葉酸/β-環(huán)糊精修飾的磁性納米藥物載體的合成及表征

洪沙沙,李波,周葉紅,梁文婷,雙少敏*

(1.山西大學 化學化工學院,山西 太原 030006；2.山西大學 環(huán)境科學研究所,山西 太原 030006)

葉酸/β-環(huán)糊精修飾的磁性納米藥物載體的合成及表征

洪沙沙1,李波1,周葉紅2,梁文婷2,雙少敏1*

(1.山西大學 化學化工學院,山西 太原 030006；2.山西大學 環(huán)境科學研究所,山西 太原 030006)

采用共沉淀法在水相中合成表面修飾氨基的磁性納米粒子(MNPs),進一步在其表面接枝葉酸(FA)修飾的β-環(huán)糊精衍生物(β-CDs),制得一種新型藥物載體材料(FA-β-CDs-MNPs),并通過核磁共振光譜(1H NMR)、紅外光譜(FTIR)進行了結(jié)構(gòu)表征。透射電鏡(TEM)、X-射線衍射(XRD)、磁性能(VSM)分析表明:該納米復合材料的尺寸為16nm左右,近似圓形且分散性能良好,用振動磁強計測得其具有超順磁性,飽和磁化率為58 emu/g,是潛在的腫瘤細胞靶向型藥物載體材料。

磁性納米;葉酸;β-環(huán)糊精;靶向藥物載體

0 引言

惡性腫瘤是影響人類健康的主要疾病之一,傳統(tǒng)的放療和化療等癌癥治療方法,缺乏選擇性,經(jīng)常給患者帶來腹瀉和毛發(fā)脫落等嚴重的副作用[1-2]。所以如何準確靶向給藥癌細胞是癌癥檢測和治療的突破口。磁性納米材料由于在外磁場作用下具有靶向性、小尺寸效應(yīng)、生物相容性較好、價格低廉等優(yōu)點,廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學監(jiān)測、藥物靶向、基因治療以及生物分離等方面[3]。其中磁靶向藥物載體可將藥物送到特定病變部位,有效減少藥物對正常組織的毒副作用,是近年來藥物輸送系統(tǒng)研究的熱點[4-6]。

葉酸(FA)又稱蝶谷氨酸,是人體所必需的維生素B。葉酸受體(FR)在大多數(shù)腫瘤細胞中高表達,而在正常組織細胞中低表達[7]。將葉酸與磁性納米材料進行偶聯(lián),在外加磁場下,將材料高度富集在腫瘤組織中,同時利用葉酸受體表達的差異性,實現(xiàn)靶向多種腫瘤細胞的目的[8-9]。以葉酸與磁性四氧化三鐵的納米復合物為載體,已成功將阿霉素[9]、順鉑[10]、紫杉醇[11]等抗癌藥物有效輸送到腫瘤細胞。環(huán)糊精及其衍生物是優(yōu)良的藥物載體,可與尺寸適宜的小分子藥物形成包合物,提高藥物的穩(wěn)定性,減少藥物的不良氣味,增加藥物的溶解度及利用度[12-13]。本文結(jié)合β-環(huán)糊精衍生物作為藥物包合材料的優(yōu)勢,分別與葉酸及Fe3O4磁性納米材料共價偶聯(lián),設(shè)計合成了基于磁性納米材料用于治療葉酸受體表達陽性腫瘤的藥物輸送系統(tǒng),并運用多種分析手段對其進行了結(jié)構(gòu)和性能表征。

1 實驗部分

1.1 主要試劑和儀器

試劑:氯化亞鐵、三氯化鐵、體積分數(shù)為25%氨水、3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)、葉酸(用NaHCO3處理成葉酸鈉)、β-環(huán)糊精(經(jīng)沸水重結(jié)晶提純兩次)、N,N-二甲基甲酰胺(經(jīng)分子篩除水)、檸檬酸、氫氧化鈉、碳化二亞胺,所用化學試劑均為分析純,實驗用水為二次蒸餾水。

儀器:紅外光譜儀(TenSorⅡ,德國Bruker optics公司);磁力電熱套攪拌器(SZCL-3A型,杭州瑞佳儀器有限公司);核磁共振譜儀(AVANCE-300 MHz,德國Bruker公司);酸度計(FE20,上海梅特勒-托利多儀器有限公司);透射電子顯微鏡(JEM-1011,日本電子公司);多功能振動樣品磁強計系統(tǒng)(Versa Lab,美國 Quantum Design 公司); X-射線粉末衍射儀(D/max-2500,日本理學公司);真空干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司);機械攪拌器(JJ-1,北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)修飾的四氧化三鐵納米粒子(APTES-MNPs)的合成

