFi DNA Polymerase 0.3 μL，ddH2O 15.7 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性7 min，95 ℃ 10 s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 8 s，合計40個循環(huán)，最后72 ℃延伸1 min。取擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像分析儀觀察并分析結(jié)果、拍照。

1.8 家系分析 以MMR蛋白表達(dá)丟失的結(jié)直腸癌患者為核心繪出家系圖，并用系譜分析法確認(rèn)每個家系的遺傳方式，盡可能獲得每例患者詳盡的臨床及病理學(xué)資料。以AmsterdamⅡ標(biāo)準(zhǔn)和中國人遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌(hereditary nonpolyposis colorectal cancer, HNPCC)家系篩檢標(biāo)準(zhǔn)，了解不同篩檢標(biāo)準(zhǔn)間的差異。AmsterdamⅡ標(biāo)準(zhǔn)：(1)家族中至少有兩代垂直傳遞的結(jié)直腸癌；(2)家族中至少有3名或3名以上成員經(jīng)病理證實為結(jié)直腸癌或相關(guān)惡性腫瘤；(3)家族中至少有一名結(jié)直腸癌患者發(fā)病年齡小于50歲。中國人HNPCC家系篩檢標(biāo)準(zhǔn)：家系中至少有2例組織學(xué)證實的結(jié)直腸癌患者，其中2例為父母與子女或同胞兄弟姐妹的關(guān)系，且符合以下任一條：至少1例為多原發(fā)結(jié)直腸癌者(包括腺瘤)；至少1例結(jié)直腸癌發(fā)病早于50歲；家系中至少1例患HNPCC相關(guān)腸外惡性腫瘤(胃、子宮內(nèi)膜癌、小腸癌、腎盂輸尿管癌、卵巢癌、肝膽系統(tǒng)癌)。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MMR蛋白在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá) hMSH2、hMSH6、hMLH1、hPMS2蛋白表達(dá)定位于細(xì)胞核，細(xì)胞核被染成淺棕色至深棕色；細(xì)胞核全著色、異質(zhì)性或亞克隆性著色，為MMR蛋白表達(dá)；若細(xì)胞核全無著色，則為MMR蛋白表達(dá)缺失(圖1～4)。126例子宮內(nèi)膜癌中hMSH2、hMSH6、hMLH1、hPMS2蛋白表達(dá)結(jié)果顯示22%(28/126))的病例出現(xiàn)MMR蛋白表達(dá)缺失，其中12例hMLH1-/hPMS2-、6例hPMS2-、4例hMSH2-/hMSH6-，hMSH6-和hMLH1-各3例，以hMLH1和hPMS2蛋白表達(dá)缺失為主，其中15例hMLH1蛋白表達(dá)缺失。

2.2 甲基化特異性PCR檢測 15例hMLH1蛋白表達(dá)缺失患者中9例有hMLH1基因甲基化(圖5)，提示其為散發(fā)性子宮內(nèi)膜癌。余下的19例可能存在MMR基因的胚系突變。

2.3 MMR蛋白表達(dá)缺失與子宮內(nèi)膜癌臨床病理特征的關(guān)系 MMR蛋白表達(dá)缺失多數(shù)為60歲以下患者，發(fā)生在子宮下段居多，且多數(shù)有豐富的淋巴細(xì)胞浸潤(P<0.05)；MMR蛋白表達(dá)缺失與子宮內(nèi)膜癌的組織學(xué)類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期無關(guān)(P>0.05，表1)。

