川芎嗪阻滯細(xì)胞周期抑制MCF-7細(xì)胞增殖的初步研究①

宋慶嬌，柳朝陽(yáng)，王 迪，王維銘，楊 瑩, 劉璐，張 濤

(佳木斯大學(xué)，黑龍江 佳木斯 154007 )

川芎嗪阻滯細(xì)胞周期抑制MCF-7細(xì)胞增殖的初步研究①

宋慶嬌，柳朝陽(yáng)，王 迪，王維銘，楊 瑩, 劉璐，張 濤

(佳木斯大學(xué)，黑龍江 佳木斯 154007 )

目的：探討川芎嗪阻滯細(xì)胞周期抑制細(xì)胞增殖抗乳腺癌機(jī)制。方法：MTT法檢測(cè)川芎嗪對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖抑制作用;PI單染法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)川芎嗪作用MCF-7細(xì)胞細(xì)胞周期分布。結(jié)果：不同濃度的川芎嗪作用MCF-7細(xì)胞24h、48h和72h可對(duì)MCF-7細(xì)胞的增殖產(chǎn)生直接抑制作用， 呈時(shí)間和劑量依賴性; 不同濃度的川芎嗪作用MCF-7細(xì)胞48h，川芎嗪誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞停滯于G1期，呈量效關(guān)系。結(jié)論：川芎嗪可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯抑制MCF-7細(xì)胞增殖。

川芎嗪; 細(xì)胞周期; 細(xì)胞增殖

乳腺癌的發(fā)病率全世界居女性惡性腫瘤之首。探討中藥防治乳腺癌機(jī)制是我國(guó)乳腺癌研究的重要任務(wù)。本研究以人乳腺癌細(xì)胞MCF-7為研究對(duì)象，觀察川芎嗪對(duì)MCF-7細(xì)胞細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖的影響。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株、藥品和試劑

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所購(gòu)買人乳腺癌MCF-7細(xì)胞。噻唑藍(lán)(MTT)、 胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、青鏈霉素、胰蛋白酶和細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)于Sigma公司，川芎嗪購(gòu)于北京中杉金橋生物公司。

1.2 方法

1.2.1MTT法檢測(cè)川芎嗪對(duì)MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用

胰酶消化MCF-7細(xì)胞(對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期)，制備2×105單細(xì)胞懸液接種培養(yǎng)24h后分別加入濃度為(0.25、0.5、1.0、2.0和4.0)mg/mL的川芎嗪，control組：無(wú)藥物，有細(xì)胞與DMEM培養(yǎng)基和0.05%DMSO，在加藥后的24h、48h和72h時(shí)分別取出培養(yǎng)板，MTT溶液10μL加入，37℃4h后，明顯的藍(lán)紫色顆粒結(jié)晶在陰性對(duì)照組中形成時(shí)，每孔加入150μLDMSO。570nm波長(zhǎng)檢測(cè)每孔吸光度值(Absorbance，A值)。

計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組平均A值/對(duì)照組平均A值)×100%。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)川芎嗪對(duì)MCF-7細(xì)胞周期的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞，分別加入濃度為(0.25、0.5、1.0、2.0和4.0)mg/mL的川芎嗪，control組：有細(xì)胞、DMEM培養(yǎng)基、0.05DMSO，無(wú)藥物，培養(yǎng)48h后用胰酶消化成單細(xì)胞懸液。

PI單染法檢測(cè)細(xì)胞周期：每組取l×106個(gè)細(xì)胞，冰乙醇固定，4℃冰箱過(guò)夜，離心棄上清，PBS重懸2次，離心。固定細(xì)胞用PI溶液染色。暗箱培養(yǎng)1h。

細(xì)胞被熒光標(biāo)記在流式細(xì)胞儀分選。用Multicycle軟件分析細(xì)胞周期中不同階段的細(xì)胞數(shù)目。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 川芎嗪對(duì)MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用

MTT檢測(cè)結(jié)果：與control組比，川芎嗪的不用濃度(0.25、0.5、1.0、2.0和4.0)mg/mL，24h、48h和72h分別作用MCF-7細(xì)胞，0.5mg/mL48h和72h細(xì)胞抑制率有顯著差異(P<0.05，P<0.01)見(jiàn)表1。2.0mg/mL和4.0mg/mL的川芎嗪在48h細(xì)胞抑制率比較有顯著差異(P<0.05)； 1.0mg/mL、2.0mg/mL和 4.0mg/mL的川芎嗪在48h與72h相比，細(xì)胞抑制率有顯著差異(P<0.05),見(jiàn)表1。川芎嗪作用MCF-7細(xì)胞，可直接抑制MCF-7增殖，呈時(shí)間依賴性和劑量依賴性。

表1 川芎嗪對(duì)MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用±s)

與control組相比，*P<0.05,**P<0.01；與0.5mg/mL組相比，★P<0.05；與48h組相比，#P<0.05。

2.2 川芎嗪對(duì)MCF-7細(xì)胞周期的影響

細(xì)胞周期結(jié)果顯示：川芎嗪(0.25、0.5、1.0、2.0和4.0)mg/mL作用MCF-7細(xì)胞48小時(shí)，與對(duì)照組(42.43%)相比，G0/G1期細(xì)胞所占百分比從47.32%隨濃度遞增依次增加至52.83%、59.60%、69.65%和80.11%，除0.25mg/mL外，G0/G1期百分率細(xì)胞遞增，呈劑量依賴性(P<0.05，P<0.01)，G2/M期和S期細(xì)胞減少(見(jiàn)表2)，以上表明川芎嗪作用MCF-7細(xì)胞，可以使細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯。

