PGRMC1在三陰性乳腺癌中的表達及其與ki—67的相關性

楊華鋒　紀術峰　李占文　鐘鎮(zhèn)鏵　史國軍　范鳳鳳　唐魯兵

[摘要] 目的 探討PGRMC1與三陰性乳腺癌（TNBC）分期、分級等各臨床病理指標的相關性，建立患者隨訪系統(tǒng)，并分析其與腫瘤增殖性抗原ki-67的相關性。 方法 利用免疫組化檢測90例TNBC患者組織中PGRMC1和ki-67的表達，應用χ2檢驗，用 Kaplan-Meier方法分析PGRMC1表達與生存情況，Log-rank檢驗比較生存率，用相關性分析和ROC曲線探索其內在相關性。 結果 90例TNBC組織中PGRMC1呈現高表達50例。PGRMC1的表達與腫瘤的體積、ki-67的表達、淋巴結轉移和臨床分期相關（P<0.05）；TNBC組織中PGRMC1與年齡和腫瘤病理分級無關（P>0.05）。TNBC組織中PGRMC1的表達與患者的總生存率（Log-rank=15.614，P=0.0001）和無瘤生存率（Log-rank=14.371，P=0.031）密切相關。 結論 TNBC組織中PGRMC1的表達水平與腫瘤轉移、臨床分期以及ki-67的增殖呈正相關，多因素分析結果提示PGRMC1可作為TNBC的潛在腫瘤生物標志物以及癌干細胞的治療靶標。

[關鍵詞] 三陰性乳腺癌；PGRMC1；ki-67；靶向

[中圖分類號] R737.9 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2016）34-0008-05

Expression of PGRMC1 in triple negative breast cancer and its correlation with ki-67

YANG Huafeng1 JI Shufeng2 LI Zhanwen1 ZHONG Zhenhua1 SHI Guojun3 FAN Fengfeng1 TANG Lubing1

1.Department of Breast Surgery， the Affiliated Hospital of School of Medicine of Ningbo University， Ningbo 315000， China； 2.Department of General Surgery， Zhujiang Hospital of Southern Medical University， Guangzhou 510282， China； 3.Department of Oncology， Ningbo Hosptial of TCM， Ningbo 315012， China

[Abstract] Objective To explore the correlation between PGRMC1 and TNBC staging and grading and other clinicopathological indicators， establish a patient follow-up system， and analyze its correlation with tumor proliferating antigen ki-67. Methods The expression of PGRMC1 and ki-67 in 90 cases of TNBC was detected by immunohistochemistry. The Kaplan-Meier method was used to analyze the expression and survival of PGRMC1 by χ2 test. Log-rank test was used to compare the survival rate， and the relativity analysis and ROC curve were used to explore the intrinsic correlation. Results In 90 cases of TNBC tissues， PGRMC1 was expressed highly in 50 cases. The expression of PGRMC1 was closely related to tumor volume， ki-67 expression， lymph node metastasis and clinical staging（P<0.05）； there was no correlation between PGRMC1 and age and tumor pathological grade in TNBC tissues（P>0.05）. The expression of PGRMC1 in TNBC tissues was closely related to the tumor-free survival rate（Log-rank=14.371， P=0.031） and overall survival rate（Log-rank=15.614， P=0.0001）. Conclusion The expression level of PGRMC1 in TNBC tissues is positively correlated with tumor metastasis， clinical staging and proliferation of ki-67. Multivariate analysis indicates that PGRMC1 can be a potential tumor biomarker for TNBC and a therapeutic target for cancer stem cells.

