非酒精性脂肪肝病動(dòng)物模型的探討

李曉波 李燕(通訊作者)

650031昆明理工大學(xué)附屬昆華醫(yī)院干部保健科

非酒精性脂肪肝病動(dòng)物模型的探討

李曉波 李燕(通訊作者)

650031昆明理工大學(xué)附屬昆華醫(yī)院干部保健科

目的：探討非酒精性脂肪肝病(NAFLD)大鼠模型的建立。方法：選擇雄性SD大鼠40只，平均分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)高脂灌胃12周后，分別處死大鼠各半，肝臟組織切片HE染色，測(cè)定肝功、血脂，稱取大鼠體重及肝臟重量，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理分析。結(jié)果：高脂飲食可以成功建立大鼠NAFLD模型。結(jié)論：高脂飲食建立NAFLD大鼠模型，簡(jiǎn)單易行，成本低，方便臨床進(jìn)行NAFLD發(fā)病機(jī)制、藥物干預(yù)的研究。

非酒精性脂肪肝??；動(dòng)物模型；高脂飲食

非酒精性脂肪肝病是一種臨床較為常見(jiàn)的肝臟疾病，主要指患者無(wú)大量飲酒史，但在對(duì)肝臟進(jìn)行檢查時(shí)顯示肝臟出現(xiàn)脂肪變性的特征。除脂肪變性的特點(diǎn)外，患者還常伴有肝細(xì)胞損傷、肝癌甚至肝功能衰竭等[1]。臨床上根據(jù)肝臟損傷的程度，把NAFLD分為單純性非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及脂肪堆積引起的相關(guān)肝硬化等。NAFLD發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，中國(guó)城市發(fā)病率約30%[2]，對(duì)人們的健康和生活產(chǎn)生嚴(yán)重的影響。NAFLD的發(fā)病機(jī)制、治療已成為研究熱點(diǎn)。肝組織活檢可判定NAFLD病理學(xué)改變，為診斷及判定NAFLD病情的金標(biāo)準(zhǔn)。但NAFLD的肝臟組織病理學(xué)診斷在人體難以實(shí)現(xiàn)，且藥物干預(yù)后人體肝臟病理學(xué)變化難以進(jìn)行觀察，選擇一種簡(jiǎn)單易行、穩(wěn)定的動(dòng)物模型極為重要。目前國(guó)內(nèi)外常用的NAFLD動(dòng)物模型有很多種，但是，其中最為理想的動(dòng)物模型必須有下面這些特點(diǎn)：①在動(dòng)物模型中建立的疾病，其特征必須與人類所患疾病的特征相似；②該病變有一定的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程；③動(dòng)物模型易于建立，在建立模型的過(guò)程中動(dòng)物的死亡率低，并且重復(fù)性好。本研究對(duì)高脂灌胃構(gòu)建NAFLD大鼠模型方法進(jìn)行探討，現(xiàn)報(bào)告如下。

資料與方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雄性SD大鼠40只，由昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，體重160～180 g。基礎(chǔ)飼料配方為每1 000 kg飼料含玉米粉440 kg，豆餅170 kg，大米粉150 kg，魚(yú)粉100 kg，麥麩100 kg，酵母粉20 kg，骨粉10 kg，食用鹽10 kg，分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，各20只。

高脂溶液的配制和灌胃：97%的豬油+2%的膽固醇+1%的膽酸鈉配成100%的高脂溶液，實(shí)驗(yàn)組大鼠灌胃量為1 g高脂溶液/100 g大鼠體重。每天早7：00-9：00灌胃，12周后隨機(jī)選取兩組各10只(造模期間有2只大鼠死亡)，處死大鼠，收集血清、肝臟組織檢測(cè)相應(yīng)指標(biāo)；肝臟HE染色，光鏡下觀察肝臟病理學(xué)改變。檢驗(yàn)NAFLD模型是否成功。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 19.0分析，計(jì)量資料采用(±s)表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料使用(%)表示，采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

肝臟切片HE染色：在本研究中，動(dòng)物模型建立完成后，分別對(duì)兩組大鼠的肝臟進(jìn)行切片HE染色觀察，在對(duì)照組，其切片HE染色后發(fā)現(xiàn)肝臟細(xì)胞沒(méi)有任何炎性反應(yīng)和脂肪顆粒沉積；而在灌胃組，每個(gè)大鼠的肝臟組織均存在一定程度的脂肪浸潤(rùn)和炎性反應(yīng)，嚴(yán)重者已經(jīng)達(dá)到了重度脂肪肝水平，見(jiàn)圖1。

肝功能：兩組肝功能指標(biāo)比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠AST、ALT以及AKP明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表1。

血脂：實(shí)驗(yàn)組CHOL、TG以及LDL明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表2。

大鼠肝重與體重比：實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組相比，肝臟重量與大鼠體重的百分比明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜ 0.05)，見(jiàn)圖2。

圖1 灌胃12周后大鼠肝臟切片HE染色(A與C是實(shí)驗(yàn)組大鼠，B與D是對(duì)照組大鼠)(20×20)

表1 灌胃12周后大鼠肝功能比較(±s，U/L)

表1 灌胃12周后大鼠肝功能比較(±s，U/L)

注：與空白對(duì)照組相比，?P＜0.05。

項(xiàng)目 對(duì)照組 實(shí)驗(yàn)組天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST) 233±44.7 537±232.6?丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT) 68±12.96 123±40.37?堿性磷酸酶(AKP) 47±6.844 155±44.82?

