p53、Ki- 67、PCNA的表達與食管鱗癌放療近期療效及預后的關系

楊艷，韋淑貞，杜云翔,張闖

(1.蚌埠醫(yī)學院，安徽 蚌埠 233000； 2.蚌埠醫(yī)學院附屬解放軍82醫(yī)院 腫瘤中心，江蘇 淮安 223001)

·論 著·

p53、Ki- 67、PCNA的表達與食管鱗癌放療近期療效及預后的關系

楊艷1,2，韋淑貞2，杜云翔2,張闖2

(1.蚌埠醫(yī)學院，安徽 蚌埠 233000； 2.蚌埠醫(yī)學院附屬解放軍82醫(yī)院 腫瘤中心，江蘇 淮安 223001)

目的：探討食管鱗癌組織中p53、Ki- 67及增殖細胞核抗原(PCNA)的表達與食管癌患者放療近期療效及預后的關系。方法：收集接受放療的食管癌患者83例，采用免疫組化方法檢測活檢癌組織中p53、Ki- 67及PCNA的表達，并分析其與臨床病理特征、放療療效和預后的關系。結果：p53、Ki- 67及PCNA在食管鱗癌中高表達率分別為57.8%、72.3%、67.5%。p53、Ki- 67及PCNA表達與性別、年齡、侵犯部位、腫瘤長度等各臨床病理因素無關(P>0.05)，p53與腫瘤分化程度、臨床分期、淋巴結轉移、放療近期療效明顯相關(P<0.05)，Ki- 67與腫瘤分化程度、淋巴結轉移、放療近期療效明顯相關(P<0.05)，PCNA與臨床分期、淋巴結轉移、放療近期療效明顯相關(P<0.05)。p53低、高表達組食管癌患者3年總生存率分別為57.14%、27.08%。結論：p53、Ki- 67及PCNA可作為評價食管癌惡性程度、放射敏感性的生物學指標，p53可作為評價食管癌預后的有效指標。

食管癌; p53； Ki- 67； 增殖細胞核抗原； 放療敏感性

食管癌是常見的消化道惡性腫瘤，我國食管癌的發(fā)病率和死亡率均居全球首位。由于早期癥狀不明顯，近50%的食管癌患者在確診時已屬中晚期，這部分患者失去了根治性手術治療機會[1]。此時，放療就成為治療食管癌的主要手段之一，放療敏感性能夠直接影響腫瘤治療效果，目前有許多腫瘤生物標志物，如XRCC4、c- erbB- 2等與放療敏感性有關。p53、Ki- 67、增殖細胞核抗原(PCNA)等指標在多種腫瘤組織和細胞中過表達，且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等密切相關，但其對食管癌放療敏感性和預后的預測作用尚無定論。本項研究通過免疫組化方法檢測食管癌患者組織中p53、Ki- 67及PCNA蛋白的表達，分析其與放療敏感性、預后的關系，為臨床治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2012年1月至2013年5月間蚌埠醫(yī)學院附屬解放軍82醫(yī)院放療科首次治療的食管癌患者83例，KPS評分均≥80，治療前行胃鏡活檢，病理類型均為食管鱗狀細胞癌。其中男47例，女36例，年齡49～91歲，平均67歲。部位：頸部及胸上段30例，胸中段40例，胸下段13例。食管癌造影顯示病變長度>5 cm者17例，≤5 cm者66例。分化程度：高分化鱗癌28例，中分化鱗癌34例，低分化鱗癌21例。食管癌按照2009年中國非手術治療食管癌臨床分期草案標準[2]及陳建州等[3]建議進行臨床分期：Ⅰ期30例，Ⅱ期35例，Ⅲ期18例。淋巴結轉移情況：一般標準為淋巴結短徑≥10 mm,食管旁、氣管食管溝、心包角淋巴結長徑≥5 mm，腹腔淋巴結長徑≥5 mm為淋巴結轉移陽性。本研究中發(fā)生淋巴結轉移者45例，未發(fā)生淋巴結轉移者38例。

