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    抗旱水稻種子轉(zhuǎn)基因成分檢測技術(shù)研究

    2017-06-05 15:20:04鄧漢超劉玉琛鄧國標(biāo)陳惠芳楊啟鵬周向陽
    中國種業(yè) 2017年5期
    關(guān)鍵詞:磁珠內(nèi)源核酸

    鄧漢超 劉玉琛 鄧國標(biāo),4 劉 晉 陳惠芳 楊啟鵬 周向陽

    (1深圳市農(nóng)業(yè)科技促進中心,深圳 518040;2農(nóng)業(yè)部農(nóng)作物種子質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(深圳),廣東深圳 518040;3深圳市作物分子育種研究院,深圳 518107;4廣東省龍門縣衛(wèi)生和計劃生育局,惠州 516800)

    抗旱水稻種子轉(zhuǎn)基因成分檢測技術(shù)研究

    鄧漢超1,2劉玉琛3鄧國標(biāo)3,4劉 晉1,2陳惠芳1,2楊啟鵬1,2周向陽1,2

    (1深圳市農(nóng)業(yè)科技促進中心,深圳 518040;2農(nóng)業(yè)部農(nóng)作物種子質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(深圳),廣東深圳 518040;3深圳市作物分子育種研究院,深圳 518107;4廣東省龍門縣衛(wèi)生和計劃生育局,惠州 516800)

    利用組織研磨儀快速處理水稻種子樣品,采用高通量的磁珠純化系統(tǒng)提取樣本DNA,提取的核酸通過紫外吸收檢測其純度,應(yīng)用普通PCR檢測方法和實時熒光PCR方法對水稻內(nèi)源基因SPS、靶基因ATAF1進行檢測。結(jié)果表明,普通PCR方法和實時熒光PCR方法均表現(xiàn)快速、準(zhǔn)確、特異性高的特點。

    普通PCR;實時熒光PCR;轉(zhuǎn)基因

    轉(zhuǎn)基因作物的大量種植和推廣同時對轉(zhuǎn)基因生物的檢測技術(shù)提出要求,發(fā)達國家的轉(zhuǎn)基因及相關(guān)檢測技術(shù)遠遠超過發(fā)展中的國家。美國、加拿大等國已有近百種轉(zhuǎn)基因食品上市,并且他們的目標(biāo)是把大量的轉(zhuǎn)基因食品出口到發(fā)展中國家[1-3]。在這些正式獲批進行生產(chǎn)和貿(mào)易的產(chǎn)品之外,更有數(shù)目眾多的品種處于試驗階段或未經(jīng)正常手續(xù)進入市場,我國已經(jīng)加入WTO,正在面臨著轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品貿(mào)易和安全監(jiān)測的挑戰(zhàn)。同時隨著商品化轉(zhuǎn)基因生物的種類不斷增加,轉(zhuǎn)基因生物本身的安全性以及它們對人類健康和生態(tài)環(huán)境的潛在威脅成為國際社會和廣大民眾廣泛關(guān)注的熱點問題之一[4-6];包括我國在內(nèi)的越來越多的國家制定并實施了轉(zhuǎn)基因食品的強制標(biāo)識制度。因此,轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的科學(xué)管理和應(yīng)用需要得到轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品及其成分檢測技術(shù)的支持。追蹤轉(zhuǎn)基因生物研發(fā)動態(tài),研發(fā)相適應(yīng)的檢測技術(shù),制定相應(yīng)的檢測標(biāo)準(zhǔn),是轉(zhuǎn)基因生物安全監(jiān)管的重要措施。本文以轉(zhuǎn)抗旱基因ATAF1水稻種子為材料,初步建立外源基因的普通PCR和實時熒光PCR檢測方法。

    1 材料與方法

    1.1 材料 本實驗室獲得的轉(zhuǎn)ATAF1基因水稻70株,種子保存于本實驗室種子低溫低濕儲藏庫中備用。

    主要儀器和試劑:MP組織研磨儀(24樣)、Themo磁珠核酸自動提取純化儀(96樣)、Omega核酸提取試劑盒、Premix Ex Taq酶、Neno1000紫外分光光度計、BIO-RAD iCycler PCR擴增儀、ABI7500實時熒光PCR擴增儀、RAININ edp3 plus排槍(12通道)等。

