摻鎂-羥基磷灰石對(duì)牙周韌帶細(xì)胞的影響①

劉鑫喆,王健平,王佳琪,楊薇,黃歆博

(佳木斯大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154002)

摻鎂-羥基磷灰石對(duì)牙周韌帶細(xì)胞的影響①

劉鑫喆,王健平,王佳琪,楊薇,黃歆博

(佳木斯大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154002)

目的：研究新型材料摻鎂-磷灰石對(duì)牙周韌帶細(xì)胞的增殖性毒性的影響，以及人牙周韌帶細(xì)胞對(duì)摻鎂-羥基磷灰石的黏附性的研究。方法:用體外方法培養(yǎng)人牙周韌帶細(xì)胞，將不同濃度的摻鎂羥基磷灰石(5%Mg—HA，10%Mg—HA)分別與牙周韌帶細(xì)胞共同培養(yǎng)。對(duì)照組為自固化磷酸鈣(CPC)，羥基磷灰石(HA)，玻璃離子(GIG)浸提液組。采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞毒性以及增殖率。細(xì)胞核進(jìn)行DAPI染色，觀察細(xì)胞對(duì)摻鎂羥基磷灰石的黏附情況。結(jié)果:MTT檢測(cè)結(jié)果表示為細(xì)胞增殖率自固化磷酸鈣>5%摻鎂羥基磷灰石>10%羥基磷灰石>羥基磷灰石>玻璃離子，各組比較具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(P<0.05)每組材料20g/L、40g/L、80g/L濃度之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。人牙周韌帶細(xì)胞對(duì)材料有一定的黏附性。結(jié)論：摻鎂羥基磷灰石對(duì)牙周韌帶細(xì)胞有良好的生物相容性，毒性小，有一定的促進(jìn)牙周韌帶細(xì)胞黏附作用。為髓室底穿，根管側(cè)穿的修復(fù)工作提供了新的選擇。

摻鎂-羥基磷灰石；牙周韌帶細(xì)胞； 髓室底穿材料；生物相容性；細(xì)胞毒性

在臨床根管治療過(guò)程中，由于髓腔解剖的變異或操作者對(duì)髓腔的解剖知識(shí)了解不足，經(jīng)常會(huì)遇到髓室底穿根管側(cè)穿的問(wèn)題[1]。因?yàn)樗枨晃恢秒[蔽、視野差、對(duì)醫(yī)生技術(shù)、修補(bǔ)材料要求較高，并且髓腔穿孔位置涉及到牙周組織和牙體組織，修補(bǔ)材料需要嚴(yán)密的封閉能力，以及良好的生物相容性，才能恢復(fù)牙周、牙體組織的健康。良好的修補(bǔ)材料，將很大程度的決定牙髓治療的成敗。羥基磷灰石[Ca10(PO4)6(OH)2,HA]與牙體硬組織的無(wú)機(jī)成分極其相似，具有良好的生物相容性[2]。 為了更好的滿足臨床的需要,常常在人工合成的HA中添加一些元素來(lái)改善其臨床性能,含鎂羥基磷灰石(Mg-HA)就是其中的一種改新型的性材料[3]。據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)記載，鎂在骨形成的初期具有重要作用，鎂可以提高成骨細(xì)胞的活性，鎂的缺乏可影響骨的代謝導(dǎo)致骨質(zhì)疏松[4]。因此本實(shí)驗(yàn)研究摻鎂-羥基磷灰石對(duì)牙周韌帶細(xì)胞的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

DMEM培養(yǎng)基(HyClone生物化學(xué)制品有限公司);PBS(HyClone生物化學(xué)制品有限公司)膠原酶(TypeI,美國(guó)Gibco公司);胰蛋白酶(美國(guó)Gibco公司);胎牛血清(四季青生物工程公司);青鏈霉素溶液(雙抗)(HyClone生物化學(xué)制品有限公司)。

摻鎂羥基磷灰石(佳木斯大學(xué)材料學(xué)院)鎂的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5%，10%，本文5%Mg—HA為5Mg-HA,10%Mg—HA為10Mg-HA，不再贅述。共分5組，其中5Mg-HA、10Mg-HA為實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組為玻璃離子，羥基磷灰石，自固化磷酸鈣。采用DMEM培養(yǎng)液配制各組材料浸提液，每組材料分別配置為80，40, 20g/L浸提液。

