醇沉4組分蘆薈多糖通過不同給藥途徑對SD大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面愈合過程中纖維連接蛋白含量的影響

何潔++唐建紅++劉川玉+++馮熙++黃瑤

[摘要] 目的 研究醇沉4組分蘆薈多糖對SD大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面修復過程中皮膚愈合率及皮膚組織中纖維連接蛋白（FN）含量的影響，探討蘆薈多糖促進燙傷創(chuàng)面愈合的可能作用機制。 方法 大鼠背部用水浴烙鐵法致傷，采用隨機數(shù)字表法對大鼠分組。試驗組用醇沉4組分（60%、70%、80%、90%比例）蘆薈多糖水溶液采取外敷、灌胃及混合給藥3種方式，對照組用生理鹽水采取相同給藥方式，2次/d。記錄傷后3、7、14 d創(chuàng)面愈合率，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）測定創(chuàng)面皮膚組織中FN含量。 結(jié)果 與對照組比較，試驗組愈合率明顯升高，80%、90%蘆薈多糖組于燙傷后14 d創(chuàng)面愈合率明顯高于對照組（P < 0.01）。FN含量在第7天達峰值，之后逐漸下降。傷后3、7、14 d試驗組創(chuàng)面FN含量均高于對照組，80%、90%蘆薈多糖組FN含量于第7、14天顯著高于對照組（P < 0.01），80%蘆薈多糖組FN含量最高。給藥方式上外敷優(yōu)于灌胃，混合給藥優(yōu)于外敷給藥。 結(jié)論 80%蘆薈多糖混合給藥（外敷及灌胃）燙傷大鼠，促進傷口愈合的療效最佳。蘆薈多糖使燙傷創(chuàng)面皮膚組織中FN含量增加，促進創(chuàng)面皮膚愈合，為蘆薈多糖制劑在燒燙傷方面的臨床應(yīng)用提供了實驗依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 蘆薈多糖；醇沉；給藥途徑；燙傷創(chuàng)面；愈合；纖維連接蛋白；含量

[中圖分類號] R644 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）04（b）-0022-04

[Abstract] Objective To study the effects of aloe polysaccharide in four components of alcohol precipitation on the healing rate of skin and the contents of fibronectin （FN） during healing process in SD rats with scalded wound surface of deep Ⅱ degree， and to investigate the possible mechanism of aloe polysaccharide in promoting the healing of scalded wound surface. Methods The back of rats was injured by iron in boiling water， and the rats were grouped by random digits table. Experimental group was applied with aloe polysaccharide aqueous solution in four components of alcohol precipitation （60%， 70%， 80% and 90%）， with 3 administration routes of external application， gastrogavage and mixing administer； control group was applied with physiological saline by the same administration routes， twice a day. The healing rate of wound surface was recorded after scalding for 3， 7， 14 d， and the content of FN in wound surface was determined by enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）. Results Compared with control group， the healing rate in experimental group was increased significantly， and the healing rates in 80%， 90% aloe polysaccharide groups after scalding for 14 d were significantly higher than that of control group （P < 0.01）. The contents of FN reached peak in seventh day， then they were gradually decreased. The contents of FN in wound surface after scalding for 3， 7， 14 d in the experimental group were all higher than those of control group， the contents of FN in 80%， 90% aloe polysaccharide groups after scalding for 7， 14 d were significantly higher than that of control group （P < 0.01）， the content of FN in 80% aloe polysaccharide group was the highest. In way of administration， external application was better than gastrogavage， and mixing administer was better than external application. Conclusion The efficacy of 80% aloe polysaccharide by mixing administer （external application， gastrogavage） in scalded rats in promoting the healing of wound is the best. Aloe polysaccharide makes the increase of FN in scalded wound surface， promote the healing of wound surface， and provide experimental basis for the clinical application of aloe polysaccharide preparations in burn and scald.

[Key words] Aloe polysaccharide； Alcohol precipitation； Administration routes； Scalded wound surface； Healing； Fibronectin； Content

開發(fā)既能消炎止痛、抗感染、促進創(chuàng)面愈合且愈后瘢痕少，又經(jīng)濟便宜、操作方便的外用藥物，成為目前臨床上燒燙傷創(chuàng)面治療的重點。蘆薈是多年生百合科肉質(zhì)草本植物，具有良好的抗炎[1]、抗氧自由基[2]、調(diào)節(jié)免疫[3]、促進創(chuàng)傷愈合[4]、抗細菌[5]、抗真菌[6]、抗病毒[7]及抗輻射[8]、抗癌[9]等作用，廣泛用于治療燒燙傷、創(chuàng)傷。蘆薈多糖為主要生物活性成分，可刺激免疫，激活巨嗜細胞產(chǎn)生[10]，分泌多種細胞因子如表皮生長因子、堿性成纖維細胞生長因子、核因子等[11]；促進內(nèi)皮細胞遷移、增殖并影響受損內(nèi)皮細胞修復[12]，促進傷口愈合。研究發(fā)現(xiàn)蘆薈凝膠對Ⅱ度燙傷大鼠具有促進創(chuàng)面愈合和減少瘢痕形成的作用[13]。本研究通過建立大鼠深Ⅱ度燙傷模型，按鮮榨汁法制備庫拉索蘆薈凝膠中醇沉4組分蘆薈多糖水溶液采取外敷、灌胃及混合給藥3種方式，觀察大鼠燙傷創(chuàng)面愈合率及皮膚組織中纖維連接蛋白（FN）含量，探討蘆薈多糖促進燙傷創(chuàng)面愈合的作用機制，為蘆薈多糖制劑在燒燙傷方面臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠450只，成年（12月齡），雌雄各半，體重（200±20）g，由桂林醫(yī)學院科學實驗中心動物室提供（桂動字第P0020500A號）。嚴格遵循科技部《關(guān)于善待實驗動物的指導性意見》，經(jīng)桂林醫(yī)學院實驗動物倫理委員會批準實施。