[Key words] Triple negative breast cancer； PGRMC1； ki-67； Target

三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）患者約占乳腺癌人群的10%～24%，患者發(fā)病年齡小，淋巴結陽性率和組織學分級較高，臨床行為更具有侵襲性，局部復發(fā)和內臟轉移率高，預后最差，緩解期最短，平均42.3個月[1]。由于三陰性乳腺癌既缺乏內分泌治療受體又缺乏靶向治療，目前尚無針對三陰性乳腺癌的個體化的治療方案，這就使得其成為臨床生存期最短的乳腺癌。此前很多學者研究認為雌激素受體和孕激素受體為細胞內受體，而最近大量基礎研究和臨床研究發(fā)現，在很多組織的細胞膜上有孕激素結合位點，被稱之為孕激素膜受體（progesterone receptor membrane component，PGRMC1）[2]。PGRMC1參與孕激素抗正常顆粒細胞凋亡的調控，PGRMC與三陰性乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展及預后是否有相關性？本課題通過對90例三陰性乳腺癌患者PGRMC1的表達情況進行回顧性分析，利用不同的統(tǒng)計學方法探索PGRMC的表達水平與病理分級、臨床分期、淋巴結轉移情況以及與腫瘤增殖性抗原ki-67表達等臨床病理指標之間的關系。探討PGRMC1作為三陰性乳腺癌的潛在腫瘤生物標志物，以及癌干細胞的治療靶標的可行性，為三陰性乳腺癌治療需找新的路徑。

1 對象與方法

1.1研究對象

選自寧波大學醫(yī)學院附屬寧波婦女兒童醫(yī)院乳腺外科2012年1月～2015年12月住院的三陰性乳腺癌患者的石蠟標本（經病理證實），入組患者共90例，年齡27～70歲，平均年齡（45.6土6.5）歲，入組患者均為女性，所有患者術前未進行相關的治療，術后給予標準的化療各8周期。病例資料和隨訪資料完整。病理分級依據WHO分級標準分為：高分化（G1）、中分化（G2）、低分化（G3）。臨床病理分期根據2009年公布的UICC新PTNM分期標準分為：Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期。

1.2 主要試劑

無水乙醇、二甲苯、切片石蠟、40%甲醛、30%雙氧水，購于廣州市化學工業(yè)公司；DAB顯色試劑盒、陽性白片、SABC免疫組化試劑盒（即用型）、EnVision檢測試劑盒（即用型），購于武漢博士德生物工程有限公司；蘇木素、伊紅、多聚賴氨酸磷酸二氫鈉、枸櫞酸鈉中性樹脂，購于北京中山生物有限公司；PGRMC1羊抗人多克隆抗體購于Abcom公司；ki-67鼠抗人單克隆抗體購于Dako公司；S-P試劑盒（KIT-9710）購自福州邁新公司（即用型）。

1.3 PGRMC1的免疫組織化學染色及評估

標本的石蠟切片60℃烘烤30 min，常規(guī)脫蠟、梯度脫水水化后，室溫條件下，滅活內源性過氧化物酶10 min。滴加山羊血清封閉液15 min，微波爐加熱，常溫下加入抗原修復液修復抗原，15 min后再加入1：200稀釋的一抗，4℃條件下濕盒反應8 h，37℃復溫20 min后PBS洗滌，然后每張貼片滴加生物素化二抗（兔抗人），室溫濕盒反應45 min，PBS洗滌后，室溫下加入顯色劑DAB，根據鏡下觀察顯色信息停止顯色劑反應，蘇木素復染核，脫水，透明，封片。孕激素膜受體陽性表達的判定：每張切片在高倍鏡視野下隨機選擇5個有代表性區(qū)域，進行視野內腫瘤細胞計數。然后再低倍鏡下觀察陽性細胞的著色強度，利用半定量積分法，對每張切片的陽性細胞率及陽性細胞著色強度分別進行分級計分，然后根據兩項之積的平均數定其陽性強度。孕激素膜受體陽性表達的判定標準：在胞漿中染色以棕黃色顆粒為主要成分為陽性表達。胞漿中顆粒染色強弱評判：無棕黃顆粒顯色為0分，棕黃顆粒顯色細胞<1/3為1分，棕黃顆粒顯色細胞為1/3～2/3為2分，棕黃顆粒顯色細胞>2/3為3分；再按棕黃顆粒顯色細胞所占比評判：棕黃顆粒顯色細胞<5%為0分，棕黃顆粒顯色細胞介于5%～25%之間為1分，棕黃顆粒顯色細胞介于26%～50%之間為2分，棕黃顆粒顯色細胞介于51%～75%之間為3分，棕黃顆粒顯色細胞>75%為4分。PGRMC1染色強度與陽性細胞百分比的乘積≤1分為陰性，PGRMC1染色強度與陽性細胞百分比的乘積>1分為陽性。