表1 MMR蛋白表達(dá)缺失與子宮內(nèi)膜癌臨床病理特征的關(guān)系

2.4 家系分析 19例MMR蛋白缺失患者中，符合AmsterdamⅡ標(biāo)準(zhǔn)的家系有3例，2例為hMLH1-/hPMS2-，1例為hMSH2-/hMSH6-。符合中國人HNPCC家系篩檢標(biāo)準(zhǔn)的家系有5例，1例為hMLH1-，2例為hMLH1-/hPMS2-，2例為hMSH2-/hMSH6-。按中國人HNPCC家系篩檢標(biāo)準(zhǔn)，可確診5例為Lynch綜合征相關(guān)的子宮內(nèi)膜癌，最后余下的14例為高危MMR基因突變患者，可進(jìn)行MMR基因的胚系突變分析確定是否為Lynch綜合征相關(guān)的子宮內(nèi)膜癌，且最大程度縮小高昂費(fèi)用的MMR基因突變分析的檢測病例數(shù)。

圖1 MMR蛋白在同一例子宮內(nèi)膜樣腺癌中的表達(dá),SP法:A.胞核呈棕黃色;B.胞核不著色,散在淋巴細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞陽性 圖2 MMR蛋白在同一例子宮低級別漿液性腺癌中的表達(dá),SP法:A.胞核呈棕黃色;B.胞核不著色散在淋巴細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞陽性 圖3 MMR蛋白在同一例子宮透明細(xì)胞癌中的表達(dá),SP法:A.胞核呈棕黃色;B.胞核不著色,散在淋巴細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞陽性 圖4 MMR蛋白在同一例子宮肉瘤樣癌中的表達(dá)，SP法：A.胞核呈棕黃色；B.胞核不著色，散在淋巴細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞陽性

圖5 子宮內(nèi)膜癌組織hMLH1基因甲基化結(jié)果

P.陽性對照；M.甲基化條帶；U.非甲基化條帶；1～15.hMLH1蛋白表達(dá)陰性標(biāo)本

3 討論

Lynch綜合征是一種由MMR基因缺陷引起的常染色體顯性遺傳病，具有較高的癌癥發(fā)生傾向。腫瘤的發(fā)生主要與4種MMR基因的胚系突變有關(guān)，即hMSH2、hMSH6、hMLH1、hPMS2。該病患者首先遺傳了MMR突變基因，從而獲得腫瘤易感性，隨后另一等位基因后天獲得性異常，則DNA復(fù)制錯誤無法恢復(fù)進(jìn)而發(fā)生腫瘤，且患者可同時或異時發(fā)生多種腫瘤，子宮內(nèi)膜和結(jié)直腸是最常發(fā)生腫瘤的部位[5]。發(fā)生在子宮內(nèi)膜的腫瘤稱為Lynch綜合征相關(guān)的子宮內(nèi)膜癌，在遺傳學(xué)上特征表現(xiàn)為MMR基因的胚系突變，致使hMSH2、hMSH6、hMLH1、hPMS2等蛋白1種或多種表達(dá)缺失。利用特異性抗體通過免疫組化檢測hMSH2、hMSH6、hMLH1和hPMS2蛋白表達(dá)，能預(yù)測引起MMR蛋白表達(dá)缺失的基因突變(如無義突變、移碼突變、大的基因組片段重排等)，其敏感度較高[6]。然而，并不是所有的MMR蛋白表達(dá)缺失均由MMR基因突變引起，hMLH1基因啟動子的過度甲基化也可引起MMR蛋白表達(dá)缺失[7]，且并不是所有的基因突變均引起MMR蛋白表達(dá)缺失，因此對免疫組化法檢測結(jié)果的解釋應(yīng)謹(jǐn)慎。MMR蛋白的表達(dá)只能用來篩選Lynch綜合征，并不是一項診斷性檢驗。子宮內(nèi)膜癌出現(xiàn)MMR蛋白表達(dá)缺失多見于兩種情況：(1)散發(fā)性子宮內(nèi)膜癌發(fā)生甲基化表觀遺傳學(xué)改變，即hMLH1基因啟動子超甲基化導(dǎo)致基因沉默發(fā)生hMLH1蛋白表達(dá)缺失，甚至hPMS2蛋白表達(dá)缺失；(2)Lynch綜合征患者出現(xiàn)MMR基因的胚系突變，致hMSH2、hMSH6、hMLH1、hPMS2中的1個或多個蛋白表達(dá)缺失。本組應(yīng)用國外普遍公認(rèn)的篩查方法——免疫組化法[8]，檢測126例子宮內(nèi)膜癌，有28例出現(xiàn)hMSH2、hMSH6、hMLH1、hPMS2蛋白表達(dá)缺失，缺失率為22%(28/126)，遠(yuǎn)高于實際Lynch綜合征相關(guān)的子宮內(nèi)膜癌所占子宮內(nèi)膜癌的比率(<5%)，但明顯排除不是Lynch綜合征相關(guān)子宮內(nèi)膜癌的患者。28例中有MMR蛋白表達(dá)缺失的病例中，hMLH1蛋白表達(dá)缺失的有15例，通過甲基化特異性PCR檢測，發(fā)現(xiàn)9例有hMLH1基因甲基化，提示其為散發(fā)性子宮內(nèi)膜癌，余下的19例可能存在MMR基因的胚系突變。獲取19例患者的詳細(xì)病史，再應(yīng)用中國人HNPCC家系篩檢標(biāo)準(zhǔn)評判，明確5例為Lynch綜合征相關(guān)的子宮內(nèi)膜癌，剩下14例通過MMR基因胚系突變分析，明確是否可診斷Lynch綜合征相關(guān)的子宮內(nèi)膜癌，最大程度地明確高危Lynch綜合征相關(guān)子宮內(nèi)膜癌患者人群，縮小了費(fèi)用高昂、費(fèi)時費(fèi)力的MMR基因胚系突變分析的檢測范圍。