1.2 放療方法

患者采用6 MV- X射線三維適形放療或調強放療，其中大體腫瘤區(qū)(gross tumor volume， GTV)包括食管原發(fā)灶區(qū)，陽性淋巴結(GTVnd)包括陽性的淋巴結；臨床靶區(qū)(clinical target volume， CTV)包括GTV和GTVnd,在其前后左右外放0.8～1.0 cm，GTV上下外放2～3 cm或GTVnd上下外放1.0～1.5 cm；計劃靶區(qū)(planning target volume， PTV)在CTV基礎上各外放0.5～1.0 cm。高齡及體質弱的患者適當縮小靶區(qū)。95%PTV和(或)95%PTVnd處方劑量為60～66 Gy，2 Gy·次-1，1 次·d-1，每周5 d。脊髓最大劑量≤45 Gy，肺平均劑量≤13 Gy，心臟平均劑量≤30 Gy。

1.3 免疫組化染色及結果判定

每個病例的組織蠟塊標本制成5 μm厚度的切片，采用ElivisionTMplus法進行免疫組化染色，嚴格按照試劑盒說明操作。p53、Ki- 67、PCNA 均定義在細胞核內，出現(xiàn)棕色顆粒為陽性細胞，藍色為陰性細胞。隨機觀察10個高倍視野，陽性細胞占計數(shù)細胞的百分比即為陽性表達率。對p53、Ki- 67、PCNA 結果判斷標準：無表達(-)為切片中無陽性細胞；低度表達(+)為陽性細胞數(shù)<25%;中度表達(++)為25%≤陽性細胞數(shù)<50%；高度表達(+++)為陽性細胞數(shù)≥50%。為便于分析，本實驗以(-)(+)作為低表達，(++)(+++)作為高表達。

1.4 近期療效評價

患者放療后1～3個月進行影像學檢查(包括CT、食管造影等)，根據(jù)鋇餐造影及CT檢查結果[4]分為完全緩解 (complete remission，CR) :腫瘤病變完全消失,造影顯示邊緣光滑，鋇劑可順暢通過，管腔無狹窄，X線可見黏膜基本恢復正常，CT顯示最大管壁厚度≤1.2 cm,且放療后殘存淋巴結體積≤1.00 cm3; 部分緩解(partial remission，PR) :腫瘤部分消失，鋇劑通過比較清晰，邊緣欠光滑，管腔狹窄,CT顯示最大管壁厚度≥1.2 cm,且放療后殘存淋巴結體積>1.00 cm3; 無效(no response，NR) :腫瘤未消失，有顯著充盈缺損、龕影、狹窄,CT顯示有新發(fā)病灶。

1.5 隨訪

所有患者主要以住院或門診并配合電話方式隨訪，了解患者生存情況等信息。

1.6 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學分析,p53、Ki- 67及PCNA的表達與臨床病理參數(shù)統(tǒng)計方法采用χ2檢驗，與放療療效關系采用Spearman等級相關分析；采用Kaplan- Meier法進行生存分析，并采用log- rank檢驗比較兩組生存率，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 一般資料統(tǒng)計結果

83例患者中58例放療完全結束后繼續(xù)接受化療，25例未作任何治療。近期療效評價完全緩解 31例， 部分緩解37例，總有效率81.9%(68/83)?；颊唠S訪截止日期為2016年6月，中位隨訪時間26個月,隨訪率100%

2.2 p53、Ki- 67、PCNA在食管癌組織的高表達率

83例食管鱗癌組織中p53、Ki- 67、PCNA高表達率分別為57.8%(48/83)、72.3%(60/83)、67.5%(56/83),見圖1～6。

圖1 p53在食管癌細胞中低表達 ×100

Fig 1 p53 was weakly expressed in esophageal carcinoma cell ×100

圖2 p53在食管癌細胞中高表達 ×100

Fig 2 p53 was highly expressed in esophageal carcinoma cell ×100

圖3 Ki- 67在食管癌細胞中低表達 ×100

Fig 3 Ki- 67 was weakly expressed in esophageal carcinoma cell ×100

圖4 Ki- 67在食管癌細胞中高表達 ×100

Fig 4 Ki- 67 was highly expressed in esophageal carcinoma cell ×100

圖5 PCNA在食管癌細胞中低表達 ×100

Fig 5 PCNA was weakly expressed in esophageal carcinoma cell ×100

圖6 PCNA在食管癌細胞中高表達 ×100

Fig 6 PCNA was highly expressed in esophageal carcinoma cell ×100

2.3 p53、Ki- 67、PCNA表達與食管癌患者臨床病理參數(shù)之間的關系

p53、Ki- 67、PCNA的表達水平與食管癌患者性別、年齡、侵犯部位、腫瘤長度等各臨床病理因素無關(P>0.05)，而三者在淋巴結轉移組中的高表達率均高于無淋巴結轉移組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。p53與Ki- 67在低分化組患者的高表達率高于中、高分化組患者(P<0.05)，p53與PCNA在食管癌Ⅲ期患者中的高表達率高于Ⅰ期和Ⅱ期患者(P<0.05)。見表 1。

