張雨婷,張文輝,熊秀娟,況曉東,宋恩霖
NET-1活化NF-κB信號(hào)途徑促進(jìn)子宮頸鱗癌微血管生成
張雨婷1,張文輝2,熊秀娟1,況曉東1,宋恩霖1
目的 探討NET-1表達(dá)與子宮頸癌微血管生成的關(guān)系及其分子機(jī)制。方法 采用免疫組化MaxVision法檢測(cè)80例子宮頸鱗癌、10例慢性子宮頸炎組織中NET-1、NF-κB p65、VEGF蛋白表達(dá)。采用CD34內(nèi)皮標(biāo)記,結(jié)合Weinner計(jì)數(shù)法檢測(cè)子宮頸鱗癌組織的微血管密度(microvascular density, MVD)。通過陽離子脂質(zhì)體將真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV6-NET-1轉(zhuǎn)染子宮頸鱗癌細(xì)胞以獲得NET-1基因過表達(dá);利用NF-κB特異抑制劑PDTC處理子宮頸鱗癌細(xì)胞以抑制NF-κB的激活;應(yīng)用Western blot法檢測(cè)細(xì)胞蛋白的表達(dá)。結(jié)果 子宮頸鱗癌組織中NET-1呈高表達(dá),NET-1表達(dá)與子宮頸鱗癌MVD、NF-κB p65和VEGF蛋白表達(dá)呈正相關(guān)。NET-1基因轉(zhuǎn)染引起子宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞胞核NF-κB p65和胞質(zhì)VEGF水平上高,應(yīng)用NF-κB抑制劑PDTC預(yù)處理SiHa細(xì)胞能顯著抑制NET-1引起的VEGF表達(dá)上調(diào)。結(jié)論 NET-1促進(jìn)子宮頸鱗癌微血管生成,其機(jī)制與NET-1激活子宮頸鱗癌NF-κB信號(hào)途徑上調(diào)VEGF表達(dá)有關(guān)。
子宮頸腫瘤;鱗癌;NET-1;NF-κB;VEGF;微血管生成
實(shí)體腫瘤血管形成與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲以及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。實(shí)驗(yàn)證實(shí),微血管增生在子宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中起重要作用,與子宮頸癌不良預(yù)后顯著相關(guān)[1]。故研究腫瘤血管生成相關(guān)調(diào)節(jié)因子及其作用機(jī)制,對(duì)腫瘤生物的治療具有重要意義。NET-1是小G蛋白R(shí)hoA特異的鳥苷酸交換因子,通過激活RhoA信號(hào)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、細(xì)胞周期和細(xì)胞骨架重排,具有類似原癌基因的功能。目前已發(fā)現(xiàn),NET-1的表達(dá)與子宮頸癌、肺癌、肝癌和膠質(zhì)細(xì)胞瘤等多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展有關(guān),但NET-1與子宮頸癌微血管生成的關(guān)系尚未見報(bào)道。Vessichelli等[2]報(bào)道,NET-1與CARMA蛋白相互作用激活NF-κB信號(hào)途徑。NF-κB信號(hào)途徑參與缺氧情況下HIF-1的轉(zhuǎn)錄活化,最終上調(diào)與血管生成相關(guān)的下游靶基因如VEGF等的表達(dá),從而促進(jìn)腫瘤的微血管生成。本文通過檢測(cè)子宮頸鱗癌組織中NET-1、NF-κB p65、VEGF蛋白的表達(dá),結(jié)合CD34內(nèi)皮標(biāo)記檢測(cè)腫瘤微血管密度(microvascular density, MVD),并在細(xì)胞學(xué)水平觀察NET-1對(duì)子宮頸癌細(xì)胞NF-κB的激活作用及其對(duì)下游VEGF表達(dá)的影響,分析NET-1與子宮頸癌微血管生成的關(guān)系及其分子機(jī)制。
1.1 臨床資料 收集中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院確診的浸潤(rùn)性子宮頸鱗癌石蠟包埋標(biāo)本80例,患者平均年齡44歲,其中低分化27例,中+高分化53例。按FIGO(2014)分期標(biāo)準(zhǔn):Ⅰ期48例,Ⅱ期32例。腫瘤直徑≥4 cm者22例,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者38例,脈管浸潤(rùn)陽性者28例。所有患者術(shù)前均未行放、化療,另取10例慢性子宮頸炎標(biāo)本作為對(duì)照組。
1.2 免疫組化 免疫組化采用MaxVision法染色,3~5 μm厚石蠟切片常規(guī)脫蠟,檸檬酸抗原熱修復(fù),3%H2O2處理,PBS漂洗。一抗兔抗人多克隆NET-1抗體,購(gòu)自ProteinTech公司;兔抗人NF-κB p65 抗體,購(gòu)自Abnova公司;兔抗人VEGF抗體,購(gòu)自Abgent公司;工作液50 μL,4 ℃過夜,PBS洗滌后50 μL MaxVision二抗工作液(KIT-5010,福州邁新公司),室溫下孵育30 min,洗滌后DAB顯色,蘇木精復(fù)染,中性樹膠封固。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。
