PHLPP2在人膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及意義

辛海濱梁俊君劉 偉*

（1 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)外科，山東 青島 266071；2 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，山東 青島 266071）

PHLPP2在人膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及意義

辛海濱1梁俊君1劉 偉2*

（1 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)外科，山東 青島 266071；2 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，山東 青島 266071）

目的研究PHLPP2在人正常腦組織以及腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)及其臨床意義。方法選取青島大學(xué)附屬醫(yī)院與安丘人民醫(yī)院神經(jīng)外科自2014年12月至2016年10月間手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)的人腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本56例，其中I級(jí)7例，Ⅱ級(jí)19例，Ⅲ級(jí)21例，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤9例。另取20例因腦創(chuàng)傷行內(nèi)減壓術(shù)患者的正常腦組織標(biāo)本作為對(duì)照。應(yīng)用RT-PCR、Western-blotting分別檢測(cè)各標(biāo)本中PHLPP2mRNA和PHLPP2蛋白的表達(dá)。結(jié)果RT-PCR和Western-blotting檢測(cè)結(jié)果顯示正常腦組織中PHLPP2 mRNA和PHLPP2蛋白表達(dá)最高，不同級(jí)別膠質(zhì)瘤組織PHLPP2 mRNA和PHLPP2蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且隨著腫瘤病理級(jí)別的增高，膠質(zhì)瘤組織中PHLPP2 mRNA和PHLPP2蛋白表達(dá)值降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論P(yáng)HLPP2在正常腦組織和不同級(jí)別的腦膠質(zhì)瘤組織中都有表達(dá)，其表達(dá)值與腫瘤的病理分級(jí)呈負(fù)相關(guān)，PHLPP2可能作為一個(gè)腫瘤抑制基因在膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展中起到關(guān)鍵性的作用。

神經(jīng)膠質(zhì)瘤；PHLPP2；基因表達(dá)

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的腫瘤，其發(fā)病率和病死率在原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤占首位[1]，隨著現(xiàn)代科學(xué)的飛速發(fā)展，人們對(duì)腦膠質(zhì)瘤的病因及發(fā)病機(jī)制的深入研究及手術(shù)切除為主要治療手段的綜合治療方法的不斷改進(jìn)，使本病的診斷和治療取得了很大的進(jìn)步。但是，將來(lái)基因靶向治療的途徑可能在膠質(zhì)瘤的治療中起關(guān)鍵作用。

PHLPP2屬于一個(gè)色氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶家族：PHLPP（PH domain leucine-rich repeats protein phosphatase），這個(gè)磷酸酶家族可以通過(guò)抑制AKT和PKC信號(hào)通路而對(duì)腫瘤起到抑制作用。PHLPP家族有兩個(gè)亞型：PHLPP1 和 PHLPP2。PHLPP2位于染色體16q22.3[2-3]。在各種癌癥中，編碼PHLPP1和PHLPP2的染色體基因經(jīng)常丟失。在乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝細(xì)胞癌和Wilms瘤的病例中也證實(shí)有PHLPP2的雜合性丟失[4-16]。PHLPP2在腫瘤的發(fā)病機(jī)制中的準(zhǔn)確作用還在研究中，一些研究表明，它能夠?qū)KT和PKC信號(hào)通路起到負(fù)調(diào)控的作用通過(guò)直接使AKT和PKC去磷酸化而起作用[4-7]?，F(xiàn)在我們對(duì)于PHLPP2在膠質(zhì)瘤中作用方面的信息了解很少。本實(shí)驗(yàn)就是要研究PHLPP2是否在膠質(zhì)瘤中出現(xiàn)，并且觀察PHLPP2的表達(dá)是否與腫瘤的惡性程度有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料和腫瘤樣本的采集：所有膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本取自青島大學(xué)附屬醫(yī)院和安丘人民醫(yī)院神經(jīng)外科手術(shù)切除并經(jīng)過(guò)病理證實(shí)的人腦膠質(zhì)瘤液氮凍存標(biāo)本 56 例。其中男24例，女32例，年齡5～75歲，所有患者術(shù)前都未進(jìn)行化療和放療。另取 20 例因腦創(chuàng)傷行內(nèi)減壓術(shù)患者的正常腦組織液氮凍存標(biāo)本作為對(duì)照。按照WHO（2000）標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理分級(jí)分成星形膠質(zhì)瘤Ⅰ～Ⅲ級(jí)和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[8]。其中Ⅰ級(jí) 7 例，Ⅱ級(jí) 19 例，Ⅲ級(jí) 21 例，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤 9 例。

