TIMP—4在膀胱癌及癌旁正常膀胱組織中的表達(dá)

董維平++嚴(yán)奉奇++李霞++許秀麗++袁建林++武國(guó)軍

[摘要] 目的 探討基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-4（TIMP-4）在膀胱癌組織與癌旁組織中的表達(dá)及其臨床意義。 方法 收集2015年6月～2016年9月西京醫(yī)院泌尿外科152例膀胱尿路上皮癌患者手術(shù)標(biāo)本的癌組織及其癌旁組織，利用免疫組織化學(xué)染色法分別對(duì)其進(jìn)行染色，并在顯微鏡下觀察組織切片染色情況，運(yùn)用半定量法分析膀胱癌組織及癌旁組織中TIMP-4蛋白的表達(dá)情況。 結(jié)果 TIMP-4蛋白免疫反應(yīng)物主要沉積于細(xì)胞質(zhì)。膀胱癌組織與癌旁組織中TIMP-4蛋白染色陽(yáng)性率分別為26.97%和84.21%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。低級(jí)別膀胱乳頭狀尿路上皮癌與高級(jí)別膀胱乳頭狀尿路上皮癌組織中TIMP-4蛋白染色陽(yáng)性率分別為38.71%和18.89%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 TIMP-4蛋白在膀胱癌組織內(nèi)的表達(dá)較癌旁組織表達(dá)低，且其表達(dá)量與膀胱癌組織學(xué)分級(jí)相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-4；膀胱尿路上皮癌；免疫組織化學(xué)染色

[中圖分類(lèi)號(hào)] R737 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）04（c）-0077-04

[Abstract] Objective To investigate the expression of mammalian tissue inhibitor of metalloproteinase-4 （TIMP-4） in bladder urothelial cell carcinoma and normal tissue adjacent to carcinoma and its clinical significance. Methods Surgical specimens of cancer tissues and normal tissue adjacent to carcinoma of 152 cases diagnosed as bladder urothelial cell carcinoma were collected from June 2015 to September 2016 in Department of Urology of Xijing Hospital. The immunohistochemical staining was performed and the semi-quantitative scoring system was used to evaluate the extent and intensity of the staining. The expression of mammalian TIMP-4 in bladder urothelial cell carcinoma and normal tissue adjacent to carcinoma were analyzed by using semi-quantitative method. Results Immunohistochemistry showed that TIMP-4 protein positive was staining in the cytoplasm of normal tissues and bladder carcinoma. The positive expression rate of TIMP-4 in bladder urothelial cell carcinoma and normal tissue adjacent to carcinoma was 26.97% and 84.21% respectively， with statistical difference （P < 0.05）. The positive expression rate of TIMP-4 in low-grade bladder papillary urothelial carcinoma and high-grade bladder papillary urothelial carcinoma was 38.71% and 18.89% respectively， with statistical difference （P < 0.05）. Conclusion TIMP-4 expression level in bladder urothelial cell carcinoma tissue is lower than that in normal tissue adjacent to carcinoma. The expression degree in bladder urothelial cell carcinoma is associated with histopathologic grade.

[Key words] Mammalian tissue inhibitor of metalloproteinase-4； Bladder urothelial cell carcinoma； Immunohistochemistry

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)發(fā)病率最高的惡性病變，其主要組織細(xì)胞學(xué)來(lái)源為尿路上皮細(xì)胞，常被稱(chēng)為膀胱尿路上皮癌（BUCC）或移行細(xì)胞癌（TCC），占到膀胱癌的90%以上。膀胱癌顯著特點(diǎn)是腫瘤具有多發(fā)病灶和術(shù)后高復(fù)發(fā)率。近年來(lái)膀胱癌發(fā)病率、復(fù)發(fā)率、死亡率均呈逐年增加的趨勢(shì)，應(yīng)引起高度重視[1]。膀胱癌具有多中心、易復(fù)發(fā)、易侵襲、易耐藥等生物學(xué)特性，10%～30%的非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌（NMIBC）進(jìn)展為肌層浸潤(rùn)性腫瘤，高級(jí)別的NMIBC更容易惡化，將近75%的高級(jí)別NMIBC在診斷后10年內(nèi)復(fù)發(fā)、進(jìn)展或死亡[2]，而對(duì)于膀胱癌復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)的機(jī)制研究仍不明確。組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑（TIMP）是體內(nèi)細(xì)胞分泌的一類(lèi)蛋白酶抑制劑，它們可以與基質(zhì)金屬蛋白酶原結(jié)合，并抑制其激活，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲及凋亡等過(guò)程[3]。TIMP-4是TIMP家族新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)成員，其在宮頸癌、肝癌、胃癌等腫瘤內(nèi)發(fā)現(xiàn)異常表達(dá)現(xiàn)象，并提示該蛋白與腫瘤的遷移、侵襲等生物學(xué)行為密切相關(guān)[4-6]。然而，關(guān)于TIMP-4在膀胱癌內(nèi)的表達(dá)情況及其表達(dá)與膀胱癌的臨床關(guān)系還未見(jiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)TIMP-4蛋白在膀胱癌組織與癌旁組織內(nèi)的表達(dá)情況，并分析其表達(dá)與膀胱癌不同組織學(xué)分級(jí)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

