川芎嗪對AD大鼠氧化應(yīng)激影響的初步研究①

王圣也，倫 澤，石俊杰，劉福興,許夢婷，宋慶嬌，張 濤，柳朝陽

(佳木斯大學(xué)，黑龍江 佳木斯 154007 )

川芎嗪對AD大鼠氧化應(yīng)激影響的初步研究①

王圣也，倫 澤，石俊杰，劉福興,許夢婷，宋慶嬌，張 濤，柳朝陽

(佳木斯大學(xué)，黑龍江 佳木斯 154007 )

目的：探討川芎嗪對AD大鼠氧化應(yīng)激的影響。方法：用DCFH-DA(二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯)熒光包被探針法檢測細(xì)胞內(nèi)總ROS；鄰苯三酚自氧化法檢測大鼠血清及海馬組織SOD活性； 硫代巴比妥酸法檢測大鼠血清及海馬MDA含量。結(jié)果：與AD模型組相比，川芎嗪組大鼠海馬細(xì)胞內(nèi)總ROS含量降低(P<0.05)、血清SOD活性升高(P<0.05)和MDA含量降低(P<0.05)、海馬細(xì)胞內(nèi)SOD活性升高(P<0.05)和MDA含量降低(P<0.05)。結(jié)論：川芎嗪可提高AD模型大鼠的抗氧化能力，防止神經(jīng)元細(xì)胞損傷。

川芎嗪；AD大鼠；氧化應(yīng)激

阿爾茨海默病(AD)中，β-淀粉樣蛋白斑塊(Aβ)、神經(jīng)炎癥、神經(jīng)纖維纏結(jié)、氧化應(yīng)激反應(yīng)廣泛[1]是主要病理特征。氧化應(yīng)激是AD病理過程的最早應(yīng)激事件[2，3]?；钚匝?ROS)的含量反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的水平，本課題中，我們應(yīng)用川芎嗪干預(yù)，檢測AD模型大鼠海馬組織細(xì)胞內(nèi)總ROS、SOD和MDA含量，為川芎嗪防治AD提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動物和材料

成年雌性SD大鼠 30只，平均240g，由佳木斯大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。

川芎嗪和Aβ1-40購于Sigma公司；ROS、SOD、MD檢測試劑盒購于北京中杉金橋生物公司。

1.2 方法1.2.1 動物模型的建立[4]

1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉各組SD大鼠，注射部位是海馬CAI區(qū)：根據(jù)Cusmhnao與Pellegrin大鼠腦定位圖譜，制定注射點(diǎn)是中線左側(cè)2.1mm，前囪后3.4mm，硬腦膜下2.9mm，Aβ1-40溶液注射1μL，留針5min,假手術(shù)組生理鹽水等量注射。

1.2.2 試驗(yàn)分組與給藥

大鼠隨機(jī)分3組：川芎嗪組：川芎嗪(250mg/kg·d灌胃24d;假手術(shù)組與AD模型組：等量生理鹽水灌胃。

1.2.3 大鼠海馬組織總ROS測定

10微摩DCFH-DA加入單細(xì)胞海馬組織懸液。37℃作用20min，DMEM細(xì)胞洗滌。在488納米激發(fā)波長和發(fā)射波長525納米下，ROS的含量用流式儀檢測的熒光強(qiáng)度來表示。

1.2.4 大鼠血清及海馬組織SOD活性測定

大鼠心臟血清進(jìn)行分離，在血清中進(jìn)行SOD活性檢測。在分離的大腦海馬組織中加入4℃生理鹽水，研磨后獲取勻漿組織，取上清液按照試劑盒操作檢測SOD活性。

SOD血清值=(對照管OD值-測定管OD值)/對照管OD值/50%×稀釋倍數(shù)×樣本稀釋倍數(shù)

SOD組織勻漿值=(對照管OD值-測定管OD值)/對照管O值/50%×反應(yīng)體系的稀釋倍數(shù)/樣本蛋白濃度

1.2.5 大鼠血清及海馬組織MDA含量測定

取待測血清及 10%海馬組織勻漿，按試劑盒要求配試劑和操作。

血清MDA值=(測定管OD值-對照管OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)管OD值-空白管OD值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度×樣本稀釋倍數(shù)

組織勻漿MDA含量=(測定管OD值-對照管OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)管OD值-空白管OD值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(10nmol/mL)/待測樣本蛋白濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 川芎嗪對AD大鼠海馬細(xì)胞總ROS生成的影響

與假手術(shù)組比，AD大鼠海馬細(xì)胞ROS含量增加(P<0.05)。川芎嗪治療后，AD模型大鼠海馬細(xì)胞內(nèi)總ROS含量降低(P<0.05)，與假手術(shù)組比無顯著差異(P>0.05) ，見表1。

2.2 川芎嗪對AD大鼠血清SOD活性和MDA含量的影響

與假手術(shù)組比，AD大鼠血清SOD活性降低

(P<0.05)。川芎嗪治療后，與AD模型組相比，大鼠血清SOD活性升高(P<0.05)，與假手術(shù)組比無顯著差異(P>0.05)。見表2。與假手術(shù)組比，AD大鼠血清MDA含量升高(P<0.05)。川芎嗪治療后，與AD模型組相比，大鼠血清MDA含量降低(P<0.05)，與假手術(shù)組比無顯著差異(P>0.05)。見表2。

表1 各組大鼠海馬組織細(xì)胞內(nèi)總ROS含量±s,n=10)