合成MNPs:采用水相共沉淀法[14],將200 mL二次水加入到三口圓底燒瓶中,加熱至90℃時,加入1.54 g氯化亞鐵和2.2 g三氯化鐵,氮氣保護下機械攪拌溶解,緩慢滴加氨水,調(diào)節(jié)pH到9左右。繼續(xù)攪拌40 min后,自然冷卻至室溫,磁分離,用二次蒸餾水、乙醇依次洗3次,真空干燥15 h,得到產(chǎn)物MNPs,密封保存。

合成APTES-MNPs:稱取150 mg上述步驟所得MNPs,加入裝有300 mL乙醇與2 mL水的500 mL的三口圓底燒瓶中超聲分散,氮氣保護下加入80 μL APTES,機械攪拌6 h后倒入燒杯中,磁分離,用乙醇清洗3次,真空干燥12 h,得到產(chǎn)物APTES-MNPs。

1.2.2 葉酸修飾的β-環(huán)糊精衍生物(FA-β-CD-CA)的合成

合成檸檬酸修飾的β-環(huán)糊精(CA-β-CD):在文獻[15]基礎(chǔ)上改進方法,分別稱取3.0 g β-CD與1.02 g檸檬酸置于坩堝中,加入1.8 mL二次水,用玻璃棒不斷攪拌,置于100℃烘箱中加熱,反應(yīng)固化2 h,取出用異丙醇清洗3次,抽濾。真空干燥20 h,得到產(chǎn)物CA-β-CD,密封保存。

合成對甲苯磺酰氯修飾的環(huán)糊精(OTS-β-CD-CA):稱取5.0 g上述步驟合成的β-環(huán)糊精衍生物,溶于100 mL 0.4 mol/L 氫氧化鈉溶液中,緩慢加入3.36 g對甲苯磺酰氯,冰浴條件下攪拌反應(yīng)5 h,抽濾,用0.1 mol/L 鹽酸將濾液的pH調(diào)至4,放入4℃冰箱中冷藏30 min,產(chǎn)生大量白色沉淀,抽濾,用丙酮清洗3次,真空干燥24 h,得到產(chǎn)物OTS-β-CD-CA。

合成FA-β-CD-CA:稱取2.0 g葉酸鈉,用60 mL N,N-二甲基甲酰胺溶解于100 mL圓底燒瓶中。在95℃油浴中、氮氣保護下、避光反應(yīng),待固體溶解后,加入3.0 g OTS-β-CD-CA,繼續(xù)磁力攪拌40 h。反應(yīng)結(jié)束后,抽濾,除去未反應(yīng)完的葉酸鈉。60℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸干,用少量二次水再次溶解,滴入丙酮,待產(chǎn)物析出,抽濾,用丙酮洗滌多次,真空干燥12 h。將所得固體用二次水溶解后用截留分子量為1 000的透析袋透析,干燥后得到產(chǎn)物FA-β-CD-CA。

1.2.3 葉酸/β-環(huán)糊精修飾的磁性納米藥物載體的合成

稱取0.1 g APTES-MNPs,溶解于2 mL磷酸鹽緩沖溶液(pH=6.0)中,再加入1 mL碳化二亞胺溶液(0.025 g/mL,溶于磷酸鹽緩沖溶液),待完全溶解后,加入0.05 g FA-β-CD-CA,超聲2 h。反應(yīng)結(jié)束后,依次用二次水、乙醇清洗產(chǎn)物多次,磁分離,真空干燥12 h,得到最終產(chǎn)物FA-β-CD-MNPs[15]。

2 結(jié)果與討論

2.1 FA-β-CD-MNPs的合成路線

FA-β-CD-MNPs主要由3個步驟制得。首先,通過水相共沉淀法合成MNPs,在其表面修飾上帶有氨基的硅殼,然后利用葉酸的羧基與β-CD-CA上的羥基共價偶聯(lián),最后將β-環(huán)糊精衍生物接枝到磁性納米材料表面。合成路線如圖1所示。

Fig.1 Synthesis routes of FA-β-CD-MNPs圖1 葉酸/β-環(huán)糊精修飾的磁性納米藥物載體的合成路線

2.2 形貌分析

采用透射電鏡(TEM)和動態(tài)光散射(DLS)觀察所制備的磁性納米復合材料的形貌和尺寸,圖2a、2b和2c中分別為MNPs、APTES-MNPs以及FA-β-CD-MNPs的TEM圖。可以看到三種粒子分布均勻、形貌近似為球形。由于MNPs粒徑很小,具有較高的表面能,易發(fā)生團聚。而經(jīng)過APTES和FA-β-CD修飾后,降低了磁性納米粒子之間的團聚現(xiàn)象。分別從圖中隨機選取40個粒子進行計算,得出MNPs、APTES-MNPs以及 FA-β-CD-MNPs的平均粒徑分別為(14.7±1.4) nm、(15.6±1.3) nm、(16.4±1.1) nm。三種納米粒子粒徑相差不大,粒徑均小于20 nm,這可能是由于葉酸和APTES均為小分子,而環(huán)糊精直徑約為1 nm[15]。圖2d、2e和2f分別為MNPs、APTES-MNPs以及FA-β-CD-MNPs的流體力學直徑分布圖,其平均粒徑分別為58.7 nm、74.2 nm、82.6 nm。由于DLS測得的是分散在溶液中的納米粒子的平均粒徑,與TEM直接測量固體粉末狀態(tài)下單個粒子的粒徑有所不同,會造成粒子大小的差異[16]。