1.2 材料與試劑：RT-PCR試劑盒購(gòu)自上海生工生物技術(shù)有限公司，引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。兔抗人PHLPP2多克隆抗體（1∶3000稀釋），鼠抗人β-actin多克隆抗體（1∶4000稀釋），羊抗鼠IgG二抗，羊抗兔IgG二抗購(gòu)自美國(guó)abcam公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 RT-PCR檢測(cè)：液氮下研磨粉碎組織塊，Trizol法提取RNA。AMV兩步法檢測(cè)PHLPP2 mRNA的表達(dá)。反應(yīng)體系：2×Taq酶12.5 μL，模板RNA 10 pg～1 μg，PHLPP1上游引物（10 μmol/L）：GACAAGACGCCAAGTCATCC 1 μL，PHLPP1下游引物（10 μmol/L）：GTTCCAGGCTACAACACGAGA 1 μL，DEPC處理的無(wú)菌雙蒸水至25 μL。（β-actin上游引物：CTGGGACGACATGGAGAAAA；下游引物：AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC）。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s（β-actin是60 ℃），72 ℃延伸50 s，共35個(gè)循環(huán)（β-actin是30個(gè)循環(huán)），72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

1.3.2 Western-blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)：組織塊稱重后液氮下研磨粉碎組織塊，然后加入500 μL RIPA組織裂解液，冰上放置30 min。裂解物4 ℃ 12000 g離心30 min，Bradford法測(cè)蛋白濃度，4×上樣緩沖液調(diào)整蛋白濃度至一致，8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，3%的BSA封閉2 h，兔抗人PHLPP2多克隆一抗（鼠抗人β-actin多克隆一抗）4 ℃孵育過(guò)夜，洗膜，羊抗兔IgG（羊抗鼠）二抗室溫孵育2 h，洗膜，曝光。RT-PCR和Western-bloting的檢測(cè)結(jié)果均以“PHLPP2的吸光度值/β-actin的吸光度值”表示。

2 結(jié) 果

2.1 PHLPP2 mRNA在非腫瘤腦組織和膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果見圖1顯示：非腫瘤腦組織中PHLPP2的表達(dá)量最高，隨著膠質(zhì)瘤級(jí)別的升高，PHLPP2的表達(dá)量呈遞減的趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖2。

圖 1 PHLPP2 mRNA在非腫瘤腦組織和不同級(jí)別膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)

圖2 統(tǒng)計(jì)結(jié)果

圖3 PHLPP2 蛋白質(zhì)在非腫瘤腦組織和不同級(jí)別膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)

圖4 統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.2 PHLPP2蛋白質(zhì)在非腫瘤腦組織和膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)。Westernblotting檢測(cè)結(jié)果見圖3顯示：PHLPP2蛋白在非腫瘤腦組織中的表達(dá)量最高，不同級(jí)別膠質(zhì)瘤組織中PHLPP2蛋白表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），且隨著膠質(zhì)瘤惡性程度的升高，PHLPP2蛋白表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖4。

3 討 論

PHLPP（PH domain leucine-rich repeats protein phosphatase）是一個(gè)色氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶家族，這個(gè)磷酸酶家族可以同過(guò)抑制AKT和PKC信號(hào)通路而對(duì)腫瘤起到抑制作用。PHLPP家族有兩個(gè)亞型：PHLPP1 和 PHLPP2。PHLPP2位于染色體16q22.3，細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)研究表明，PHLPP2在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和細(xì)胞膜中都有存在，而且它在很多細(xì)胞系中都有表達(dá)，包括大腦、肺、乳腺、前列腺和卵巢中[2-3]。