收集2015年6月～2016年9月于第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院泌尿外科手術(shù)治療的患者152例，均為經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切手術(shù)治療的非肌層浸潤(rùn)性膀胱尿路上皮癌，獲取腫瘤組織病理標(biāo)本和癌旁正常膀胱組織標(biāo)本，年齡51～72歲。根據(jù)WHO 2004非肌層浸潤(rùn)性膀胱尿路上皮癌分級(jí)方法，其中組織學(xué)分級(jí)為低級(jí)別乳頭狀尿路上皮癌62例，高級(jí)別乳頭狀尿路上皮癌90例，均為初診初治，無(wú)術(shù)前抗腫瘤史。152例患者的腫瘤標(biāo)本作為實(shí)驗(yàn)組，癌旁正常膀胱組織作為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)中所使用的所有人體組織標(biāo)本均經(jīng)過(guò)第四軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥物臨床試驗(yàn)倫理委員會(huì)審查。

1.2 主要試劑

兔抗TIMP-4多克隆抗體（美國(guó)Sigma公司）；免疫組化試劑盒；生物素標(biāo)記的羊抗兔抗體；DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

免疫組織化學(xué)SP法：制作石蠟切片，選片。組織切片烤箱內(nèi)烘烤30 min；用二甲苯浸泡脫蠟3次。自100%到70%梯度濃度的乙醇溶液依次浸泡5 min，用PBS洗片3 min×3次。滅酶活性：用0.3%甲醇-H2O2進(jìn)行內(nèi)源性過(guò)氧化物酶滅活，用PBS洗片3 min×3次。抗原修復(fù)：切片用濃度0.01 mol/L、pH 6.0的枸櫞酸緩沖液煮沸10 min，自然冷卻后多次用PBS洗片3 min×3次。血清封閉：室溫環(huán)境下覆加正常山羊血清封片20 min?？贵w封閉：滴加適當(dāng)濃度的TIMP-4一抗，4℃冰箱中過(guò)夜，PBS洗片3 min×5次。滴加稀釋后的二抗（生物素標(biāo)記的羊抗兔抗體），37℃孵育1 h，PBS洗片3 min×5次。SP封閉：室溫滴加SP液孵育1 h，PBS洗片3 min×5次。后期處理：滴加臨時(shí)配制的3，3-二氨基聯(lián)苯胺四鹽鹽酸（DAB）顯色液，約5 min觀察顯色程度，適時(shí)用PBS洗片；蘇木素液染核后用乙醇70%～100%的濃度梯度依次脫水；二甲苯浸泡性切片透明處理；37℃烤箱干燥封片；電子顯微鏡下拍片保存。

1.4 評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)

TIMP-4蛋白陽(yáng)性染色主要表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)中棕黃色顆粒沉著。每例標(biāo)本選取6個(gè)典型視野進(jìn)行采集（10×40），計(jì)數(shù)染色細(xì)胞，用半定量分析法進(jìn)行分析。按染色程度劃分：無(wú)染色（0分）；淺染色（1分）；中等染色（2分）；濃染色（3分）。按染色細(xì)胞比例劃分：<10%（0分）；11%～25%（1分）；26%～50%（2分）；51%～75%（3分）；>75%（4分）。最終陽(yáng)性染色分值為染色程度分值與染色細(xì)胞百分比的乘積，共分為陰性（-）、弱陽(yáng)性（+）、陽(yáng)性（++）、強(qiáng)陽(yáng)性（+++）四個(gè)層次，分別對(duì)應(yīng)：0～1分、2～4分、5～8分和9～12分。“陽(yáng)性表達(dá)率”計(jì)算公式為[（+）+（++）+（+++）]例數(shù)/總例數(shù)×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TIMP-4蛋白在膀胱癌組織及癌旁正常膀胱組織中的表達(dá)

實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組標(biāo)本中TIMP-4蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），即TIMP-4蛋白在癌旁正常膀胱組織中的陽(yáng)性表達(dá)率高于膀胱癌組織（圖1、表1）。

2.2 膀胱癌不同組織學(xué)分級(jí)中TIMP-4蛋白的表達(dá)

膀胱癌不同組織學(xué)分級(jí)中TIMP-4蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），TIMP-4蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率在高級(jí)別乳頭狀尿路上皮癌中低于低級(jí)別乳頭狀尿路上皮癌（圖2、表2）。