測(cè)量平均光密度(mean optic density, MOD)進(jìn)行蛋白表達(dá)半定量結(jié)果判定。在光鏡下(×400)選取腫瘤組織中陽性最強(qiáng)的5個(gè)高倍視野,數(shù)碼拍照,圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0準(zhǔn)確分割陽性區(qū)域,測(cè)量MOD值。相同條件下,每張圖片測(cè)量3次,以3次測(cè)量的均值作為該視野中蛋白的表達(dá)強(qiáng)度。最后再以同一切片5個(gè)不同視野的MOD均數(shù),作為該切片所代表的樣本組織中蛋白的平均表達(dá)強(qiáng)度。
1.3 MVD檢測(cè) 采用Weidner法檢測(cè)子宮頸癌組織中MVD。CD34免疫組化染色后(鼠抗人CD34單克隆抗體,福州邁新公司)以黃色顆粒狀標(biāo)記的血管內(nèi)皮為標(biāo)準(zhǔn),切片在光鏡下(×100)挑選MVD分布最高區(qū)域,在光鏡下(×200)計(jì)數(shù)5個(gè)不同視野中被CD34染成陽性的微血管數(shù)量,取其平均值作為MVD值。每個(gè)與鄰近微血管分離明顯的陽性染色單個(gè)血管內(nèi)皮細(xì)胞或血管內(nèi)皮細(xì)胞簇均視為1個(gè)獨(dú)立的微血管,結(jié)構(gòu)不相連的分支血管結(jié)構(gòu)也計(jì)作1個(gè)微血管。直徑>8個(gè)紅細(xì)胞的血管,帶有厚的平滑肌血管或者硬化壞死區(qū)血管不在計(jì)數(shù)范圍內(nèi)。
1.4 子宮頸癌細(xì)胞NET-1基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 SiHa細(xì)胞(TCHu113,中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫)用含10%胎牛血清、10%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。2×105/mL接種于24孔板,待生長(zhǎng)達(dá)90%~95%融合度時(shí),更換培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基。分別用無血清培養(yǎng)基50 μL稀釋0.8 μg的pCMV6-NET-1表達(dá)質(zhì)粒(SC321265,OriGene公司)和2 μL脂質(zhì)體Lipofectamin 2000(Invitrogen公司),室溫靜止5 min,兩者混合制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物,室溫靜止25 min,加入對(duì)應(yīng)孔板中。利用空質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染作為陰性對(duì)照,利用未轉(zhuǎn)染組為空白對(duì)照。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)6 h,更換培養(yǎng)基為不含雙抗含10%血清的DMEM高糖培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)至48 h,通過Western blot法檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果。
1.5 Western blot法 利用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白,用以檢測(cè)NET-1和VEGF蛋白表達(dá);利用細(xì)胞核蛋白提取試劑盒(Cwbiotech公司)提取細(xì)胞核蛋白,用于檢測(cè)細(xì)胞核NF-κB p65蛋白表達(dá)。蛋白濃度測(cè)定后,按每孔20 μL上樣量用Loading Buffer配平,沸水加熱后上樣,行十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳,轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜。經(jīng)洗滌后,加入一抗(工作濃度1 ∶1 000,內(nèi)參β-actin為1 ∶5 000,β-actin鼠單克隆抗體,購(gòu)自ProteinTech公司),37 ℃孵育1 h后4 ℃過夜;PBST洗滌后加入二抗(工作濃度1 ∶5 000)。洗滌膜后,利用Easy See化學(xué)發(fā)光試劑盒孵育發(fā)光,顯影。利用Image Tool測(cè)量目的蛋白條帶和內(nèi)存條帶的灰度值,以目的條帶灰度值與內(nèi)存灰度值的比值作為蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。
2.1 子宮頸鱗癌組織中NET-1表達(dá)及其與NF-κB p65和VEGF表達(dá)的關(guān)系 腫瘤組織HE染色顯示,瘤細(xì)胞呈巢、團(tuán)狀分布,與纖維性間質(zhì)分界清楚,部分瘤組織中可見角化現(xiàn)象,為浸潤(rùn)性子宮頸鱗癌。子宮頸炎組織中,NET-1弱表達(dá)于鱗狀上皮顆粒細(xì)胞層和棘細(xì)胞層細(xì)胞胞核,且呈散在分布。NET-1表達(dá)于癌巢中腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)和胞核,呈棕褐色顆粒,癌巢周圍纖維性間質(zhì)偶見少量表達(dá)(圖1)。NF-κB p65主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞胞核,呈棕黃色顆粒,部分瘤細(xì)胞呈胞質(zhì)和胞核陽性(圖2)。VEGF表達(dá)于腫瘤細(xì)胞胞質(zhì),呈棕黃色顆粒,癌巢周血管組織和少量纖維間質(zhì)可見表達(dá)(圖3)。光密度檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn),子宮頸鱗癌組織中NET-1的平均表達(dá)強(qiáng)度顯著高于慢性子宮頸炎組織(表1)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示,NET-1表達(dá)分別與NF-κB和VEGF表達(dá)呈正相關(guān)(rs=0.272,P=0.015;rs=0.325,P=0.003)。