注：與假手術(shù)組相比a)P<0.05，與AD模型組相比b)P<0.05。

表2 各組大鼠血清SOD活性和MDA含量

注：與假手術(shù)組相比a)P<0.05，與AD模型組相比b)P<0.05。

2.3 川芎嗪對AD模型大鼠海馬細(xì)胞內(nèi)SOD活性和MDA含量的影響

與假手術(shù)組比，AD大鼠海馬細(xì)胞內(nèi)SOD活性降低(P<0.05)。川芎嗪治療后，與AD模型組相比，大鼠海馬細(xì)胞內(nèi)SOD活性升高(P<0.05)，與假手術(shù)組比無顯著差異(P>0.05)，見表3。與假手術(shù)組比，AD大鼠海馬細(xì)胞內(nèi)MDA含量升高(P<0.05)。川芎嗪治療后，與AD模型組相比，大鼠海馬細(xì)胞內(nèi)MDA含量降低(P<0.05)，與假手術(shù)組比無顯著差異(P>0.05)，見表3。

表3 各組大鼠海馬細(xì)胞內(nèi)SOD活性和MDA含量

注：與假手術(shù)組相比a)P<0.05，與AD模型組相比b)P<0.05。

3 討論

氧化應(yīng)激指有害刺激作用機(jī)體時(shí)，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，活性氧自由基(ROS)產(chǎn)生過多超出氧化物的清除，導(dǎo)致組織損傷[5,6]。細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的水平可由ROS的生成多少直接反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)川芎嗪干預(yù)后，AD模型大鼠總ROS含量明顯降低，說明川芎嗪對AD模型大鼠海馬組織細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平有明顯的影響。川芎嗪減輕氧化應(yīng)激對神經(jīng)元損傷可能通過降低過氧化物和氧化自由基的生成。生物體清除自由基通過SOD(超氧化物歧化酶)，SOD可阻斷并修復(fù)氧化自由基對組織細(xì)胞的侵害[7, 8]。MDA是是生物細(xì)胞的氧化應(yīng)激導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化的終末代謝產(chǎn)物。AD發(fā)病過程中MDA的毒性可使神經(jīng)元變性壞死凋亡，因此，機(jī)體受ROS攻擊的程度MDA能夠間接反映出來[9,10]。老年斑、神經(jīng)元纖維纏結(jié)常和MDA的高水平同時(shí)出現(xiàn)在AD模型大鼠腦組織。本實(shí)驗(yàn)中AD模型大鼠血清SOD活性下降，MDA含量顯著升高。川芎嗪干預(yù)后，提高了SOD活性，可使脂質(zhì)過氧化減少，氧化自由基被有效的清除，川芎嗪干預(yù)后，降低了MDA含量，減輕了組織脂質(zhì)過氧化損傷，MDA毒性引發(fā)的組織損傷可以避免。綜上，AD大鼠抗氧化能力川芎嗪能夠在整體水平提高。本實(shí)驗(yàn)中，川芎嗪干預(yù)后，明顯升高AD大鼠海馬細(xì)胞SOD活性，降低MDA含量，提示川芎嗪可從整體和病變的關(guān)鍵區(qū)域(海馬組織)兩方面提高AD模型大鼠機(jī)體的抗氧化能力。

[1]SmidSD,MaagJL,MusgraveIF.Dietarypolyphenol-derivedprotectionagainstneurotoxicbeta-amyloidprotein:frommoleculartoclinical[J].FoodFunct，2012，3(12):1242-1250

[2]HiraiK,AlievG,NunomuraA,etal.MitochondrialabnormalitiesinAlzheimer'sdisease[J].JNeurosci，2001，21(9):3017-3023

[3]DarveshAS,CarrollRT,BishayeeA,etal.OxidativestressandAlzheimer'sdisease:dietarypolyphenolsaspotentialtherapeuticagents[J].ExpertRevNeurother，2010， 10(5):729-745

[4]鄭衍芳，呂文昌，孫田靜.蟲草素在Aβ1-42寡聚體誘導(dǎo)AD模型大鼠神經(jīng)元損傷中的作用[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué), 2015，38(3):8-10

[5]胡玉華，顏凌，劉子酉，等.NADPH氧化酶在氟誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激中的作用[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2014，37(5):121-122

[6]UttaraB,SinghAV,ZamboniP,etal.Oxidativestressandneurodegenerativediseases:areviewofupstreamanddownstreamantioxidanttherapeuticoptions[J].CurrNeuropharmacol，2009，7(1):65-74

[7]ZemlanFP,ThienhausOJ,BosmannHB.SuperoxidedismutaseactivityinAlzheimer'sdisease:possiblemechanismforpairedhelicalfilamentformation[J].BrainRes，1989，476(1):160-162

[8]DeLeoME,BorrelloS,PassantinoM,etal.OxidativestressandoverexpressionofmanganesesuperoxidedismutaseinpatientswithAlzheimer'sdisease[J].NeurosciLett，1998，250(3): 173-176

[9]LovellMA,EhmannWD,ButlerSM,etal.Elevatedthiobarbituricacid-reactivesubstancesandantioxidantenzymeactivitynthebraininAlzheimer'sdisease[J].Neurology，1995，45(8):1594-601

[10]MarkesberyWR,LovellMA.Four-hydroxynonenal,aproductoflipidperoxidation,isincreasedinthebraininAlzheimer'sdisease[J].NeurobiolAging，1998，19(1):33-36

1.黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目，編號：201610222037；2. 佳木斯大學(xué)科基礎(chǔ)研究類(自然類)面上項(xiàng)目，編號：JMSUJCMS2016-023；3.黑龍江省普通高等學(xué)校青年學(xué)術(shù)骨干支持計(jì)劃項(xiàng)目，編號：1252G059。

王圣也(1996～)男，黑龍江巴彥人，在校本科生。

柳朝陽(1971～)男，黑龍江嘉蔭人，碩士，副主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail：ztlzy888@163.com。

R285.5；R

A

1008-0104(2017)02-0029-02

2017-02-04)