玉米莖腐病病原菌檢測方法研究

馬紅霞, 張海劍, 孫 華, 石 潔, 陳 丹, 郭 寧

(河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 農(nóng)業(yè)部華北北部作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北省農(nóng)業(yè)有害生物綜合防治工程技術(shù)研究中心, 保定 071000)

玉米莖腐病病原菌檢測方法研究

馬紅霞, 張海劍, 孫 華, 石 潔*, 陳 丹, 郭 寧

(河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 農(nóng)業(yè)部華北北部作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北省農(nóng)業(yè)有害生物綜合防治工程技術(shù)研究中心, 保定 071000)

為提高玉米莖腐病病原菌檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可信度,以組織分離法做對比,采用分子檢測法,對采自田間的189個玉米莖腐病病株進(jìn)行真菌種類的鑒定和數(shù)量的統(tǒng)計。結(jié)果表明,分子檢測法對腐霉Pythiumspp.的檢出頻率為29.24%,對鐮孢菌Fusariumspp.的檢出頻率為73.68%,組織分離法對腐霉的檢出頻率僅為0.58%,對鐮孢菌的檢出頻率為60.82%,兩方法的符合率最高僅為35.92%,最低為0。因此,采用組織分離和分子檢測相結(jié)合的方法可提高玉米莖腐病病原菌鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

玉米莖腐病; 鐮孢菌; 腐霉

玉米莖腐病引起的早衰和倒伏已成為制約我國玉米持續(xù)增產(chǎn)和機(jī)械化進(jìn)程的重要因素[1]。莖腐病由多種病原菌單獨(dú)或復(fù)合侵染[2],導(dǎo)致該病的抗性遺傳規(guī)律非常復(fù)雜,這給抗病育種和病害防治工作帶來很大的困難[3]。近年來,在生產(chǎn)上品種抗性“喪失”的情況時有發(fā)生,因此,明確不同玉米種植區(qū)莖腐病的病原菌種類及其種群結(jié)構(gòu)尤為重要。

玉米莖腐病是世界上玉米產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生的一種重要土傳病害[4],其病原菌準(zhǔn)確鑒定一直是個難題。目前玉米莖腐病病原菌的鑒定通常采用組織分離法,即樣品從田間采回后,立即進(jìn)行組織分離,并純化分離物,再進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定或分子鑒定[5]。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡便,對設(shè)備要求不高。然而該方法是建立在病原菌分離培養(yǎng)基礎(chǔ)上的,鑒定結(jié)果易受采集和分離過程中許多因素的影響,其結(jié)果的準(zhǔn)確性和可信度常被質(zhì)疑,如分離采用的培養(yǎng)基種類、采集分離的時間、分離部位、病株的病級等差異都可使莖腐病的兩種主要病原菌腐霉Pythiumspp.和鐮孢菌Fusariumspp.的分離頻率發(fā)生很大的變化, 從而導(dǎo)致鑒定結(jié)果的差異[6]。

本研究從玉米植株發(fā)病組織中直接提取基因組DNA,檢測病樣組織中真菌的種類和數(shù)量(分子生物學(xué)鑒定方法),同時應(yīng)用常規(guī)病原菌分離檢測方法進(jìn)行鑒定,對比分析兩種檢測方法獲得的結(jié)果,以期建立一種更準(zhǔn)確鑒定玉米莖腐病病原菌的新方法。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及預(yù)處理

2015年從河北、河南、山東、安徽和江蘇5省32市的91個不同地點(diǎn)采集了189株玉米莖腐病初期發(fā)病植株,取莖基部帶出田間。在地邊及時將取樣莖稈表面以70%乙醇棉擦拭并在酒精燈火焰上掠過,用消毒的手術(shù)刀將莖縱剖兩半,從其中一半中取髓部組織分別放置在PDA和CMA兩種培養(yǎng)基上,每皿4塊;同時取另一半同一部位的組織放置在1.5 mL離心管中并即刻投入液氮中保存。返回實(shí)驗(yàn)室后及時將初分離物進(jìn)行純化,并于4℃保存待用。

1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉20 g、蒸餾水1 L。CMA培養(yǎng)基:玉米粉30 g、瓊脂粉17 g、蒸餾水1 L。LB固體培養(yǎng)基:胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、氯化鈉10 g/L、瓊脂粉15 g/L,pH 7.4。LB液體培養(yǎng)基:胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、氯化鈉10 g/L。