表1 p53、Ki- 67、PCNA與食管癌患者臨床病理參數(shù)的關系 例

Tab 1 Correlation of p53,Ki- 67,PCNA expression and the clinical characteristics of 83 esophageal patients cases

注：括號中為所占百分比

2.4 p53、Ki- 67、PCNA表達與放療后近期療效的相關性

采用Spearman等級分析方法對p53、Ki- 67、PCNA和食管癌近期療效的相關性進行分析，結果顯示:p53、Ki- 67、PCNA的表達高低與放療近期療效相關(r=0.271、- 0.229、- 0.246,P<0.05)。p53低表達組中CR率(48.6%)高于高表達組(29.1%)，Ki- 67高表達組CR率(41.7%)高于低表達組(26.1%)，PCNA高表達組CR率(42.9%)高于高表達組(25.9%)，差異均有統(tǒng)計學意義。見表2。

表2 p53、Ki- 67、PCNA表達與放療后近期療效的相關性 例

Tab 2 Correlation of p53，Ki- 67，PCNA expression and radiotherapy effect cases

2.5 p53、Ki- 67、PCNA與食管癌患者生存時間的關系

83例食管癌患者3年總生存率為39.8%。用Kaplan- Meier進行生存分析顯示p53低表達組食管癌患者3年總生存率57.14%，高表達組3年總生存率27.08%，兩者比較差異顯著(log- rank檢驗,P<0．05)。Ki- 67、PCNA蛋白高表達組和低表達組對食管癌患者3年總生存率無顯著差異(log- rank檢驗，P>0．05)。見圖7～9。

3 討 論

隨著分子生物學的發(fā)展，腫瘤基因的表達檢測與預測臨床療效及預后的關系成為近年來研究的熱點。

p53作為腫瘤抑制基因，在細胞周期調控、DNA合成抑制、受損DNA修復和細胞凋亡中起關鍵作用。有研究[5]表明，腫瘤組織中p53 蛋白過表達大多數(shù)情況下意味著 p53 基因突變失活為癌基因。本研究顯示 p53蛋白高表達率為57.8%,其在低分化、臨床分期的Ⅲ期、伴淋巴結轉移的食管癌中陽性表達率較高，充分說明 p53 高表達預示著腫瘤的侵襲力、轉移能力較強，臨床病理分期較晚，預后較差，與雷蕾等[6- 8]的報道一致。細胞周期的變化會影響腫瘤細胞凋亡和對輻射的敏感性，腫瘤細胞對射線最敏感的期限是G1/S期交界點，而進入S期后放療敏感性就會下降，S晚期敏感性最低。p53基因負向調控細胞分裂和增殖的作用，主要是將腫瘤細胞阻滯在G1/G0期，如果發(fā)生突變，因不能阻止細胞由G1期向S期過渡而導致細胞多數(shù)進入S期，放療敏感性下降。余輝等[5]指出，p53基因突變可降低對輻射的敏感性，p53蛋白陽性者對放療的敏感性低。本研究結果顯示p53表達和食管癌放療近期療效之間有一定相關性，p53高表達組食管癌患者放療近期療效差；Kaplan- Meier法生存分析發(fā)現(xiàn)p53低表達組食管癌患者3年總生存率為57.14%、p53高表達組為27.08%，兩組差異有統(tǒng)計學意義。因此 p53表達不僅適合作為判斷食管癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲力、轉移力的生物學指標，而且可作為放療敏感性及預后預測的新指標。