本實驗與既往報道Lynch綜合征相關(guān)子宮內(nèi)膜癌特征性的臨床病理結(jié)果一致[9-10]，如發(fā)病年齡多低于60歲，高發(fā)于子宮上段，腫瘤間質(zhì)見較多淋巴細(xì)胞反應(yīng)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。腫瘤在組織學(xué)上具有多形性，即Ⅰ型(子宮內(nèi)膜樣癌)和Ⅱ型(包括透明細(xì)胞癌、漿液性癌、未分化癌/癌肉瘤)子宮內(nèi)膜癌。本實驗收集126例子宮內(nèi)膜癌均包含上述亞型，并分為4組，實驗發(fā)現(xiàn)每種類型子宮內(nèi)膜癌均出現(xiàn)MMR蛋白的表達(dá)缺失；腫瘤在組織學(xué)上具有異質(zhì)性，收集的病例中由子宮內(nèi)膜樣腺癌與漿液性腺癌組成的混合性癌1例和漿液性腺癌與透明細(xì)胞癌組成的混合性癌1例，但未出現(xiàn)MMR蛋白表達(dá)缺失。本實驗發(fā)現(xiàn)MMR蛋白表達(dá)缺失在多形性和異質(zhì)性的子宮內(nèi)膜癌病例中表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，即四種子宮內(nèi)膜癌的表達(dá)缺失率差異無統(tǒng)計學(xué)意義；也可能由于各類腫瘤病例數(shù)均較少，以期收集更多病例進(jìn)一步分析。

Lynch綜合征家族是MMR基因突變的攜帶者，其女性發(fā)生子宮內(nèi)膜癌的概率為60%，其子女發(fā)生突變的概率為50%，且發(fā)病年齡早，平均46.4歲[11-13]；Lynch綜合征相關(guān)子宮內(nèi)膜癌患者初次發(fā)病后，10年內(nèi)再次患癌率為25%，15年內(nèi)再次患癌率50%[14]。因此，篩查Lynch綜合征家族具有重要意義。國外多數(shù)腫瘤中心已開始應(yīng)用免疫組化檢測所有子宮內(nèi)膜癌的MMR蛋白表達(dá)情況[15]，對Lynch綜合征家族進(jìn)行篩查，最終通過基因測序檢測MMR基因胚系突變情況，確診Lynch綜合征家族。有學(xué)者[16]建議對確診為遺傳性MMR突變攜帶者進(jìn)行終生隨訪，一旦發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸腺瘤及時行摘除術(shù)，從而預(yù)防結(jié)直腸癌的發(fā)生。男性攜帶者應(yīng)從25歲開始，每兩年行腸鏡檢查1次，35歲后改為每年1次，直至70歲。女性攜帶者應(yīng)從30歲開始，每年行1次HE4及CA125檢測、婦科檢查及陰道超聲檢查，必要時行陰道鏡檢查和子宮內(nèi)膜活檢。

