醫(yī)用臭氧對兔膝骨關(guān)節(jié)炎炎性因子水平的影響

陳小剛++++++呂一++++++李桂錦++++++曾宇晴

[摘要] 目的 觀察醫(yī)用臭氧在兔膝骨關(guān)節(jié)炎中的應用及對關(guān)節(jié)滑液中腫瘤壞死因子（TNF-α）、白細胞介素（IL-1β）、基質(zhì)金屬蛋白酶-1（MMP-1）水平的影響。 方法 取新西蘭大白兔60只，采用改良Hulth法建立兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型。根據(jù)處理方法不同分為空白對照組（n=20）、對照組（n=20）及觀察組（n=20）?？瞻讓φ战M不采取任何方法處理，對照組灌服生理鹽水治療，觀察組采用醫(yī)用臭氧治療。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定三組治療前后TNF-α、IL-1β、MMP-1水平，比較三組治療效果。 結(jié)果 觀察組大白兔采用醫(yī)用臭氧進行6周處理后關(guān)節(jié)軟骨光澤明亮，光滑無裂紋，滑膜為白色、光澤、光滑，滑液量相對較少，無色；對照組新西蘭大白兔局部軟化，部分大白兔出血潰瘍，滑膜充血、水腫，并且滑液量相對較多。三組處理前TNF-α、IL-1β、MMP-1水平比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；觀察組處理后TNF-α、IL-1β、MMP-1水平低于對照組和空白對照組（P<0.05），對照組處理后TNF-α、IL-1β、MMP-1水平低于空白對照組（P<0.05）。 結(jié)論 采用醫(yī)用臭氧治療兔膝骨關(guān)節(jié)炎效果理想，能降低關(guān)節(jié)滑液中TNF-α、IL-1β、MMP-1水平。

[關(guān)鍵詞] 醫(yī)用臭氧；兔膝骨關(guān)節(jié)炎；關(guān)節(jié)滑液；TNF-α；IL-1β；MMP-1

[中圖分類號] R684.3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2016）34-0004-04

Effect of medical ozone on the levels of inflammatory factors of knee osteoarthritis in rabbits

CHEN Xiaogang LV Yi LI Guijin ZENG Yuqing

Department of Orthopedics， the Third Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University， Hangzhou 310005， China

[Abstract] Objective To observe the application of medical ozone in rabbit knee osteoarthritis and to investigate its effect on the levels of tumor necrosis factor （TNF-α）， interleukin （IL-1β） and matrix metalloproteinase-1（MMP-1） in synovial fluid. Methods 60 New Zealand white rabbits were collected， and the model of rabbit knee osteoarthritis was established by modified Hulth method. They were assigned to the blank control group （n=20）， the control group （n=20） and the observation group（n=20） according to the different treatment methods. The blank control group was not given any treatment method， the control group was orally given normal saline， and the observation group was treated with medical ozone. The level of TNF-α， IL-1β and MMP-1 in the three groups before and after treatment were measured by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）. The curative effect was compared among three groups. Results The rabbits in the observation group were treated with medical ozone for 6 weeks. The articular cartilage was bright and smooth without cracks. The synovium was white， shiny， and smooth. The amount of synovial fluid was relatively small and colorless. The local part was softened in the New Zealand rabbits in the control group. Hemorrhage ulcer， synovial congestion and edema could be observed in some rabbits， and the amount of synovial fluid was relatively much； there was no statistically significant difference in the levels of TNF-α， IL-1β and MMP-1 among three groups before the treatment（P>0.05）； the levels of TNF-α， IL-1β and MMP-1 in the observation group after treatment were lower than those in the control group and the blank control group（P<0.05）. The levels of TNF-α， IL-1β and MMP-1 in the control group after the treatment were lower than those in the blank control group（P<0.05）. Conclusion The therapeutic effect of medical ozone in the treatment of knee osteoarthritis is ideal， which can decrease the levels of TNF-α， IL-1β and MMP-1 in synovial fluid.