Fig.2 TEM images of MNPs(a), APTES-MNPs(b) and FA-β-CD-MNPs(c) Hydrodynamic diameter distributions for MNPs (d) APTES-MNPs(e) and FA-β-CD-MNPs(f)圖2 MNPs(a), APTES-MNPs(b)和FA-β-CD-MNPs(c)的透射電鏡圖MNPs (a), APTES-MNPs(e)和β-CD-MNPs (b)的流體力學粒徑分布圖

2.3 紅外光譜分析

圖3分別給出了FA、FA-β-CD-CA和FA-β-CD-MNPs的紅外吸收光譜圖。FA-β-CD-CA的紅外譜圖 與FA紅外圖譜比較,多出了 1 020 cm-1和1 100 cm-1兩處β-CD的R-1,4-鍵的骨架振動和C—O—C振動的特征峰[16],該特征峰表明:葉酸與β-CD成功鍵接。在FA-β-CD-MNPs的紅外圖譜中, 553 cm-1和604 cm-1處的吸收峰為MNPs中Fe-O四面體的特征吸收,證實了β-環(huán)糊精衍生物成功修飾到磁性納米粒子表面。

2.4 磁性能分析

室溫下采用VSM測試MNPs、APTES-MNPs以及FA-β-CD-MNPs的磁性能,磁滯曲線如圖4所示?？梢钥闯?所合成的三種納米材料均未有磁滯環(huán)出現(xiàn),具有超順磁性。當磁性粒子直徑小于20 nm的時候,粒子的矯頑力會變得很低甚至為零,此時經(jīng)磁化的粒子布朗熱運動呈現(xiàn)出來,當外加磁場消失后,粒子無序排列,立刻喪失磁性,出現(xiàn)超順磁特性,這與TEM表征的粒子粒徑相符合。MNPs、APTES-MNPs以及FA-β-CD-MNPs的飽和磁化率分別為68 emu/g、 62 emu/g和58 emu/g,磁性能降低不是很大,仍可應(yīng)用于生物醫(yī)學領(lǐng)域。

Fig.3 FT-IR spectra of the samples圖3 樣品的紅外光譜圖

Fig.4 Magnetization curves of the samples圖4 樣品的磁滯曲線圖

2.5 X-射線衍射分析

圖5為MNPs和最終產(chǎn)物FA-β-CDs-MNPs的粉末XRD圖譜。從圖中可以看出樣品在30.21°,35.56°,43.43°,53.65°,57.30°,62.84°處的特征峰和JCPDS(No.85-1436)標準圖譜中的Fe3O4的特征衍射峰位一致,分別對應(yīng)于四氧化三鐵面心立方的(220)、(311)、(400)、(422)、 (511)以及(440)衍射峰面。除上述特征峰外,譜圖中未見其他物質(zhì)的衍射峰(如針鐵礦(110) (2θ=21.228°)和赤鐵礦(104) (2θ=33.158°)),證明產(chǎn)物復合材料由Fe3O4和FA-β-CDs組成。

Fig.5 XRD patterns of (a) pure MNPs and (b) FA-β-CD-CA圖5 MNPs (a) 和FA-β-CD-CA (b) 的X-射線衍射圖

2.6 核磁表征分析

圖6為OTS-β-CD-CA的1H NMR譜圖(溶劑為D2O),在δ=7.66 ppm和δ=7.47 ppm處出現(xiàn)兩個對稱峰,是對甲苯磺?；江h(huán)處的質(zhì)子峰,δ=2.40 ppm處是磺酰基的甲基質(zhì)子峰,δ=3.58 ppm和δ=3.85 ppm處為β-環(huán)糊精的母體特征峰。以上數(shù)據(jù)表明,對甲苯磺?；晒π揎椀溅?環(huán)糊精上。圖7為FA-β-CD-CA的1H NMR譜圖(D2O),δ=4.8 ppm處為溶劑峰,OTS-β-CD中磺?；讦?7.66 ppm和δ=7.47 ppm處的兩個對稱峰消失,在δ=8.12 ppm處出現(xiàn)單峰,為葉酸中蝶啶環(huán)上的質(zhì)子峰,δ=7.84 ppm和δ=7.58 ppm處為葉酸中苯環(huán)上質(zhì)子峰,同時在δ=2.13 ppm、δ=2.32 ppm和δ=2.63 ppm高場處也出現(xiàn)了葉酸特有的質(zhì)子峰,δ=3.49 ppm、δ=3.82 ppm處為β-環(huán)糊精的母體特征峰,該圖譜顯示葉酸成功修飾到β-環(huán)糊精上。