圖7 p53不同表達組食管癌患者的生存分析

Fig 7 Survival analysis of different p53 expression in esophageal patients

圖8 Ki- 67不同表達組食管癌患者的生存分析

Fig 8 Survival analysis of different Ki- 67 expression in esophageal patients

圖9 PCNA不同表達組食管癌患者生存分析

Fig 9 Survival analysis of different PCNA expression in esophageal patients

Ki- 67 作為一個敏感的細胞增殖標志物，在所有處于細胞增殖周期的細胞核中表達，但在細胞靜止期G0期不表達。有研究表明，Ki- 67表達高低與腫瘤的分化程度、轉移及預后密切相關[9]。本研究中 Ki- 67在83例食管癌患者中高表達率為72.3%，食管癌低分化者中Ki- 67的高表達率明顯高于高、中分化者，有淋巴結轉移的食管癌患者 Ki- 67 的表達明顯高于無淋巴結轉移的患者。有研究[10]表明,Ki- 67高表達的食管癌患者放療療效越好，這可能與放射線對增殖期細胞殺傷力較大有關，本研究結果與此一致，高表達組放療有效率(88.3%)高于低表達組(65.2%)。生存分析Ki- 67 高、低表達組患者3年生存率未顯示出顯著差異。提示Ki- 67高表達的食管鱗狀細胞癌中腫瘤細胞增殖活性高，有較強的侵襲力和惡性程度，同時放射線對其有較高敏感性，但影響食管癌生存的因素較多，Ki- 67還不能用于預后判斷。

PCNA為 DNA 聚合酶 δ 的輔助蛋白，參與細胞增殖過程中 DNA 的復制，反映細胞的增殖活性，可作為判斷細胞增殖狀態(tài)的一項指標。在腫瘤及許多增生性病變中 PCNA 的表達顯著增加，本研究顯示食管癌組織中PCNA高表達率67.5%，且與食管癌患者的淋巴結轉移、臨床分期有關。Okuno等[11]對 65 例食管鱗癌單純放射治療患者的放射治療前活檢標本進行PCNA 和 Ki- 67 指數(shù)的檢測發(fā)現(xiàn), 兩指數(shù)與放射治療患者的局部控制率呈正相關。有研究員[12]對食管癌病人術前的活檢標本進行 PCNA 和血管內皮細胞生長因子(EGFR)檢測發(fā)現(xiàn)，PCNA 和 EGFR 同時陰性的患者對放療和化療幾乎無反應。張麗珍等[13]研究結果顯示，高 PCNA 指數(shù)組較低 PCNA 指數(shù)組的治療有效率、局部控制率和生存率均高(P<0.05)。本研究結果顯示PCNA蛋白的表達與放療近期療效相關，高表達組近期有效率(89.3%)高于低表達組(66.7%)，差異有統(tǒng)計學意義，與前述其他研究結果基本一致。但是生存分析結果顯示,PCNA高表達組與低表達組患者生存率比較無顯著差異?？紤]本研究為回顧性分析，Ki- 67和PCNA未顯示出生存差異可能同隨訪時間短有關。

總之，作為生物標志物，p53、Ki- 67和PCNA對預測食管鱗癌的惡性程度和放療敏感性是有利的，3個協(xié)同檢測可能優(yōu)于單個指標的預測。此外，p53還在評估食管癌患者預后方面顯示出巨大的優(yōu)勢，可作為判斷食管癌預后的生物學指標之一。

[1] Lü Y J，ZHANG J D，QIAO L L．Quality of life in patients with esophageal cancer receiving definitive chemoradiotherapy or esophagectomy[J].Mol Clin Oncol，2014,2(5):870- 874．

[2] 中國非手術治療食管癌臨床分期專家小組.非手術治療食管癌的臨床分期標準(草案)[J].中華放射腫瘤學雜志，2010,19(3):179- 180.

[3] 陳建洲，陳創(chuàng)珍，李德銳，等.非手術治療食管癌臨床分期的驗證[J].中國腫瘤，2011,21(5):374- 378.

[4] 韓春，任雪姣，王瀾，等．鋇餐造影結合CT評價食管癌放療近期療效的研究[J].中華放射腫瘤學雜志，2013，22(1)：26- 29．

[5] 余輝,吳一龍,戎鐵華,等.p53、C- erb- 2、VEGF蛋白表達對非小細胞肺癌輔助放療的臨床預測[J].中華腫瘤雜志,2004,26(1):44.

[6] 雷蕾，葉斌，王西川.p53和Ki- 67在食管癌中的表達及其臨床意義[J].中國醫(yī)藥指南，2014,12(9):10- 11.