    1.2 方法

    1.2.1 樣品處理 水稻種子取5粒,置于2mL離心管中,放入1粒陶瓷珠,加入500μ L Buffer SLX Minus裂解液(Omega 核酸提取試劑盒)或500μL 2% CTAB 裂解液,浸泡數(shù)小時后采用MP組織研磨儀設(shè)置震蕩速度4.0 M/s、震蕩時間30s,震蕩粉碎5~6次,備用。

    1.2.2 DNA的提取 磁珠自動提取法:粉碎樣品在65℃水浴1h,其間上下顛倒2~3次。12000r/min離心10min。取上清200μ L于深孔96平板、800μL Buffer PHB于深孔96平板、800深孔96平板、100深孔96平板、一個Tip按照表1依次加入Omega 核酸提取試劑盒中的試劑。啟動Themo磁珠核酸自動提取純化系統(tǒng),根據(jù)系統(tǒng)提示依次放入上述試劑板。當(dāng)DNA提取完畢,取出5號板,將DNA保存在-20℃下備用。

    表1 磁珠核酸自動提取純化系統(tǒng)物品

    1.2.3 核酸濃度及純度測定 采用Neno1000紫外分光光度法測定所提取的核酸的純度和濃度。

    1.2.4 引物設(shè)計 水稻內(nèi)源基因SPS基因引物設(shè)計分別參考文獻[7]。F:5′-ttgcgcctgaacggatat-3′,R:5′-ggagaagcactggacgagg-3′,產(chǎn)物大小277bp;ATAF1引物F:5′-TAGCCCTGCCTTCATACGCT-3′,R:5′-CGGCAGAGAACCCAATCATC-3′,產(chǎn)物大小580bp。特異性引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。

    1.2.5 PCR擴增檢測 普通PCR反應(yīng)體系:20μ L反應(yīng)液中含有10μ L Primex Ex Taq,0.4μ L Forward primer(10μmol/L),0.4μ L Reverse primer(10μ mol/L),2μ L模板DNA(10~50 ng/μ L),補ddH2O至20μ L。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性2min;95℃ 30s,58℃ 30s,72℃ 40s,40個循環(huán);72℃延伸 2min;15℃ 2min。取PCR產(chǎn)物5μ L加1μ L點樣液混合后點入上樣孔,于90V電壓電泳30~40min。電泳結(jié)束后,采用自動凝膠成像分析系統(tǒng)檢測。

    實時熒光PCR反應(yīng)體系:20μ L反應(yīng)液中含有10μ L BIO-RAD Supermix with low ROX,0.4μ L Forward primer(10μ mol/L),0.4μ L Reverse primer(10μ mol/L),2μ L模板DNA(10~50ng/μ L),補ddH2O至20μ L。反應(yīng)條件:95℃ 10s;95℃ 5s,60℃ 34s,40個循環(huán);15℃ 2min。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 核酸質(zhì)量檢測

    2.1.1 紫外吸收檢測 提取的水稻種子DNA通過Neno1000紫外分光光度計測定濃度,均有明顯的OD260檢測峰,OD260/OD280均在1.8~2.1之間,濃度在10~100ng/μ L之間,提取核酸能滿足PCR需求。

    2.1.2 內(nèi)源基因PCR電泳檢測 以水稻內(nèi)源基因SPS為參照基因?qū)悠稤NA進行擴增,結(jié)果如圖1所示,70個樣品均能擴增出明顯的277bp大小條帶,并且陰性對照和陽性對照均正常。

    2.1.3 內(nèi)源基因?qū)崟r熒光PCR檢測 隨機挑取部分水稻種子樣品對內(nèi)源基因進行實時熒光PCR檢測,各樣品檢測閾值和Tm值見表2,從結(jié)果可知,所有檢測樣品在實時熒光檢測中均有抬頭,檢測閾值在24~30之間,樣品溶解曲線均在同一個位置有高峰,樣品Tm值為88.8。