1.3 主要生化試劑與設(shè)備

艾德萊真菌基因組提取試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司;β-巰基乙醇、膠回收試劑盒、氨芐青霉素鈉、50×TAE、DL2000等購自TaKaRa公司;PCR試劑購自康為世紀(jì);pGM-T Vector、DH5α感受態(tài)細(xì)胞等試劑購自天根生化科技(北京)有限公司;低熔點(diǎn)瓊脂糖、胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉等購自Sigma公司;PCR引物合成及序列測定均由北京諾賽基因組研究中心有限公司完成;其余試劑為國產(chǎn)分析純。ETC811型PCR儀購自蘇州東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司、DYY-11型電泳儀購自北京六一儀器廠、GelDoc XR+凝膠成像分析系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司、Neofuge 15R臺式高速冷凍離心機(jī)購自上海力申科學(xué)儀器有限公司。

1.4 DNA提取

刮取純化后的菌株菌絲,液氮研磨,使用艾德萊真菌基因組提取試劑盒基因組DNA。用同樣的方法將保存于液氮中的玉米莖髓部組織提取其基因組DNA。于-20℃保存待用。

1.5 PCR擴(kuò)增與序列分析

使用真菌通用引物ITS1/ITS4擴(kuò)增1.4中獲得的基因組DNA。PCR反應(yīng)體系為25 μL:DNA 1 μL、上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL、2×EsTaqMaster Mix 12.5 μL,加ddH2O補(bǔ)足至25 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?95℃預(yù)變性7 min;95℃變性30 min;57℃退火45 s;72℃延伸30 s,35個循環(huán),72℃延伸8 min,4℃保存。將PCR產(chǎn)物交由北京諾賽基因組研究中心進(jìn)行測序,測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST比對。

對出現(xiàn)重疊峰的基因組DNA,針對植物組織分離中可能獲得的致病相關(guān)真菌和卵菌,分別采用表1中的引物進(jìn)行擴(kuò)增,將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物測序,測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST比對。以芒孢腐霉、層出鐮孢、禾谷鐮孢和擬輪枝鐮孢標(biāo)準(zhǔn)菌株為陽性對照,水為陰性對照。PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序同上。退火溫度依引物而定。

對未鑒定出的真菌DNA模板采用通用引物EF-1F/EF-1R擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)回收試劑盒純化后,與pGM-T Vector于24℃連接2 h,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,再將成功的陽性克隆樣品送至北京諾賽基因組研究中心進(jìn)行DNA序列測定,測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST比對。

表1 本研究中涉及的引物

1.6 樣品檢測結(jié)果分析

用檢出頻率和符合率評估檢測方法的優(yōu)劣。樣品中檢出病原菌即判定該樣品攜帶該病原菌。檢出頻率(%)=某種病原菌檢出樣品數(shù)/檢出病原菌樣品總數(shù)×100;符合率(%)=兩種方法檢測出同種病原菌的樣品數(shù)/該種病原菌檢出樣品總數(shù)×100[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 真菌種類及數(shù)量檢測

采用分子檢測法檢測了189個樣品。用真菌通用引物ITS1/ITS4擴(kuò)增后測序,有144個樣品(76.19%)檢測到真菌,其中78個樣品檢測到單一真菌,有66個樣品出現(xiàn)重疊峰,表明這部分樣品中可能存在2種(含)以上真菌,分別使用特異性引物對這66個樣品進(jìn)行擴(kuò)增,有61個樣品檢測出含有2種及以上真菌,在1個樣品中最多檢測出4種真菌;使用特異性引物未檢測成功的5個樣品采用通用引物EF-1F/EF-1R及克隆轉(zhuǎn)化的方法得到結(jié)果。采用組織分離法,有143個樣品分離出真菌,共獲得195個菌株;有41個樣品分離出了2種(含)以上真菌。兩種方法共有171個樣本檢測出真菌(表2)。

表2 檢出多種真菌的樣品數(shù)量比較

分子檢測法檢測出9種真菌,組織分離法檢測出13種真菌。其中分子檢測法檢測出的腐霉菌種類為3種,明顯多于組織分離法檢測出的1種;對于鐮孢菌兩種方法檢測出的種類相同,均為4種;分子檢測法檢測出的其他真菌的種類為2種,遠(yuǎn)少于組織分離法檢測出的8種(表3)。

2.2 主要病原菌檢出頻率及符合率

在我國,引起玉米莖腐病的主要病原菌普遍被認(rèn)為是鐮孢屬和腐霉屬的真菌。本研究采用組織分離法和分子檢測法共檢出171個真菌DNA,其中,分子檢測法對腐霉屬的檢出頻率為29.24%,明顯高于組織分離法的0.58%;對鐮孢屬的檢出頻率為73.68%,也高于組織分離法的60.82%;對其他真菌的檢出頻率較低,僅為2.34%,低于組織分離法的42.11%(表4)。