表1 慢性子宮頸炎和子宮頸鱗癌組織中NET-1的表達(dá)(±s)
2.2 子宮頸鱗癌組織中NET-1的表達(dá)與MVD的關(guān)系 CD34內(nèi)皮標(biāo)記顯示,子宮頸鱗癌微血管分布于癌巢之間和癌巢內(nèi)瘤細(xì)胞之間(圖4),平均MVD為21.1。t檢驗(yàn)結(jié)果顯示,NET-1表達(dá)水平較高組(以NET-1的總體平均表達(dá)強(qiáng)度0.182±0.036為分組臨界值)的子宮頸鱗癌組織中MVD顯著高于NET-1表達(dá)水平較低組(t=-2.113,P=0.038)。進(jìn)一步相關(guān)性分析顯示,NET-1的表達(dá)與子宮頸鱗癌MVD呈正相關(guān)(rs=0.291,P=0.009)。
2.3 NET-1通過活化NF-κB信號(hào)途徑上調(diào)VEGF表達(dá) NET-1基因轉(zhuǎn)染組、陰性轉(zhuǎn)染組和空白未轉(zhuǎn)染組SiHa細(xì)胞NET-1蛋白表達(dá)強(qiáng)度分別為0.986±0.021、0.523±0.015和0.508±0.018(圖5)。轉(zhuǎn)染組細(xì)胞NET-1的表達(dá)顯著高于陰性轉(zhuǎn)染組(t=1.08,P<0.001)和空白未轉(zhuǎn)染組(t=29.45,P<0.001),而陰性轉(zhuǎn)染組和空白未轉(zhuǎn)染組之間差異無顯著性,提示NET-1基因轉(zhuǎn)染顯著提高SiHa細(xì)胞NET-1蛋白的表達(dá)水平。與此同時(shí),在陽性轉(zhuǎn)染組胞核NF-κB p65和細(xì)胞VEGF的表達(dá)水平(1.27±0.085、0.87±0.032)均分別顯著高于陰性轉(zhuǎn)染組(0.55±0.010,t=14.50,P<0.001;0.37±0.011,t=25.89,P<0.001)和空白未轉(zhuǎn)染組(0.52±0.035,t=13.99,P<0.001;0.035±0.029,t=21.1,P<0.001)。利用NF-κB激活的特異抑制劑PDTC(本實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)存)預(yù)處理SiHa細(xì)胞,再對(duì)該組細(xì)胞和另一組未處理的正常SiHa細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行NET-1基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)染,應(yīng)用Western blot法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在預(yù)處理組細(xì)胞NF-κB信號(hào)激活受抑制的情況下,該組VEGF的表達(dá)水平(0.39±0.036)顯著低于未處理組(0.86 ± 0.032,t=16.9,P<0.001,圖6)。
①②③④
圖1 子宮頸鱗癌組織中NET-1的表達(dá),呈胞質(zhì)和胞核陽性,MaxVision法 圖2 子宮頸鱗癌組織中NF-κB p65的表達(dá),呈胞核陽性,部分呈胞核和胞質(zhì)陽性,MaxVision 法 圖3 子宮頸鱗癌組織中VEGF的表達(dá),呈胞質(zhì)陽性,MaxVision 法 圖4 子宮頸鱗癌組織中CD34內(nèi)皮標(biāo)記的微血管,MaxVision法
圖5 NET-1基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)染組、陰性轉(zhuǎn)染組和空白未轉(zhuǎn)染組SiHa細(xì)胞中NET-1、胞核NF-κB p65和細(xì)胞VEGF的表達(dá)
3
圖6 PDTC對(duì)NET-1基因轉(zhuǎn)染后SiHa細(xì)胞中胞核NF-κB p65和細(xì)胞VEGF表達(dá)水平的影響
NET-1最初通過基因克隆技術(shù)在神經(jīng)上皮瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn),后經(jīng)研究證實(shí)其為小G蛋白家族RhoA特異的鳥苷酸交換因子,能激活RhoA信號(hào)途徑,因而認(rèn)為NET-1能參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、凋亡、分化和骨架重排等一系列重要生物學(xué)過程。相繼有較多文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),NET-1與多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展有關(guān),如NET-1的表達(dá)能促進(jìn)胃癌[3]、皮膚癌[4]、乳腺癌[5]、食管癌[6]和肝癌[7]的增殖和浸潤(rùn)能力,且NET-1的高表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌[8]預(yù)后不良有關(guān)。