    圖1 樣品SPS基因擴增凝膠電泳分析結(jié)果

    表2 部分樣品SPS基因EvaGreen熒光檢測閾值和Tm值

    2.2 目的基因ATAF1檢測

    2.2.1 ATAF1基因PCR電泳檢測 以外源ATAF1基因?qū)悠稤NA進行擴增檢測,結(jié)果如圖2所示,70個樣品部分樣品能檢測到明顯的580bp大小條帶,并且陰性對照和陽性對照均正常。

    圖2 樣品ATAF1基因擴增凝膠電泳分析結(jié)果

    2.2.2 ATAF1基因?qū)崟r熒光PCR檢測 對隨機挑取的部分水稻種子樣品同時進行ATAF1基因?qū)崟r熒光PCR檢測,從結(jié)果可知,所有檢測樣品在實時熒光檢測中均有抬頭,其中部分檢測閾值在16~22之間,部分大于34(表3),樣品溶解曲線均在同一個位置有高峰,樣品Tm值為85.2/84.8。

    表3 部分樣品ATAF1基因EvaGreen熒光檢測閾值和Tm值

    3 結(jié)論與討論

    本研究采用磁珠自動提取法大規(guī)模地提取水稻種子的DNA,利用紫外分光光度計檢測提取DNA的質(zhì)量,結(jié)果表明大部分提取的DNA濃度(大于10ng/μL)和純度(OD260/OD280在1.8~2.1之間)均滿足一般要求,而部分樣品的濃度和純度未落在上述范圍內(nèi),濃度僅有2~3ng/μL,OD260/OD280有的小于1或大于2.5。同時利用內(nèi)源基因檢測方法檢測提取DNA質(zhì)量時,這部分樣品DNA均能非常清晰地檢測到內(nèi)源條帶。因此在PCR擴增檢測中,評價提取DNA的質(zhì)量不單單僅考慮紫外吸收檢測的結(jié)果,同時結(jié)合內(nèi)源基因檢測信息,更好地保證PCR擴增所需DNA的質(zhì)量。

    通過設(shè)計外源ATAF1基因引物對研發(fā)中的轉(zhuǎn)基因水稻種子進行普通PCR擴增,瓊脂糖凝膠電泳檢測,初步建立普通PCR篩選檢測轉(zhuǎn)基因成分的方法。同時挑選部分樣品初步研究實時熒光PCR檢測方法,以EvaGreen作為熒光染料,對內(nèi)源基因和外源基因進行實時擴增,結(jié)果與普通PCR檢測基本一致,在外源基因檢測上,實時熒光PCR具有更高的靈敏度,如表2中Ct值>34的樣品在實時熒光檢測中能看到擴增曲線有抬頭,但是在普通PCR電泳檢測方法上未能見到條帶,說明這些樣品的轉(zhuǎn)基因成分含量很低,普通PCR未能檢測到,而用實時熒光PCR方法能檢測較為微量的成分。

    [1] 鄧漢超.轉(zhuǎn)基因植物DNA成分檢測技術(shù)研究進展[J].中國種業(yè),2016(11):19-21

    [2] 侯大軍,李洪軍.轉(zhuǎn)基因食品的發(fā)展歷史與未來趨勢[J].四川食品與發(fā)酵,2007(5):24-27

    [3] 楊銘鐸,張春梅,華慶,等.轉(zhuǎn)基因食品快速檢測技術(shù)的研究進展[J].食品科學(xué),2004,25(11):424-427

    [4] 葉興國.從轉(zhuǎn)基因技術(shù)角度談轉(zhuǎn)基因植物的安全性[J].中國種業(yè),2016(9):12-13

    [5] 陳飛,劉陽,邢福國.轉(zhuǎn)基因食品的免疫安全性評價[J].食品科學(xué),2012,33(9):296-300

    [6] 祁瀟哲,黃昆侖.轉(zhuǎn)基因食品安全評價研究進展[J].中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報,2013,15(4):14-19

    [7] Jiang L X,Yang L T,Zhang H B,et al.International Collaborative Study of the Endogenous Reference Gene,Sucrose Phosphate Synthase(SPS),Used for Qualitative and Quantitative Analysis of Genetically Modified Rice[J].J Agric Food Chem,2009,57:3525-3532

    2017-02-21)

    轉(zhuǎn)基因新品種培育重大專項(2009ZX08001-023B);深圳市技術(shù)創(chuàng)新項目(CXZZ20120614165508810)

    劉晉

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