表3 檢出真菌種類比較

表4 對腐霉屬和鐮孢屬真菌檢出頻率比較

從檢出頻率看,分子檢測法對芒孢腐霉、禾生腐霉、棘腐霉、禾谷鐮孢、層出鐮孢和擬輪枝鐮孢的檢出頻率較高,分別為27.49%、1.17%、0.58%、43.27%、19.30%、41.52%,遠(yuǎn)高于組織分離法的檢出頻率(表5)。

分子檢測法與組織分離法檢出的腐霉和鐮孢菌的符合率存在差異。在189個樣品中,采用組織分離法檢測出的腐霉菌只有芒孢腐霉,且只有1株,病原菌檢出頻率為0.58%;而采用分子檢測法檢出了3種腐霉:芒孢腐霉、禾生腐霉和棘腐霉,檢出頻率提高到29.24%(表4)。兩種檢測方法的符合率僅為2.13%(表5),表明分子檢測法對腐霉的檢測結(jié)果優(yōu)于組織分離法。

分子檢測法檢出的鐮孢菌種類和組織分離法一致,但不同種的病原菌檢出頻率和符合率存在差異。如禾谷鐮孢的檢出頻率相近,分別為38.60%和43.27%,但符合率為35.92%,表明在103個檢出禾谷鐮孢的樣品中僅有37個樣品用兩種方法同時檢測出,說明對禾谷鐮孢而言,兩種方法中的任何一種均不能檢出所有帶菌樣品。層出鐮孢和擬輪枝鐮孢的檢出頻率雖遠(yuǎn)高于組織分離法,但符合率分別為7.89%和14.29%,也不能檢出所有帶菌樣品。分子檢測法僅有2.92%的樣品檢出厚垣鐮孢,低于組織分離法的13.45%,符合率為7.69%。

對于其他真菌,分子檢測法僅有2.34%的樣品檢出,而組織分離法有42.11%的樣品檢出。

表5 對病原菌檢出頻率及符合率比較

2.3 鐮孢菌和腐霉同時被檢出情況比較

用組織分離法僅分離到1株腐霉且該樣本未分離到其他真菌。用分子檢測法檢測到50株腐霉,其中有33株與鐮孢菌共同檢測到,22株與禾谷鐮孢共同被檢測到。

3 討論

玉米莖腐病又稱玉米莖基腐病、玉米青枯病等,是我國玉米上主要病害。感病植株在玉米生長乳熟期開始葉片呈現(xiàn)青灰色或黃色枯萎,根系和莖基部節(jié)位變軟變空,果穗下垂,植株死亡,容易倒伏。玉米莖腐病一般引起減產(chǎn)20%,嚴(yán)重時可致減產(chǎn)50%～60%[13]。我國研究者普遍認(rèn)為,引起該病的病原菌以禾谷鐮孢和腐霉為主,二者單獨(dú)或者復(fù)合侵染,其種群結(jié)構(gòu)及優(yōu)勢病原菌因地區(qū)而異[14-15]。玉米莖腐病病原菌的種類和數(shù)量受氣候因子和土壤中的生物因子等多種因素影響,地區(qū)間、年度間變化較大[16]。

對于玉米莖腐病病原菌檢測方法,最早采用組織分離法分離純化,然后根據(jù)分離菌株的菌落形態(tài)、顏色、孢子大小、形狀等對病原菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定[17],參照《Monograph of the GenusPythium》[18]、《中國真菌志》[19]、Key toPythium[20]、《TheFusariumLaboratory Manual》[21]和《真菌鑒定手冊》[22]。近年來,隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,人們開始采用形態(tài)學(xué)鑒定與分子鑒定相結(jié)合的方式[23],這大大提高了病原菌鑒定的準(zhǔn)確性。但是,因?yàn)槿匀徊捎媒M織分離法分離純化,受到培養(yǎng)基、植株發(fā)病程度(與采集時間密切相關(guān))等的影響,因此,在各地致病菌的檢測結(jié)論方面仍有不同認(rèn)識。

本研究采用分子生物學(xué)手段檢測感病組織中的病原菌,以期提高鑒定的準(zhǔn)確性。結(jié)果表明,189個樣品中有144個樣品(76.19%)檢測到真菌DNA,其中采用真菌通用引物ITS1/ITS4從78個樣品中擴(kuò)增出單一真菌;余下的66個樣品分別使用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,又從61個樣品中檢測出真菌;使用特異性引物未檢測出結(jié)果的樣品采用真菌通用引物EF-1F/EF-1R及克隆轉(zhuǎn)化的方法檢測到結(jié)果。在這部分樣品中由于受特異性引物數(shù)量的限制,不能排除還存在未檢出真菌。