1.2 藥品與試劑

蘆薈多糖，采用百合科蘆薈屬植物庫拉索蘆薈去皮取肉質(zhì)部分按鮮榨汁法提取，醇沉法制備。庫拉索蘆薈品種來源于桂林醫(yī)學院藥用植物園，經(jīng)桂林醫(yī)學院生藥教研室唐愛蓮教授鑒定為正品。大鼠FN酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（SBJ，96T，PD-7002）購自南京安培化工科技有限公司。

1.3 儀器

電子天平（HK-7532，瑞士Mettler公司）；振蕩器（B0025，上海醫(yī)科大學儀器廠）；組織粉碎機（JB90-D，上海標本模型廠）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（C0034，上海醫(yī)科大學儀器廠）；快速恒溫數(shù)顯水浴箱（JK-56，常州國華儀器廠）；-80℃超低溫冰箱（M-6200，日本Sanyo公司）；自動高速低溫離心機（J6-HC，美國Beckman公司）；酶標儀（K-6010，美國Bio-Tek公司）。

1.4 方法

1.4.1 蘆薈多糖水溶液制備

鮮榨汁法[14]制備蘆薈凝膠。取新鮮庫拉索蘆薈葉，洗凈瀝干剪成長條狀并去皮，取葉肉用組織粉碎機打成膠狀，稱定質(zhì)量，將蘆薈凝膠置于燒杯中加3倍量蒸餾水，0.5%活性炭脫色，超聲30 min后60℃水浴30 min，6層紗布過濾后減壓抽濾。濾液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至原體積1/5，加0.2%～0.5%抗氧化劑Na2SO3防止氧化。

運用醇沉法[15]按60%、70%、80%、90%比例提取蘆薈凝膠中的蘆薈多糖。將制備好的新鮮蘆薈凝膠各4份，3倍量蒸餾水于60℃水浴30 min充分溶解，減壓抽濾，濾液分別用無水乙醇配成料液比為1∶1.50、1∶2.33、1∶4.00、1∶9.00的蘆薈凝膠-乙醇混合溶液，靜置過夜，得白色絮狀沉淀。傾去上清液，取下層混合液于60℃水浴蒸干，將所得物質(zhì)再次加水復溶，重復操作，研磨得到白色均勻細膩的粉末，即醇沉4組分的蘆薈多糖，蒸餾水溶解配制成濃度為10 mg/mL蘆薈多糖水溶液，冷藏備用。

1.4.2 大鼠燙傷模型建立

大鼠腹腔麻醉，背部脫毛消毒，將開水浴中煮沸鐵棒（橫斷面1.5 cm×1.0 cm）一端緊貼大鼠背部皮膚持續(xù)7 s，造成約10%面積燙傷，創(chuàng)面病理證實為深Ⅱ度，腹腔注射乳酸林格液5 mL抗休克。因背部燙傷部位大鼠未能舔食觸及和搔抓，故將燙傷創(chuàng)面開放以隨時觀察創(chuàng)面愈合或感染情況。于室溫22～25℃、濕度50%單籠飼養(yǎng)，自由攝食、飲水。

1.4.3 實驗分組及給藥方法

采用隨機數(shù)字表法將450只SD大鼠隨機分成對照組（90只）和試驗組（360只）。試驗組即蘆薈多糖組，隨機分為60%、70%、80%、90%蘆薈多糖組，每組90只，按外敷、灌胃（每次10 mL）及混合（外敷及灌胃）3種給藥方式（2次/d），分為三小組，每小組30只。試驗組均按“1.4.1”法配制10 mg/mL蘆薈多糖水溶液給藥，對照組用與試驗組等體積的生理鹽水采取相同給藥方式，如有感染用抗生素外涂。

1.4.4 標本處理

五組大鼠分別于燙傷后3、7、14 d每小組處死10只。取創(chuàng)面全層皮膚組織100 mg，去除痂皮并吸去血跡，按1 mL生理鹽水/100 mg皮膚組織比例碾磨勻漿。將標本于4℃以下10 000 r/min（r = 13.5 cm）離心15 min，取上清液于-20℃以下保存。