1.4 ki-67免疫組織化學染色及評估

標本的石蠟切片常規(guī)脫蠟、梯度脫水水化后，嚴格按照ki-67免疫組織化學操作程序說明進行，切片中ki-67陽性表達的判定：上皮細胞核中呈現黃色或棕黃色顆粒染色為陽性表達，按任意5個高倍鏡視野中得陽性細胞數所占細胞總數比率的平均值并參照文獻資料[3]進行分類：陰性：陽性細胞數<3%；陽性：陽性細胞數14%～50%；強陽性：陽性細胞數>50%。

1.5統(tǒng)計學方法

選用SPSS 19.0版統(tǒng)計學軟件分析各組臨床數據。用Fisher確切概率法分析TNBC臨床計數資料和孕激素膜受體的陽性表達，用χ2檢驗判斷分析孕激素膜受體的表達與臨床病理指標的關系，采用Kaplan-Meier法分析患者生存情況，用Log-rank檢驗分析比較患者的生存率。PGRMC1與ki-67關系采用相關性分析及ROC曲線分析。

2 結果

2.1 TNBC組織中PGRMC1、ki-67的表達

90例TNBC組織標本中，PGRMC1陰性表達為40例，50例為陽性表達。鏡下在腫瘤細胞胞漿內可見棕黃色顆粒狀染色，PGRMC1在正常乳腺組織不表達。ki-67陰性表達25例（27.8%），陽性表達為65例（72.2%）。陽性表達主要以腫瘤細胞上皮細胞核內有棕黃色顆粒（封三圖3）。

2.2 TNBC組織中PGRMC1的表達及其與臨床病理指標的關系

本組計數資料和等級資料經過統(tǒng)計學分析發(fā)現：患者年齡（P=0.193）與TNBC組織中PGRMC1的表達沒有相關性，而PGRMC1的表達與淋巴結的轉移情況密切相關（P=0.003），PGRMC1的表達與腫瘤病理分級和腫瘤的臨床分期并不一致，與腫瘤的病理分級無關（P=0.125），但與腫瘤的臨床分期密切相關（P=0.027）；而PGRMC1的表達腫瘤體積（P=0.020）緊密相關，有統(tǒng)計學意義（表1）。

2.3 TNBC患者PGRMC1表達的生存曲線圖

本組臨床資料經Kaplan-Meier分析結果顯示：PGRMC1的表達與患者無瘤生存率有統(tǒng)計學意義[Log-rank（Mantel-cox）=14.371，P=0.031]，PGRMC1的表達與患者總生存率有統(tǒng)計學意義[Log-rank（Mantel-cox）=15.614，P=0.001]，TNBC組織中PGRMC1的表達與患者的無瘤生存率及總生存率密切相關。多因素分析結果提示PGRMC1是TNBC獨立的腫瘤生物標志物（P=0.001）（圖1）。

2.4 三陰性乳腺癌組織中PGRMC1和ki-67表達及相關性

2.4.1 TNBC組織中PGRMCI和ki-67的表達情況 統(tǒng)計結果顯示（表2）：PGRMC1組：陽性表達占55.6%，陰性表達占44.4%；陽性表達組與陰性表達組之間比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；陽性表達主要以高表達為主，與低中陽性表達組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。ki-67組：陽性表達占72.2%，陰性表達占27.8%；陽性表達組與陰性表達組之間比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；陽性表達主要以高表達為主，與低中陽性表達組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。