1.2 細(xì)胞的原代培養(yǎng)

經(jīng)患者同意，取14～26歲的正畸拔除的雙尖牙(佳木斯大學(xué)附屬二院口腔頜面外科)牙齒拔出后，立即置于預(yù)冷4℃的含青霉素、鏈霉素的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液中。在超凈臺(tái)無(wú)菌條件下,用不含血清DMEM與PBS交替沖洗牙根部數(shù)遍,用手術(shù)刀輕柔地、向一個(gè)方向刮取牙根中1/3部位的牙周膜組織，將牙周膜組織分離成 1mm2左右的小組織塊。以1cm的間距分散擺放在細(xì)胞培養(yǎng)瓶底。緩慢輕柔將細(xì)胞培養(yǎng)瓶倒置，小心緩慢加入5mL含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于飽和濕度，37℃的CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)，4h后緩慢反轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使液體浸沒(méi)組塊，繼續(xù)培養(yǎng)。3～4d后，發(fā)現(xiàn)有細(xì)胞從組織邊緣爬出時(shí)，首次細(xì)胞換液。后每3～4天換液。待細(xì)胞有70%以上出現(xiàn)融合時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取 4～6代的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 方法

①M(fèi)TT檢測(cè)細(xì)胞毒性：將牙周韌帶細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加入100μL的細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度為1×104個(gè)/mL，每組每濃度重復(fù)種植6個(gè)孔。在96孔板的四周加PBS液10μL，以保持96孔板的濕度。人牙周韌帶細(xì)胞在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)48h后,吸出原培養(yǎng)液,按上述分組加藥,每組分別設(shè)置6個(gè)復(fù)孔,37℃下繼續(xù)培養(yǎng)分別于1d、3d、5d、7d。其中3d組、5d組、7d組需每隔一天用對(duì)應(yīng)浸提液換液1次，取出待測(cè)的96孔板，取浸提液與細(xì)胞作用的培養(yǎng)板，每孔加入MTT溶液(5g/L)20μL，37℃，體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2飽和濕度環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)4h，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入DMSO150μL，震蕩10min，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀570nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔光吸收值，用單純培養(yǎng)液調(diào)零，取平均值。計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖率。

②牙周韌帶細(xì)胞黏附性試驗(yàn)：在細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)至第5、7天，取出細(xì)胞與材料，將各組材料制成直徑為10mm,高3mm的扁圓片狀試件。羥基磷灰石組為對(duì)照組。接種的細(xì)胞甲醛固定，每孔加入新鮮配制DAPI染液進(jìn)行染色，并固定于載玻片，共聚焦激光熒光倒置顯微鏡下，用數(shù)碼攝像系統(tǒng)觀察并拍照觀察細(xì)胞核數(shù)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS20.0數(shù)據(jù)分析軟件，進(jìn)行方差分析和LSD的兩兩比較，以P<0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度、不同時(shí)間下、牙周韌帶細(xì)胞增殖數(shù)目，不同濃度比較，不同濃度之間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見(jiàn)圖1，不同時(shí)間點(diǎn)比較，1d和5d，3d和7d有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異， 1d、3d比較(P<0.05)，1d和5d比較(P<0.01)，1d和7d比較(P<0.01)………組別之間倆倆比較均有意義。五組材料細(xì)胞增值率

為自固化磷酸鈣>5%摻鎂羥基磷灰石>10%摻鎂羥基磷灰石>純羥基磷灰石>玻璃離子。

圖1 牙周韌帶細(xì)胞增殖時(shí)間趨勢(shì)圖

2.2 細(xì)胞黏附性DAPI染色結(jié)果所示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，各組材料上的細(xì)胞數(shù)量有所變化。可以明顯看出，培養(yǎng)5，7d后，牙周韌帶細(xì)胞均正常黏附于各組材料，其中10Mg-HA培養(yǎng)7d后細(xì)胞數(shù)量染色較5d后有明顯的增多。5Mg-HA試件上的細(xì)胞在5d達(dá)到峰值。

圖2 人牙周韌帶細(xì)胞種植到各組材料上5d.7d.的DAPI染色免疫熒光(免疫熒光染色×100)