[7] 馬懷幸,劉偉巍,李世偉,等.p53狀態(tài)與食管鱗癌預后及臨床病理特征關系的系統(tǒng)評價[J].世界華人消化雜志,2015,23(36):5829- 5842.

[8] WANG L H,YU X D,LI J,et al.Prognostic significance of p53 expression in patients with esophageal cancer:a meta- analysis[J].BMC Cancer,2016,16:373.

[9] ZOLOTA V，BATISTATOU A，TSAMANDAS A C，et al．Immunohistochemiocal expression of TGF- betal，p21 WAF1，p53，Ki- 67，and angiogenesis in gastric carcinomas:a clinicopathologic study[J].Int J Gastrointest Cancer，2002,32(2- 3):83- 89．

[10] 任金山,吳紅芳.Ki- 67與食管鱗癌放療敏感性的相關研究[J].中國現(xiàn)代藥物應用,2011,5(8):37- 38.

[11] OKUNO Y,NISHMURA Y,KASHU I,et al.Prognosticvalues of prolifera ting cell nuclear antigen PCNA and Ki- 67 for radiotherapy of esophageal squamous cell carcinomas[J].Br J Cancer,1999,80(3- 4):387- 395.

[12] HICKEY K,GREHAN D,REID I M,et al.Expression of epidermal growth factor recepter and prolifer ating cell nuclear

antigenepredicts response of esophageal sqamous cell carcinoma to chemoradiotherapy[J].Cancer,1994,74(6):1693- 1698.

[13] 張麗珍，程炳權，楊偉志.PCNA及nm23的表達與食管鱗癌放射敏感性及預后的相關性研究[J].中華放射腫瘤學雜志,2001,10(4):239- 242.

(本文編輯：周蘭波)

Expression of p53，Ki- 67 and PCNA in esophageal squamous cell carcinoma and correlation with radiotherapy effect and prognosis

YANG Yan1,2,WEI Shu- zhen2,DU Yun- xiang2,ZHANG Chuang2

(1.BengbuMedicalcollege,Bengbu233000,China;2.DeprtmentofOncoloy,No.82HospitalofPeople’sLiberationArmySubsidiary,BengbuMedicalcollege,Huai’an223001,China)

Objective:To explore the expression of p53， Ki- 67 and proliferating cell nuclear antigen(PCNA) in esophageal squamous cell carcinoma and its relation with radiotherapy effect and prognosis. Methods: Eighty- three esophageal carcinoma patients who underwent esophageal radiotherapy in our hosiptal were analyzed. Expressions of p53,Ki- 67and PCNA were detected by immunohistochemistry, and its relation with clinicopathologic features, radiotherapy effect and survival rate of esophageal carcinoma patients was analyzed. Results: The positive expression rates of p53,Ki- 67and PCNA were 57.8%,72.3%and 67.5%, respectively. The expressions of p53,Ki- 67and PCNA in different gender，age，tumor position and size had no statistical differences(P>0.05).p53 was related to the tumor differentiation degree, clinical stage,lymph node metastasis and radiotherapy effect(P<0.05).Ki- 67 was related to the tumor differentiation degree,lymph node metastasis and radiotherapy effect (P<0.05). PCNA was related to the clinical stage,lymph node metastasis and radiotherapy effect (P<0.05).Three years overall survival rates of patients in low and high p53 expression groups were 57.14% and 27.08%,respectively. Conclusion: p53， Ki- 67 and PCNA can be used as the predictive markers for judguing malignant degree and radiosensitivity of esophageal carcinoma.p53 will be a useful marker for evaluating the prognosis of esophageal carcinoma.

esophageal carcinoma; p53; Ki- 67; proliferating cell nuclear antigen; radiosensitivity

2016- 09- 05

2016- 12- 10

南京軍區(qū)醫(yī)學科技創(chuàng)新重點課題(12Z09)

楊艷(1990-)，女，安徽阜陽人，在讀碩士研究生。E- mail:yangyan1521212@163.com

韋淑貞 E- mail:weiwei8222@163.com

楊艷,韋淑貞,杜云翔,等.p53、Ki- 67、PCNA的表達與食管鱗癌放療近期療效及預后的關系[J].東南大學學報:醫(yī)學版,2017,36(2):155- 161.

R735.1; R815

A

1671- 6264(2017)02- 0155- 07

10.3969/j.issn.1671- 6264.2017.02.005