Lynch綜合征相關(guān)子宮內(nèi)膜癌有發(fā)病率高、發(fā)病時間早等臨床特點。發(fā)病初期應(yīng)重視Lynch綜合征相關(guān)的子宮內(nèi)膜癌女性婦科癌癥的篩查和臨床預(yù)防工作，采取預(yù)防婦科手術(shù)能有效防止Lynch綜合征相關(guān)婦科腫瘤的發(fā)生。臨床醫(yī)師和患者應(yīng)根據(jù)手術(shù)的益處、風(fēng)險、不良反應(yīng)以及腫瘤篩查的有效性等方面綜合分析做出決策。我國人口基數(shù)大、患病人數(shù)多，但Lynch綜合征相關(guān)子宮內(nèi)膜癌家庭的報道較少，遺傳測試仍在試驗階段，戶籍和跟蹤系統(tǒng)不完善。因此，我們迫切需要建立Lynch綜合征相關(guān)子宮內(nèi)膜癌注冊隨訪制度，有利于了解其在我國的發(fā)生率，分析其表型和MMR基因的突變特點，探討適合我國國情的分子遺傳學(xué)診斷方法和預(yù)防性治療，從而進(jìn)一步提高我國Lynch綜合征相關(guān)子宮內(nèi)膜癌的篩選方法和診治水平。

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Screening for lynch syndrome in endometrial carcinoma

YANG Tong-yin, YI Wei, CHU Ming-liang, ZHANG Zhu-xue, LIN Yong-shun

(DepartmentofPathology,GuizhouProvincialPeople’sHospital,Guiyang550002,China)

Purpose To evaluate the application of mismatch repair (MMR) genes proteins expression and methylation-specific to screen for Lynch syndrome patients. Methods 126 endometrial carcinoma patients were tested the protein expression of hMSH2, hMSH6h, hMLH1, hPMS2 by immunohistochemically of SP, and the methylation status of hMLH1 genes by the methylation-specific PCR. Results The result of MMR immunocytochemistry showed that 22% (28/126) cases lacked MMR protein expression, including hMLH1-/hPMS2-in 12 cases, 4 hMSH2-/hMSH6-, 6 hPMS2-, 3 hMLH6-and 3 hMLH1-. Meanwhile, the methylation-specific PCR test showed that 9 cases was methylation status of hMLH1 genes in 15 cases hMLH1-, and suggested the patients might be sporadic endometrial carcinoma. Conclusion Immunohistochemical of SP staining for MMR proteins in endometrial carcinoma patients, accompanied by testing for the methylation status of hMLH1 genes, may be an effective approach to screen for Lynch syndrome.

endometrial neoplasm； Lynch syndrome； mismatch repair genes； immunohistochemically

時間：2017-3-16 14:23

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170316.1423.009.html

貴州省人民醫(yī)院青年基金[GZSYQN(2016)18號]

貴州省人民醫(yī)院病理科，貴陽 550002

楊通印，男，碩士，主治醫(yī)師。E-mail: yw9873@sina.com 易 韋，女，主任醫(yī)師，通訊作者。E-mail: yiwei6252@sina.com

R 735.33

A

1001-7399(2017)03-0273-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.03.009

接受日期：2017-01-01