Fig.6 1H NMR spectra of OTS-β-CD-CA in D2O at 25℃圖6 OTS-β-CD-CA在25℃ D2O中的1H NMR譜圖

Fig.7 1H NMR spectra of FA-β-CD-CA in D2O at 25℃圖7 FA-β-CD-CA在25℃ D2O中的1H NMR譜圖

2.7 細胞成像實驗研究

在細胞實驗中,將定量濃度的FA-β-CDs-MNPs、FA-β-CDs-MNPs/FITC、FA-β-CDs-MNPs/DOX和DOX分別加入食管鱗癌細胞(Kyse510)中,孵育30 min,隨后用pH為7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)進行清洗,而后通過FV1000激光共聚焦掃描顯微鏡(CLSM)成像。如圖8所示, 用空白的藥物載體處理過的細胞不發(fā)熒光,標記5(6)-異硫氰酸熒光素(FITC)的藥物載體處理過的細胞有很強的綠色熒光,表明載體被食道癌細胞攝取,并留在細胞質(zhì)中。對比FA-β-CDs-MNPs/DOX和DOX處理過的細胞成像,可以明顯觀察到DOX主要分布在細胞質(zhì)中,有少量從載體中釋放的游離的DOX進入到細胞核中。這些數(shù)據(jù)表明,FA-β-CDs-MNPs可以有效地將DOX運輸?shù)桨┘毎麅?nèi)部。

Fig.8 CLSM images of (a)esophageal squamous cell carcinoma cells(Kyse510) incubated with FA-β-CDs-MNPs、FA-β-CDs-MNPs/FITC、FA-β-CDs-MNPs/DOX and DOX at 37℃ for 30 min (upside：dark field image; underside：bright filed)圖8 食管鱗癌細胞(Kyse510)分別加入FA-β-CDs-MNPs、FA-β-CDs-MNPs/FITC、FA-β-CDs-MNPs/DOX和DOX孵育30 min后的激光共聚焦圖像(上：暗場；下：明場)

3 結(jié)論

通過水相共沉淀法合成出Fe3O4磁性納米粒子(MNPs),平均粒徑為14 nm左右,具有較高的表面能,但易發(fā)生團聚;在其表面包覆上葉酸修飾的β-環(huán)糊精衍生物后,單分散性較好,且磁性能影響不大,保持了較好的超順磁性。葉酸在該納米粒子表面的成功修飾,使得該磁性納米復合材料具有潛在的腫瘤靶向性,同時β-環(huán)糊精衍生物內(nèi)疏水,外親水的結(jié)構(gòu)特性進一步增加了其載藥能力和生物相容性。本研究表明該磁性納米復合材料在靶向藥物輸送和生物成像方面有潛在的應(yīng)用前景。

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Preparation and Characterization of Folic acid/β-Cyclodextrins Modified Magnetic Nanoparticles Drug Carriers

HONG Shasha1,LI Bo1,ZHOU Yehong2,LIANG Wenting2,SHUANG Shaomin1*

(1.SchoolofChemistryandChemicalEngineering,ShanxiUniversity,Taiyuan030006,China；2.InstituteofEnvironmentalScience,ShanxiUniversity,Taiyuan030006,China)

A novel MNPs-based nanoparticle drug delivery system (DDS) was assembled and characterized.MNPs were prepared according to chemical co-precipitation method. After amination with amino silane coupling agent, folic acid modified β-CDs were grafted onto the surface of magnetic nanoparticles. The morphology and properties of obtained nanoparticles were characterized by nuclear magnetic resonance (1H NMR), Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR), transmission electron microscopy (TEM), X-ray powder diffraction (XRD), and vibrating sample magnetometer (VSM).TEM images showed that the size of nanoparticles was about 16 nm. The FA-β-CD-MNPs exhibited relatively high saturation magnetization. These results suggested the newly developed magnetic hybrid nanomaterial has potential applications as the drug carrier.

magnetic nanoparticles;folic acid;β-Cyclodextrins;targeted delivery

10.13451/j.cnki.shanxi.univ(nat.sci.).2017.01.018

2016-07-27；

2016-09-26

國家自然科學基金(21475080);山西省回國留學人員科研資助項目(2013-重點1)

洪沙沙(1992-)，女，河南商丘人，碩士研究生，主要從事靶向藥物載體的研究。

*通信作者：雙少敏(SHUANG Shaomin),E-mail:smshuang@sxu.edu.cn

O621

A

0253-2395(2017)01-0130-07