表2 灌胃12周后大鼠血脂指標(biāo)比較(±s，g/L)

表2 灌胃12周后大鼠血脂指標(biāo)比較(±s，g/L)

注：與對(duì)照組相比，?P＜0.05。

項(xiàng)目 空白組 實(shí)驗(yàn)組總膽固醇(CHOL) 1.13±0.16 1.63±0.35?甘油三酯(TG) 0.16±0.04 0.27±0.09?高密度脂蛋白膽固醇(HDL) 0.5±0.11 0.44±0.06低密度脂蛋白膽固醇(LDL) 0.33±0.09 0.58±0.12?

討論

目前國(guó)內(nèi)外常用的NAFLD動(dòng)物模型可分為4類：①基因改良模型；②食物、藥物、毒物誘導(dǎo)模型；③基因飲食復(fù)合模型；④中醫(yī)模型。常用模型動(dòng)物有大鼠、小鼠、家兔等。其中基因模型成本高；藥物及毒物誘導(dǎo)模型在發(fā)病機(jī)制、演變過(guò)程及組織病理形態(tài)等方面與人類脂肪肝差異大，且藥物毒性強(qiáng)，死亡率高；復(fù)合模型沒(méi)有統(tǒng)一的建模標(biāo)準(zhǔn)；中醫(yī)模型難度大[3]。而高脂飲食模型在病因、病理等方面與人類NAFLD發(fā)病機(jī)制最為相似。高脂飲食模型具有肥胖、高脂血癥等代謝綜合征表現(xiàn)，鏡下可見(jiàn)大細(xì)胞性脂肪變性、氣球樣變性等[4]。

本次研究采用高脂飲食灌胃的方法，成功構(gòu)建了NAFLD大鼠模型：①肝臟切片HE染色：在本研究中，動(dòng)物模型建立完成后，分別對(duì)兩組大鼠的肝臟進(jìn)行切片HE染色觀察。在對(duì)照組，其切片HE染色后發(fā)現(xiàn)肝臟細(xì)胞沒(méi)有任何炎性反應(yīng)和脂肪顆粒沉積，而在實(shí)驗(yàn)組，每個(gè)大鼠的肝臟組織均存在一定程度的脂肪浸潤(rùn)和炎性反應(yīng)，嚴(yán)重者已經(jīng)達(dá)到了重度脂肪肝水平；②實(shí)驗(yàn)組CHOL、TG以及LDL明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；③實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，肝臟重量與大鼠體重的百分比明顯升高，這可能與肝臟中的脂質(zhì)沉積有關(guān)。本研究的高脂溶液中加入少量膽酸鹽，可增加外源性膽固醇的吸收[5]。

圖2 大鼠處死時(shí)肝臟占體重百分比注：實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，P＜0.05。

綜上所述，高脂飲食建立NAFLD大鼠模型簡(jiǎn)單易行，成本低，方便臨床進(jìn)行NAFLD發(fā)病機(jī)制、藥物干預(yù)的研究。

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Discussion on nonalcoholic fatty liver disease animal model

Li Xiaobo,Li Yan(Corresponding author)
Health Care For Cadres,Kunhua Hospital Affiliated to Kunming University of Science and Technology 650031

Objective：To explore the establishment of nonalcoholic fatty liver disease(NAFLD)rat model.Methods：40 male SD rats were selected.They were divided into the blank control group(CON)and the high-fat diet group(HFD).After 12 weeks of high fat feeding,half of the rats were executed.Liver tissue was given HE staining.We measured the liver function and blood lipids.The weight and liver weight of rats were measured.We performed statistical analysis of all the data.Results：High fat diet can successfully establish rat NAFLD model.Conclusion：The establishment of NAFLD rat model with high fat diet was simple and easy,and the cost was low.It was convenient to study the pathogenesis and drug intervention of NAFLD.

Nonalcoholic fatty liver disease;Animal model;High fat diet

10.3969/j.issn.1007-614x.2017.10.1

云南省科技廳-昆明醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合專項(xiàng)(2011FB225)

Fund projectJoint special of Yunnan science and technology department-Kunming Medical University(2011FB225)