2.4.2 三陰性乳腺癌PGRMCI與Ki-67表達的相關性分析 相關性統(tǒng)計分析結果顯示：三陰性乳腺癌PGRMCI與ki-67的表達呈顯著的正相關（r=0.622，P=0.000）。

2.4.3 診斷特征曲線對PGRMC1和ki-67診斷三陰性乳腺癌的評價與比較 曲線圖顯示（圖2）：PGRMCI與ki-67的ROC曲線均位于標準參考線的上方，遠離標準參考線，兩條曲線近乎重疊，說明PGRMCI與ki-67對三陰性乳腺癌的診斷敏感性基本接近，而且診斷的敏感性比較高。統(tǒng)計結果提示：PGRMCI的ROC曲線下面積為0.558，面積標準誤為0.064；ki-67的ROC曲線下面積為0.567，面積標準誤為0.064；兩組曲線面積無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。提示兩個指標診斷價值等同。

3 討論

激素信號通路是能將細胞外具有蛋白活性的分子信號傳入細胞內發(fā)揮效應的一系列酶促反應的通路，外在因素和條件下導致激素信號通路的異常激活，從而引起一系列的差異信號傳導，誘導引起異常的物質代謝，異?；罨蟮男盘柾芳坝纱艘鸬漠惓５奈镔|代謝可能在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉歸過程中起重要作用[4，5]。三陰性乳腺癌分子表達為ER-/PR-/HER-，組織學分級差、預后差，內分泌治療基本無效，以往研究認為ER、PR為胞內受體，近年來研究發(fā)現PGRMC1作為一種新型的膜受體在多種組織都有表達[6]，可以特異性結合雌、孕激素，該受體與腫瘤細胞增殖，轉移以及轉歸密切相關[7-9]，孕激素通過受體結構中C末端的70-130氨基酸的位點結合，研究發(fā)現沉默PGRMC1基因的表達，腫瘤細胞的分裂和增殖受到明顯抑制[10]，PGRMC1能影響3-H孕激素入胞率，導致孕激素介導的滋養(yǎng)細胞抗凋亡功能喪失[11，12]。以往的研究發(fā)現該受體為阿片類受體，但是他又與經典的阿片類受體不具有同源性，而與細胞色素b5有高度的同源性，PGRMC1分子結構上具有細胞色素b5配體結合位點，可與血紅素Hemel分子結合而成為具有多功能活性的靶蛋白。很多實驗和臨床研究已經證實PGRMC1與乳腺癌發(fā)生發(fā)展及預后關系密切[13-16]。而對三陰性乳腺癌發(fā)生、發(fā)展與PGRMC1有無內在的相關性方面的研究資料很少，本研究試圖通過分析其腫瘤預后相關的諸多病理指標和生物因子之間內在的相關性，以探索其內在聯系。

ki-67是近年來在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中“明星”因子，日益受到臨床醫(yī)生高度重視，其本質是一種腫瘤增殖相關的核抗原蛋白，組織結構由兩條345kd、395kd的多肽鏈組成。在細胞的有絲分裂周期中發(fā)揮重要生理作用，細胞有絲分裂G1期后半期出現，M期達到鋒值，而之后迅速降解而失活。研究發(fā)現[17-20]ki-67高表達的乳腺癌患者，腫瘤細胞增殖活躍，腫瘤的生物學行為較差，生長速度快侵襲性大，惡性程度高，易發(fā)生腫瘤復發(fā)和遠處轉移，患者預后一般都比較差。研究發(fā)現[3]，ki-67在正常乳腺組織也有極低水平的表達，陽性細胞數目比率基本都<3%以下。