表2 川芎嗪對(duì)MCF-7細(xì)胞周期分布的影響

與control組相比，*P<0.05,**P<0.01。

3 討論

腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞的區(qū)別是細(xì)胞不斷增殖，因此，治療惡性腫瘤的主要手段是抑制細(xì)胞增殖是。中藥川芎萃取出來(lái)的單體生物堿川芎嗪，可以對(duì)微循環(huán)進(jìn)行改善、對(duì)血液凝集進(jìn)行抑制、擴(kuò)血管等生物作用[1]。文獻(xiàn)報(bào)道川芎嗪具有抗黑色素瘤、白血病、胃癌等作用[2，3]。

本研究表明，川芎嗪呈時(shí)間和劑量依賴性的對(duì)MCF-7細(xì)胞具有直接抑制增殖作用。 細(xì)胞增殖過(guò)程必須經(jīng)歷細(xì)胞周期，細(xì)胞周期可以分為G1期，S期，G2期和M期四個(gè)時(shí)期，在G1期細(xì)胞生物合成蛋白質(zhì)和RNA，DNA分子的復(fù)制在S期進(jìn)行。因?yàn)镚2期是為M期的有絲分裂做準(zhǔn)備，在這一期為保證準(zhǔn)確復(fù)制DNA，進(jìn)行必要的檢查及修復(fù)。M期是分裂期，完成細(xì)胞分裂，在這一期平均分配遺傳物質(zhì)到子細(xì)胞中。 失去控制的增值生長(zhǎng)作為腫瘤細(xì)胞的基本特征，一方面，細(xì)胞死凋亡數(shù)量減少，另外一方面細(xì)胞增殖和細(xì)胞去分化增加。腫瘤被理解為是細(xì)胞周期疾病，是因?yàn)楸姸嗟呐c腫瘤細(xì)胞發(fā)育有關(guān)的各種因素最終作用在控制細(xì)胞周期[4]。細(xì)胞增殖是被細(xì)胞周期調(diào)節(jié)控制的，G1/S期和G2/M期是細(xì)胞周期中調(diào)節(jié)細(xì)胞周期運(yùn)行的關(guān)鍵調(diào)控點(diǎn)。文獻(xiàn)報(bào)道，使腫瘤細(xì)胞在G2/M期聚集的中藥有款冬花、側(cè)柏葉、高良姜、銀杏、姜黃等提取物，他們可以引發(fā)抗腫瘤作用[5～7]。

本試驗(yàn)表明，川芎嗪作用MCF-7細(xì)胞，改變細(xì)胞周期的分布，一方面。MCF-7細(xì)胞數(shù)在G0/G1期增加，呈劑量依賴性，另外一方面。MCF-7細(xì)胞在G2/M和S期細(xì)胞數(shù)目減少；這個(gè)結(jié)果說(shuō)明川芎嗪可使細(xì)胞聚集在G1期，細(xì)胞不能進(jìn)入S期進(jìn)行DNA的復(fù)制和不能進(jìn)入M期進(jìn)行有絲分裂，這樣就能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖抑制和腫瘤細(xì)胞凋亡，所以我們認(rèn)為川芎嗪抑制MCF-7細(xì)胞增值與其影響細(xì)胞周期分布有關(guān)。

[1]王建峰.丹參川穹嗪注射液治療膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠的實(shí)驗(yàn)研究[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2013,36(6)：23-24

[2]謝佐福,沈世仁.川芎嗪和羥基脲對(duì)阿霉素K562 細(xì)胞株DNA合成的影響[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,1997,73(9)：559-560

[3]劉錦蓉,葉松柏.川芎嗪抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用及其機(jī)制[J].中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志,1993,7(2)：149-152

[4]張濤,田黎明,王昭,等.白花敗醬草對(duì)U14荷瘤鼠腫瘤細(xì)胞周期和PCNA表達(dá)的影響[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2011,34(3):84-85

[5]WeiYQ,ZhaoX,KariyaY,etal.Inductionofapoptosisbyquercetin:involvementofheatshockprotein[J].CancerResearch,1994,54:4951-4957

[6]李嬪, 田國(guó)才, 林娜, 等. 廣棗總黃酮對(duì)小鼠胸腺細(xì)胞凋亡及腺苷脫氧酶(ADA)活性的影響[J]. 中華微生物和免疫學(xué)雜志, 1998,18(6)：386-391

[7]薛妍, 夏天, 趙建斌, 等. 姜黃素對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721的抑制作用[J]. 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2000,25(5):84-86

1.黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目，編號(hào)：201510222026；2. 佳木斯大學(xué)科基礎(chǔ)研究類(自然類)面上項(xiàng)目，編號(hào)：JMSUJCMS2016-023；3.黑龍江省普通高等學(xué)校青年學(xué)術(shù)骨干支持計(jì)劃項(xiàng)目，編號(hào)：1252G059。

宋慶嬌(1996～)女，黑龍江肇東人，在校本科生。

張濤(1971～)女，黑龍江嘉蔭人，博士，教授，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail：ztlzy888@163.com。

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1008-0104(2017)02-0027-02

2017-02-08)