3 討論

眾所周知，髓室底穿根管側(cè)穿是根管治療常見(jiàn)的并發(fā)癥，其修復(fù)難度高，成功率低是困擾口腔醫(yī)師的常見(jiàn)問(wèn)題。髓室底穿根管側(cè)穿對(duì)操作者的技術(shù)要求以及修補(bǔ)材料的性能的要求尤為嚴(yán)格,理想的修補(bǔ)材料須具有杰出的生物相容性,可激活成骨細(xì)胞成牙本質(zhì)細(xì)胞，促進(jìn)修復(fù)性牙本質(zhì)的形成，封閉髓腔與根周組織的交通，形成良好的封閉。髓室底穿根管側(cè)穿修補(bǔ)材料因直接與牙周組織接觸,其生物相容性對(duì)牙周組織的恢復(fù)重建更為尤為重要。在國(guó)際慣例中，一種新型的口腔修補(bǔ)材料在臨床應(yīng)用之前首先進(jìn)行生物相容性的評(píng)價(jià)。MTT法是細(xì)胞毒性檢測(cè)的一種重要手段，該方法可以準(zhǔn)確、迅速、靈敏地反映細(xì)胞增殖程度和細(xì)胞毒性程度， 此比色法是用于評(píng)價(jià)新型材料細(xì)胞毒性的最常用實(shí)驗(yàn)方法之一，廣泛適用于各種新型材料生物相容性的評(píng)價(jià)。MTT染色后吸光度值比較，表明摻鎂羥基磷灰石與對(duì)照組比較差異均有顯著性意義(P<0.05)，說(shuō)明摻鎂羥基磷灰石符合生物體應(yīng)用的基本要求，據(jù)大文獻(xiàn)所述,傳統(tǒng)的氧化鋅、氫氧化鈣、玻璃離子、對(duì)治療髓室底穿有一定效果,但長(zhǎng)期效果均不理想，可造成局部組織壞死，滲出。近期大量文獻(xiàn)報(bào)道MTA,具有良好的生物相容性、可關(guān)閉缺損部位及臨床可操作性，并且在濕潤(rùn)環(huán)境下可以固化，但價(jià)格昂貴。據(jù)實(shí)驗(yàn)表明MTA可以激活大量的成骨細(xì)胞，成骨細(xì)胞分泌類骨質(zhì)成為骨細(xì)胞并被包埋于新骨之中，MTA中含有鈣、磷等元素，它與水反應(yīng)后的產(chǎn)物含有氧化鈣和磷酸鈣的成分，氧化鈣與水反應(yīng)形成最終形成氫氧化鈣。摻鎂羥基磷灰石鎂的摻入使羥基磷灰石更接近人體自然骨組織中天然羥基磷灰石的組成。鎂作為骨組織中羥基磷灰石的陽(yáng)離子替代物在骨形成早期，因鎂、鈣離子之間的離子互換規(guī)律，鎂提高了成骨細(xì)胞的活性，而骨成熟后基本消失[5]。鎂的缺乏癥可導(dǎo)致骨質(zhì)疏松，主要是因?yàn)橥ㄟ^(guò)抑制成骨細(xì)胞的數(shù)量、遷徙、分化和增加破骨細(xì)胞的數(shù)量[6～9]。摻鎂羥基磷灰石對(duì)髓室底穿部促進(jìn)新骨形成，對(duì)牙周韌帶細(xì)胞生物相容性良好。由此可見(jiàn)摻鎂羥基磷灰石與MTA都可以誘導(dǎo)引導(dǎo)牙骨質(zhì)類牙骨質(zhì)，以及可利于牙周韌帶細(xì)胞的黏附，良好的生物相容性，這將是牙周組織重建不可取代的因素。因此,摻鎂羥基磷灰石作為乳、恒牙髓室底穿的屏障和修復(fù)材料是可行的,為最大限度地保存患牙,并恢復(fù)其生理功能提供了一種新型材料。

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佳木斯大學(xué)研究生科技創(chuàng)新項(xiàng)目，編號(hào):LM2016_075。

劉鑫喆(1990～) 女，黑龍江牡丹江人，在讀碩士研究生。

王健平(1959～) 男，黑龍江佳木斯人，碩士，教授，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail:826452916@qq.com。

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1008-0104(2017)02-0047-02

2017-01-03)