PHLPP抑制癌癥的作用最早被提及是從PHLPP的兩個(gè)亞型能夠負(fù)調(diào)控AKT和PKC開始的[2-3]。PHLPP1和PHLPP2能夠使細(xì)胞中的AKT去磷酸化從而導(dǎo)致AKT活性的降低。在各種癌癥中，編碼PHLPP1和PHLPP2的染色體基因經(jīng)常丟失。在乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝細(xì)胞癌和Wilms瘤的病例中也證實(shí)有PHLPP2的雜合性丟失[12-16]。2個(gè)亞型在眾多的細(xì)胞系檢測(cè)中都有表達(dá)，包括大腦、肺、乳腺、前列腺和卵巢等癌癥的細(xì)胞系[2-3]。同樣，這兩種亞型在人體的大部分組織中都有表達(dá)。PHLPP表達(dá)的缺失在腫瘤發(fā)展的早期可能對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是個(gè)有利條件，但是在腫瘤后期的轉(zhuǎn)移中它可能會(huì)有不同的作用，這是在對(duì)乳腺瘤的發(fā)生，轉(zhuǎn)移的研究中通過(guò)對(duì)AKT1和AKT2的研究中發(fā)現(xiàn)的[9-10]。最近研究表明，給大鼠服用硝酸鑭藥物后其體內(nèi)PHLPP2的水平增加23倍[17]。鑭化合物是已知的導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞增殖的化合物之一[18-19]，這些作用是否通過(guò)增加PHLPP2的水平來(lái)實(shí)現(xiàn)還有待于證實(shí)。鑒于藥物發(fā)現(xiàn)模式從特異性抑制劑到泛抑制劑，導(dǎo)致癌癥中多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路受牽連[20]。激活或增加PHLPP的小分子化合物的發(fā)現(xiàn)能導(dǎo)致多種癌癥相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的失活。

PHLPP2基因在膠質(zhì)瘤以及其他腫瘤發(fā)病機(jī)制中準(zhǔn)確的作用還不是很清楚，PHLPP2在膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)的意義和臨床含義還未被證實(shí)。PHLPP2可能作為一個(gè)腫瘤抑制基因在膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展中起作用，它通過(guò)對(duì)AKT和PKC的影響而起作用。但是，PHLPP2可能不是在膠質(zhì)瘤中唯一起作用的抑癌基因，因?yàn)槌薖HLPP2，16q22.3-16q23.1區(qū)域還有其他腫瘤抑制基因，如BCAR1[12]。

本實(shí)驗(yàn)研究表明，PHLPP2的mRNA和蛋白質(zhì)在非腫瘤腦組織中的表達(dá)比星形膠質(zhì)瘤組織以及膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)高，且隨著膠質(zhì)瘤病理級(jí)別的增高，其mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)逐漸降低。這個(gè)結(jié)果表明PHLPP2可能作為一個(gè)腫瘤抑制基因在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起到關(guān)鍵性的作用，所以它可能作為一個(gè)預(yù)測(cè)腫瘤嚴(yán)重程度以及判斷患者預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)。這樣我們就能從更多的介入點(diǎn)入手對(duì)腫瘤的發(fā)生進(jìn)行預(yù)防，也可以起到抑制腫瘤發(fā)展的目的。

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Expression and Significance of PHLPP2 in Human Gliomas

XIN Hai-bin1, LIANG Jun-jun1, LIU Wei2*
(1 Department of Neurosurgery, Qingdao University Medical College, Qingdao 266071, China; 2 Department of Neurosurgery, Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266071, China)

ObjectiveTo investigate the expression of PHLPP2 in the tumor tissues of patients with gliomas and evaluate its clinical significance.MethodsFifty-six patients with brain gliomas(7 with grade I,19 grade Ⅱ,21 grade Ⅲ and 9 with glioblastoma)performed surgical excision in Our hospitals from December 2014 to October 2016 were chosen and 20 case of normal brain tissues from patients performed decompression operation resulting from cerebral hernia were selected as the controls in our experiment.RT-PCR and Western-blotting were used to detect the mRNA and protein expressions of PHLPP2.ResultsThe results investigated by RT-PCR and Westem-blotting were consistent, the highest expression of PHLPP2 was in the normal brain tissues. The expression value between different grades of tumors was obviously significant and decreased in a grade-dependent manner(P<0.05).ConclusionThe mRNA and protein expressions of PHLPP2 are noted with positive correlation to the pathological grades of the gliomas, indicating that PHLPP2 may play an important role in the generation and development of gliomas.

Neuroglioma; PHLPP2; Gene expression

R739.41

B

1671-8194（2017）12-0034-03

*通訊作者