目前臨床上判斷乳腺癌預后的方法和指標很多：包括常規(guī)的評估乳腺癌預后的臨床病理指標、激素受體表達狀況、her-2表達情況、乳腺癌危險因子預測模型等，但是腫瘤的異形性和異質性決定了現行的預測手段無法理想地判斷預后，進而無法取得滿意的療效，從而導致腫瘤早期出現復發(fā)轉移，患者生存質量下降和生存時間縮短。本課題研究發(fā)現ki-67與PGRMC1在三陰性乳腺癌的表達呈正相關，在三陰性乳腺癌的表達中陰性、陽性、強陽性表達的趨勢基本一致，二者在三陰性乳腺癌中均為高表達。診斷特征曲線對PGRMC1和ki-67診斷三陰性乳腺癌敏感度也是基本接近，有較高的敏感度。那么兩者之間是否存在內在的必然的聯系，目前有關這方面的研究很少[21]，是否存在PGRMC1結合胞漿游離雌、孕激素而激活下游基因從而引起ki-67的高表達？那么敲除PGRMC1基因后ki-67增殖活性降低？從而降低腫瘤的侵襲性。ki-67在有絲分裂周期中需要經過磷酸化和去磷酸化然后才能降解，雙肽鏈的結構或可提示我們ki-67表達可能受蛋白酶旁路調控。PGRMC1能激活細胞內的Akt激酶，從而引起Akt的磷酸化。由此可以推測PGRMC1作為一種活性轉換蛋白直接參與細胞信號轉導通路活化?；罨腁kt參與了ki-67磷酸化，從而干預有絲分裂的進程。本臨床研究只是發(fā)現了此規(guī)律，要揭示這些真相有待后續(xù)的基礎研究進行驗證和考量。

既往研究證實PGRMC1既具有孕激素受體功用，同時也具有雌激素受體的效能，在乳腺癌發(fā)展途中雌激素受體陰性的乳腺癌有著更強的侵襲性，以及與雌激素受體陽性的乳腺癌有著不同的代謝通路和模式。因此，PGRMC1作為雌激素的負向調節(jié)蛋白，在三陰性乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展及轉歸中起著重要的作用，可能成為三陰性乳腺癌治療的新靶點。本課題分析了PGRMC1和ki-67在正常乳腺組織及三陰性乳腺癌組織中的表達情況，結果發(fā)現PGRMC1在三陰性乳腺癌中呈現高表達，同時發(fā)現PGRMC1陽性表達在三陰性乳腺癌組織中呈現不均衡性，強弱不等，不同組織切片中PGRMC1表達有差異，同時發(fā)現同一張組織切片PGRMC1表達在不同區(qū)域顆粒著色不均一。進而探索分析TNBC組織中PGRMC1的表達與臨床病理指標和ki-67之間的關系。結果發(fā)現TNBC組織中PGRMC1的表達與腫瘤的生物學行為、總體生存率、無瘤生存率以及ki-67的表達呈正相關性；多因素統(tǒng)計分析結果提示PGRMC1可作為三陰性乳腺癌的潛在腫瘤生物標志物，以及癌干細胞的治療靶標（P=0.002）。

[參考文獻]

[1] Jumppanen M，Gruberger-Saal S，Kauraniemi P，et al. Basallike phenotype is not assosiated with patient survival in estrogen-receptor-negative breast cancers[J]. Breast Cancer Res，2007，9（1）：16.

[2] Cahill MA. Progesterone receptor membrane component 1：An integrative review[J]. J Steroid Biochem Mol Biol，2007， 105（15）：16-36.

[3] 邵志敏，余科達. 乳腺癌預后標記物·精準醫(yī)學時代的乳腺腫瘤學[M]. 上海：復旦大學出版社，2016：414-415.

[4] Reis-Filho JS，Pusztai L. Gene expression profiling in breast cancer：Classification，prognostication，and prediction[J]. Lancet，2011，378（9805）：1812-1823.

[5] Liu B，Arbogast LA. Gene expression profiles of intracellular and membrane progesterone receptor isoforms in the mediobasal hypothalamus during pro-oestrus[J]. J Neuroendocrinol，2009，21（12）：993-1000.