3 討論

膀胱癌的發(fā)病率居全身惡性腫瘤的第九位，全球范圍內(nèi)每年新發(fā)病例達(dá)38萬(wàn)例，而死亡病例高達(dá)15萬(wàn)例[7]。在我國(guó)，膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，占泌尿系惡性腫瘤的首位。男性膀胱癌發(fā)病率位居全身惡性腫瘤的第七位，女性排在第十位以后[8]。膀胱癌的預(yù)后與腫瘤的分級(jí)密切相關(guān)，其中絕大多數(shù)膀胱癌患者預(yù)后不良主要由于膀胱癌的轉(zhuǎn)移，膀胱癌診治后5年內(nèi)復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)變化從31%到78%，進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)變化從0.8%到45%[9]。然而腫瘤的轉(zhuǎn)移過(guò)程是一個(gè)多因素、多條件影響的復(fù)雜過(guò)程[10]。其中遷移、侵襲在腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過(guò)程中至關(guān)重要，然而腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲也是在多因素、多基因共同作用下完成的[11]，因此對(duì)影響腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲的基因研究顯得尤為重要。

研究顯示，MMPs家族在腫瘤細(xì)胞的發(fā)展和侵襲過(guò)程中扮演著重要的角色[12]。MMPs是一類(lèi)活性依賴(lài)于鋅離子和鈣離子的蛋白水解酶，能有效降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，并且在破壞組織結(jié)構(gòu)的同時(shí)能促進(jìn)腫瘤組織血管的形成[13]。而TIMP是抑制MMPs家族的一種重要酶類(lèi)，在影響腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲等過(guò)程中起重要作用[14]。在正常情況下，MMPs與TIMP家族之間處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，研究顯示，當(dāng)腫瘤細(xì)胞內(nèi)的TIMP與MMPs失去平衡，TIMP影響腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移[15]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，TIMPs家族成員有4個(gè)（TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4）。TIMP-4是Greene等[16]在1996年采用已表達(dá)序列標(biāo)志（EST）測(cè)定方法研究MMP抑制物TIMP時(shí)發(fā)現(xiàn)，屬于TIMP家族成員的一種，按照發(fā)現(xiàn)順序被命名為T(mén)IMP-4。TIMP-4其分子量為22 kD，含有224個(gè)氨基酸，具有其他TIMPs的主要特征。作為T(mén)IMP家族新發(fā)現(xiàn)成員，通過(guò)免疫組化、RT-PCR及原位雜交技術(shù)等方法研究發(fā)現(xiàn)，其在宮頸癌、胰腺癌、前列腺癌等多種腫瘤組織內(nèi)低表達(dá)[17-19]。

研究發(fā)現(xiàn)，TIMPs作為MMP特異性抑制因子，抑制MMP對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的降解，從而抑制腫瘤細(xì)胞的遷移侵襲。Kim等[20]研究發(fā)現(xiàn)，TIMP-1、TIMP-2能夠抑制血管生成素誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞出芽，說(shuō)明TIMPs在抑制腫瘤新生血管形成中起重要作用。TIMP是一組抑制MMPs活性的低分子蛋白酶類(lèi)，目前雖然關(guān)于TIMP的作用機(jī)制研究還不多，但是現(xiàn)有研究表明，TIMP-4可以抑制多種MMP的活性，包括MMP-2、MMP-9和MMP-1等，通過(guò)促進(jìn)多種MMP蛋白的降解而抑制細(xì)胞的遷移侵襲[21]。然而關(guān)于TIMP-4在膀胱癌內(nèi)的表達(dá)情況還沒(méi)有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組織化學(xué)染色方法對(duì)膀胱癌組織及癌旁組織標(biāo)本進(jìn)行TIMP-4蛋白表達(dá)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)TIMP-4染色陽(yáng)性率在膀胱癌組織與癌旁組織中分別為26.97%和84.21%，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），說(shuō)明在膀胱癌組織內(nèi)的陽(yáng)性表達(dá)明顯低于其在癌旁組織內(nèi)的表達(dá)。進(jìn)一步通過(guò)對(duì)不同組織學(xué)分級(jí)的膀胱癌組織染色分級(jí)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，TIMP-4蛋白表達(dá)水平與膀胱癌的組織學(xué)分級(jí)密切相關(guān)，其在高級(jí)別乳頭狀尿路上皮癌和低級(jí)別乳頭狀尿路上皮癌中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為18.89%和38.71%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），說(shuō)明TIMP-4蛋白的表達(dá)水平與膀胱癌的惡性程度密切相關(guān)。

綜上所述，TIMP-4作為一種抑癌基因，其在多種系統(tǒng)腫瘤中基因表達(dá)缺失，與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、進(jìn)展、遷移侵襲有密切聯(lián)系。本研究揭示了TIMP-4蛋白在膀胱癌內(nèi)低表達(dá)，且與膀胱癌的組織學(xué)分級(jí)密切相關(guān)，為對(duì)膀胱癌發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制研究提供了新思路，同時(shí)也為T(mén)IMP-4在膀胱癌內(nèi)作用機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2017-01-02 本文編輯：李亞聰）