1.5 檢測指標

1.5.1 創(chuàng)面愈合率

燙傷后3、7、14 d記錄創(chuàng)面愈合程度，將創(chuàng)面描記在半透明紙上，以此為模板，將質(zhì)地均勻的硬紙片剪成同樣大小，以硬紙片大小間接表示創(chuàng)面面積大小。創(chuàng)面愈合率（%）=（開始燙傷面積-未愈合創(chuàng)面面積）/開始燙傷面積×100%。

1.5.2 FN含量

取燙傷后3、7、14 d燙傷部位皮膚稱重、定容、勻漿，測定組織液中FN含量，采用ELISA雙抗夾心法檢測。

1.5.2.1 建立標準曲線 設(shè)標準孔10孔，1、2孔分別加標準品100 μL及稀釋液50 μL，依次混勻、對倍稀釋至9、10孔，稀釋后各孔加樣量均為50 μL，于450 nm波長處測吸光度。取每2孔平均值，以濃度C為橫坐標，吸光度A（OD值）為縱坐標，繪制標準曲線。得回歸方程A = 0.0236C+0.252，R2 = 0.9947。見表1、圖1。

1.5.2.2 結(jié)果測定 設(shè)空白對照孔（不加樣品及酶標試劑）、待測樣品孔，按加樣、溫育、配液、洗滌、加酶、溫育、洗滌、顯色、終止步驟操作。以空白對照孔調(diào)零，于450 nm波長處依序測定每孔吸光度（OD值），將樣本OD值代入標準曲線方程，求出濃度，樣品濃度×稀釋倍數(shù)=樣品的實際濃度。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0軟件分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）及方差齊性檢驗，方差齊采用LSD檢驗，方差不齊采用Tamhane's T2檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組燙傷創(chuàng)面愈合率比較

燙傷后第3天各組間差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），第7天80%、90%蘆薈多糖組愈合率明顯高于對照組（P < 0.05），第14天60%、70%蘆薈多糖組愈合率高于對照組（P < 0.05），80%、90%蘆薈多糖組愈合率顯著高于對照組（P < 0.01）。試驗各組組間差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見表2。

2.2 各組燙傷創(chuàng)面皮膚組織纖維連接蛋白含量變化比較

燙傷后各組FN含量隨著時間的延長而逐漸增加，燙傷后第7天達高峰，試驗組FN含量均高于對照組，80%蘆薈多糖組FN含量最高。給藥方式上外敷優(yōu)于灌胃，混合給藥優(yōu)于外敷給藥。燙傷后第3天，80%、90%蘆薈多糖組FN含量明顯高于對照組（P < 0.05）；燙傷后第7、14天，60%、70%蘆薈多糖組FN含量高于對照組（P < 0.05），80%、90%蘆薈多糖組FN含量顯著高于對照組（P < 0.01）。試驗各組組間差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見表3。

3 討論

燙傷創(chuàng)面修復愈合受多種因素影響，早期與局部炎性反應(yīng)，后期與上皮細胞增殖、結(jié)締組織形成、傷口收縮改建有關(guān)[16-17]。FN促進細胞與纖維基質(zhì)間連接生長，與創(chuàng)傷修復過程密切相關(guān)，為傷口愈合關(guān)鍵物質(zhì)[18-19]。蘆薈多糖促進FN合成，加速膠原蛋白生物合成降解，使傷口愈合加速[20]。

與對照組相比，試驗組燙傷創(chuàng)面愈合時間明顯縮短，燙傷后第7、14天愈合率明顯提高（P < 0.05）。試驗組FN含量明顯高于對照組，表明蘆薈多糖給藥促進燙傷創(chuàng)面皮膚組織內(nèi)FN合成，達到愈合創(chuàng)面皮膚作用。80%蘆薈多糖組混合給藥FN含量最高，研究表明[21]，蘆薈凝膠中多糖含量與醇沉比例呈正相關(guān)，但并非比例越大越好，以80%醇沉組多糖含量最高，故促進創(chuàng)面愈合療效最佳。FN含量于燙傷后第7天達到峰值，之后逐漸下降。由于燙傷早期損傷修復由肉芽組織即新生毛細血管和纖維母細胞修復，燙傷晚期肉芽組織中毛細血管成熟并減少，纖維母細胞轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維細胞并產(chǎn)生膠原纖維[22]，因此蘆薈多糖在燙傷早期促進組織修復，燙傷晚期由于組織修復較快，加速肉芽組織形成和老化而減少瘢痕形成，F(xiàn)N含量下降。

總之，蘆薈多糖促使燙傷創(chuàng)面皮膚組織中FN含量增加，加速創(chuàng)面皮膚愈合，以80%蘆薈多糖混合給藥（外敷及灌胃）方式促進愈合療效最佳，為蘆薈多糖制劑在燒燙傷方面的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

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（收稿日期：2017-01-03 本文編輯：張瑜杰）