[6] Ahmed IS，Chamberlain C，Craven RJ. S2R（Pgrmc1）：The cytochrome-related sigma-2 receptor that regulates lipid and drug metabolism and hormone signaling[J]. Expert Opin Drug Metab Toxicol，2012，4（10）：234-239.

[7] Ruan X，Zhang Y，Mueck AO，et al. Increased expression of progesterone receptor membrane component 1 is associated with aggressive phenotype and poor prognosis in ER-positive and negative breast cancer[J]. Menopause，2016， 3（2）：123-125.

[8] Salazar M，Lerma-Ortiz A，Hooks GM，et al. Progestin-mediated activation of MAPK and AKT in nuclear progesterone receptor negative breast epithelial cells：The role of membrane progesterone receptors[J]. Gene，2016，591（1）：6-13.

[9] Neubauer H，Ma Q，Zhou J，et al. Possible role of PGRMC1 in breast cancer development[J]. Climacteric，2013，16（5）：509-513.

[10] Peluso JJ，Romak J，Liu X. Progesterone receptor membrane component-1（PGRMC1） is the mediator of progesterone's antiapoptotic action in spontaneously immortalized granulosa cells as revealed by PGRMC1 small interfering ribonucleic acid treatment and functional analysis of PGRMC1 mutations[J]. Endocrinology，2008，149（2）：534-543.

[11] Xu J，Zeng C，Chu W，et al. Identification of the PGRMC1 protein complex as the putative sigma-2 receptor binding site[J]. Nat Commun，2011，2（3）：1338-1386.

[12] Ahmed IS，Rohe HJ，Twist KE，et al. Pgrmc1（progesterone receptor membrane component 1） associates with epidermal growth factor receptor and regulates erlotinib sensitivity[J]. J Biol Chem，2010，285（32）：24775-24782.

[13] Schneck H，Ruan X，Seeger H，et al. Membrane-receptor initiated proliferative effects of dienogest in human breast cancer cells[J]. Gynecol Endocrinol，2013，29（2）：160-163.

[14] Hampton KK，Stewart R，Napier D，et al. PGRMC1 elevation in multiple cancers and essential role in stem cell survival[J]. Adv Lung Cancer（Irvine），2015，4（3）：37-51.

[15] Mir SU，Ahmed IS，Arnold S，et al. Elevated progesterone receptor membrane component 1/sigma-2 receptor levels in lung tumors and plasma from lung cancer patients[J]. Int J Cancer. 2011，10（1），26-32.

[16] Clark NC，Friel AM，Pru CA，et al. Progesterone receptor membrane component 1 promotes survival of human breast cancer cells and the growth of xenograft tumors[J]. Cancer Biol Ther，2016，17（3）：262-71.

[17] Wang B，Wang X，Wang J，et al. Expression of Ki67 and clinicopatho logical features in breast cancer[J]. Zhonghua Zhong Liu Za Zhi，2014，36（4）：273-275.

[18] 徐晗，狄根紅，楊恭. MAPK信號激活抑制三陰性乳腺癌細胞的遷移和侵襲[J]. 中國癌癥雜志，2013，23（11）：874-879.

[19] 翁劍華，許素真，胡美笑. ki67在三陰性乳腺癌中的表達及意義[J]. 臨床與實驗醫(yī)學雜志，2016，1（15）：126-128.

[20] 陳曦，吳晶晶 ，張妍，等. 三陰性乳腺癌臨床病理特征及與藥物敏感度蛋白的相關性[J]. 腫瘤防治研究，2014，41（5）：439-442.

[21] Zhang Y，Ruan X，Willibald M，et al. May progesterone receptor membrane component 1（PGRMC1）predict the risk of breast cancer？[J]. Gynecol Endocrinol，2016，32（1）：58-60.

（收稿日期：2016-08-19）