在本研究中,對于腐霉屬病原菌的檢測,組織分離法僅檢出了1株腐霉,檢出頻率為0.58%,而分子檢測法檢出了3種腐霉,檢出頻率達(dá)到29.24%,不僅檢出種類多,而且敏感性高。因此,對于腐霉的檢測,采用分子檢測法更為高效。這是因?yàn)樵谔镩g用培養(yǎng)基不適合腐霉的分離,腐霉在培養(yǎng)基上的定殖生長能力弱于禾谷鐮孢,在腐霉菌落上,禾谷鐮孢仍可以生長,但是在禾谷鐮孢菌落上,腐霉則不能生長[24]。如果采用無營養(yǎng)成分的水瓊脂培養(yǎng)基WA可能會有利于腐霉的分離。也可以將在PDA培養(yǎng)基上初步分離長出的菌落提取混合DNA,然后用ITS4/DC6進(jìn)行PCR檢測,有可能會分離或檢測到腐霉的存在。

對于鐮孢屬病原菌的檢測,分子檢測法檢出的種類和組織分離法一致,其中對禾谷鐮孢、層出鐮孢和擬輪枝鐮孢的檢出頻率和敏感性均高于組織分離法,但是符合率結(jié)果表明兩種方法中的任何一種均不能檢出所有帶菌樣品,因此在檢測鐮孢菌時應(yīng)采用以上兩種方法相結(jié)合的方式。理論上,鐮孢菌的種特異性引物可以檢測出所有存在于發(fā)病植株中的鐮孢菌,但實(shí)際結(jié)果是部分鐮孢菌在組織分離法中檢出而采用該方法未檢測出,這是因?yàn)檎婢L速度快,極少的病原菌在充足的培養(yǎng)時間內(nèi)均能夠形成菌落,而在分子檢測法中,如果組織中病菌含量低則會造成提取DNA含量少,加之引物靈敏度低等原因而得不到擴(kuò)增結(jié)果。在分子檢測法中能夠檢測到病原菌,而在組織分離法中未分離得到。這可能是由于毛霉等生長速度快,掩蓋了鐮孢菌的存在,致使不能分離得到鐮孢菌。

分子檢測法中厚垣鐮孢的檢出敏感性遠(yuǎn)低于組織分離法,是因本研究中沒有找到厚垣鐮孢的特異性引物,故僅在用特異性引物未鑒定出的樣品中檢出部分,導(dǎo)致檢出的數(shù)量不全。

分子檢測法對其他真菌的檢出數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于組織分離法,表明這些真菌大多數(shù)情況下并非單獨(dú)在樣品中存在,而是和其他病原菌并存,其是否是玉米莖腐病病原菌或者在玉米莖腐病病原菌侵染中的作用和地位有待進(jìn)一步研究。

分子檢測法的優(yōu)點(diǎn)是克服了培養(yǎng)基選擇性問題[25-26],排除了取樣分離時期、病株的病級和操作人分類學(xué)水平等的影響,針對性強(qiáng),對我國玉米莖腐病主要病原菌腐霉和鐮孢菌的檢出敏感性高。缺點(diǎn)是,目前研發(fā)的特異性引物只是很少的一部分,不能覆蓋全部的真菌。因此,可采用組織分離和分子檢測相結(jié)合的方法,進(jìn)一步提高莖腐病病原菌鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

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(責(zé)任編輯：楊明麗)

Comparison of pathogen detection methods for corn stalk rot

Ma Hongxia, Zhang Haijian, Sun Hua, Shi Jie, Chen Dan, Guo Ning

(Plant Protection Institute of Hebei Academy of Agricultural and Forestry Sciences, IPM Centre of Hebei Province, KeyLaboratory of IPM on Crops in Northern Region of North China, Ministry of Agriculture, Baoding 071000, China)

In order to improve the accuracy and credibility of detection results of pathogen causing corn stalk rot, the species of 189 fungal strains collected from the diseased corn plants in the field were identified and the number of fungi was counted by molecular detection and tissue isolation. The results showed that the detection frequency was 29.24% forPythiumspp. and 73.68% forFusariumspp. by molecular detection, while the detection frequency was 0.58% forPythiumspp. and 60.82% forFusariumspp. by tissue isolation. The highest coincidence rate was only 35.92% and the lowest was 0 between the two methods. Therefore, combination of tissue isolation and molecular detection methods can improve the accuracy of identification of the pathogen causing corn stem rot.

corn stalk rot;Fusariumspp.;Pythiumspp.

2016-05-24

2016-07-11

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-02)

S 435.131

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.03.025

* 通信作者 E-mail: shij99@163.com