NET-1促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的分子機(jī)制主要與其激活RhoA有關(guān),如NET-1通過激活RhoA調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞骨架重排從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移浸潤(rùn)能力[3],而NET-1活化的RhoA對(duì)于TGFβ介導(dǎo)的乳癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化是必須的[9]。NET-1分子結(jié)構(gòu)上隸屬于含4個(gè)跨膜區(qū)域蛋白超家族(transmembrane 4 superfamily, TM4SF),其功能是作為分子的服務(wù)性蛋白,通過結(jié)合特異的細(xì)胞表面蛋白,增強(qiáng)功能性信號(hào)復(fù)合物的形成和穩(wěn)定,從而參與細(xì)胞的活化與增殖、黏附與遷移等。Carr等[10]研究證實(shí),NET-1與FAK相互作用并激活FAK參與調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)遷移能力。最近文獻(xiàn)報(bào)道[2],NET-1能與CARMA家族蛋白結(jié)合,從而介導(dǎo)NF-κB信號(hào)通路的激活。Panahi等[11]實(shí)驗(yàn)表明,NF-κB信號(hào)途徑的激活是實(shí)體腫瘤微血管生成重要機(jī)制之一,故NET-1可能通過激活NF-κB信號(hào)途徑促進(jìn)腫瘤微血管生成。然而,目前關(guān)于NET-1與腫瘤血管生成的關(guān)系報(bào)道較少。評(píng)價(jià)腫瘤血管形成程度的最客觀標(biāo)準(zhǔn)是MVD,而CD34是目前較敏感的血管標(biāo)志物,對(duì)腫瘤組織內(nèi)微小血管及新生的不完整血管較為敏感[12]。本課題通過CD34標(biāo)記微血管內(nèi)皮檢測(cè)子宮頸癌MVD,免疫組化檢測(cè)子宮頸癌組織中NET-1、NF-κB p65和VEGF的表達(dá),并進(jìn)一步結(jié)合細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn),分析NET-1與子宮頸癌細(xì)胞血管誘生能力的關(guān)系。
本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與慢性子宮頸炎組織相比,NET-1在子宮頸鱗癌組織中高表達(dá),提示NET-1可能參與子宮頸鱗癌的發(fā)生、發(fā)展。相關(guān)性分析結(jié)果顯示,NET-1的表達(dá)與子宮頸癌MVD、NF-κB p65和VEGF分別呈正相關(guān),提示NET-1促進(jìn)子宮頸癌微血管增生可能與激活NF-κB信號(hào)途徑進(jìn)而上調(diào)子宮頸癌VEGF表達(dá)有關(guān)。NF-κB受上游信號(hào)因子激活后,p65亞單位易位至細(xì)胞核,通過其DNA結(jié)合位點(diǎn)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。本實(shí)驗(yàn)利用NET-1表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染子宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞,并檢測(cè)胞核p65和胞質(zhì)VEGF的表達(dá),分析NET-1的表達(dá)對(duì)NF-κB信號(hào)的活化及其對(duì)VEGF表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,陽性轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中NET-1表達(dá)水平顯著高于陰性轉(zhuǎn)染組和空白未轉(zhuǎn)染組,說明基因轉(zhuǎn)染成功;且細(xì)胞中NF-κB p65和VEGF的表達(dá)水平也分別顯著提高,提示NET-1激活子宮頸癌細(xì)胞NF-κB信號(hào)且上調(diào)VEGF的表達(dá)。為進(jìn)一步闡明NF-κB的激活與VEGF上調(diào)的關(guān)系,本實(shí)驗(yàn)利用NF-κB特異的激活抑制劑PDTC預(yù)處理SiHa細(xì)胞,觀察在NF-κB信號(hào)受抑的情況NET-1對(duì)VEGF表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在NET-1轉(zhuǎn)染的SiHa細(xì)胞中,PDTC顯著抑制NF-κB p65的細(xì)胞核水平,同時(shí)VEGF的表達(dá)水平也顯著下降,提示NET-1能通過活化NF-κB信號(hào)上調(diào)子宮頸癌VEGF的表達(dá)。H?lters等[13]證實(shí)NET-1能促進(jìn)子宮頸癌SiHa細(xì)胞體外浸潤(rùn)能力,且排除NET-1對(duì)子宮頸癌FAK和PI3K信號(hào)的激活作用,但并未分析NET-1對(duì)NF-κB的激活作用。NET-1促進(jìn)子宮頸癌細(xì)胞浸潤(rùn)能力是否也與NF-κB的活化有關(guān),尚待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)分析。
綜上所述,本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果認(rèn)為NET-1表達(dá)能促進(jìn)子宮頸癌微血管生成,且其分子機(jī)制與NET-1活化NF-κB信號(hào)途徑,進(jìn)而上調(diào)VEGF表達(dá)以增強(qiáng)子宮頸癌血管誘生能力有關(guān)。
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NET-1 promote the angiogenesis of cervical squamous cell carcinoma by activating NF-kappa B signaling pathway
ZHANG Yu-ting1, ZHANG Wen-hui2, XIONG Xiu-juan1, KUANG Xiao-dong1, SONG En-lin1
(1DepartmentofPathology,MedicalCollegeofNanchangUniversity,Nanchang330006,China;2DepartmentofPathology,theFirstAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China)
Purpose To explore the association of NET-1 expression with the angiogenesis of cervical squamous cell carcinoma and the related molecular mechanism. Methods Immunohistochemistry MaxVision was used to detect the expression of NET-1, NF-κB p65 and VEGF in 80 cases of cervical squamous cancer tissue and 10 cases of chronic cervicitis tissue. The microvascular density (MVD) was assessed by labeling endothelia with CD34- antibody and counted according to Weinner’s standard. The eukaryotic expression plasmid pCMV6-NET-1 was transfected into cervical squamous cancer cells by cationic liposome in order to obtain over expression of NET-1 gene.In order to inhibit the activation of NF-kappa B, cervical squamous carcinoma cells were treated with NF-kappa B specific inhibitor PDTC. The protein expression in SiHa cells was assessed by Western blotting. Results The expression level of NET-1 in the cervical squamous carcinoma tissue was significantly higher than that in the tissue of control group. NET-1 expression was positively correlated to the MVD, NF-κB p65 and VEGF expression, respectively. Transient transfection of NET-1 gene significantly increased the nuclear expression of NF-κB p65 and cytoplasm expression of VEGF in the SiHa cells. However, pretreatment of SiHa cells with NF- inhibitor PDTC significantly inhibited NET-1 induced upregulation of VEGF expression. Conclusion NET-1 promotes the angiogenesis of cervical squamous carcinoma through the activation of the NF-κB signaling which upregulate the expression of VEGF in the cancer cells.
cervical neoplasm; squamous carcinoma; NET-1; NF-κB; VEGF; angiogenesis
時(shí)間:2017-3-16 14:23
http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170316.1423.008.html
江西省教育廳科技項(xiàng)目(GJJ14087)、江西省科技廳科技支撐計(jì)劃(2014BBG70066)
1南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室,南昌 3300062中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科,廣州 510080
張雨婷,女,碩士研究生。E-mail: 1977363165@qq.com 宋恩霖,男,博士,副教授,通訊作者。E-mail: songenling@126.com
R 737.33
A
1001-7399(2017)03-0268-05
10.13315/j.cnki.cjcep.2017.03.008
接受日期:2017-01-07