[Key words] Medical ozone； Rabbit knee osteoarthritis； Synovial fluid； TNF-α； IL-1β； MMP-1

骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是臨床上常見的疾病，該疾病屬于退行性骨關(guān)節(jié)病，具有較高的發(fā)病率、致殘率，患者發(fā)病后如果不采取有效的方法治療，將會誘發(fā)其他疾病，嚴重影響患者生活質(zhì)量[1]。目前，臨床上對于OA以對癥支持治療、關(guān)節(jié)鏡清理、人工關(guān)節(jié)置換術(shù)為主，這些方法雖然能改善患者癥狀，但是長期療效欠佳，手術(shù)治療費用相對較高，治療適應證較窄，難以滿足每位患者治療需要[2，3]。文獻報道顯示[4，5]，近年來注射療法因其具有較好的療效、相對減輕全身用藥后對身體的副作用少及較低的費用而發(fā)展迅速，已廣泛應用于臨床，其中醫(yī)用臭氧在OA患者中效果理想，該方法能有效改善機體癥狀，促進機體恢復，但是其具體機制尚不完全知曉。為探討醫(yī)用臭氧在兔膝骨關(guān)節(jié)炎中的應用及對關(guān)節(jié)滑液中腫瘤壞死因子（TNF-α）、白細胞介素（IL-1β）、基質(zhì)金屬蛋白酶-1（MMP-1）水平的影響，選取2015年1月～2016年7月校動物實驗室的新西蘭大白兔60只進行試驗，現(xiàn)報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

取新西蘭大白兔60只，根據(jù)處理方法不同分為空白對照組（n=20）、對照組（n=20）及觀察組（n=20），雌雄隨機，體重1.6～3.0 kg，平均（2.3±0.4）kg，所選動物由校動物實驗中心提供，動物批號[（2014）120482551]。實驗過程中對新西蘭大白兔飼養(yǎng)、處理均符合《關(guān)于善待實驗動物的指導性意見》相關(guān)規(guī)則。所有試驗均通過醫(yī)院動物委員會批準同意。

1.2 主要儀器和試劑

為保證試驗的順利完成，采用的主要儀器和試劑有動物手術(shù)器械一套（實驗室前期自制）、-70℃超低溫冰箱（實驗室提供）、超凈工作臺（日本Olympus公司）、低速冷凍離心機（北京鼎國生物公司）、離心管、微量加樣器（實驗室提供）。

1.3 方法

1.3.1 模型的建立 三組均在兩側(cè)膝關(guān)節(jié)實施手術(shù)，采用改良Hulth法建立兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型，建立模型前采用0.1 mg/kg、濃度為2%的戊巴比妥鈉進行耳緣靜脈麻醉，術(shù)區(qū)備皮，常規(guī)消毒后，行膝內(nèi)側(cè)縱行切口，逐層切開后充分暴露內(nèi)側(cè)副韌帶，切開關(guān)節(jié)囊，將兔內(nèi)側(cè)副韌帶、內(nèi)側(cè)半月板及前交叉韌帶切斷，建立兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型。術(shù)后新西蘭大白兔分籠飼養(yǎng)，不固定傷肢，每只大白兔建立模型后注射40萬單位青霉素，連續(xù)注射3 d預防感染[6，7]。

1.3.2 處理方法 三組大白兔建立模型后7 d開始實施相應的方法處理。空白對照組不采取任何方法處理。對照組灌服生理鹽水治療，對大白兔每天灌服10 mL生理鹽水，每天3次，連續(xù)灌服6周（1個療程）。觀察組采用醫(yī)用臭氧治療，新西蘭大白兔仰臥在操作臺上，膝關(guān)節(jié)下墊一個枕頭，調(diào)整體位充分暴露膝關(guān)節(jié)。采用2～5 mL濃度為2%的利多卡因麻醉，采用5號針頭抽取5 mL膝關(guān)節(jié)積液，向雙膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)一次性注射濃度為40 μg/mL的醫(yī)用臭氧5 mL，注射完畢后進行包扎[8，9]。

1.4 檢測方法

三組治療前后采用5 mL空針抽取2 mL生理鹽水，緩慢注入關(guān)節(jié)腔內(nèi)，待關(guān)節(jié)腔周圍組織膨脹后停止注入，反復抽吸，移到試管內(nèi)待檢。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定三組治療前后TNF-α、IL-1β、MMP-1水平，相關(guān)操作步驟必須嚴格遵循儀器、試劑盒操作說明[10，11]。

1.5 觀察指標

（1）大體觀察。三組大白兔處理6周后處死，觀察三組新西蘭大白兔膝關(guān)節(jié)形態(tài)、光澤、滑液量等。（2）檢測TNF-α、IL-1β、MMP-1水平。觀察三組處理前后TNF-α、IL-1β、MMP-1水平。

1.6 統(tǒng)計學分析

采用SPSS18.0統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù)，計數(shù)資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗，計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗及方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 三組大白兔處理6周后膝關(guān)節(jié)形態(tài)

觀察組大白兔采用醫(yī)用臭氧進行6周處理后關(guān)節(jié)軟骨光澤明亮，光滑無裂紋，滑膜為白色、光澤、光滑，滑液量相對較少，無色；對照組新西蘭大白兔局部軟化，部分大白兔出血潰瘍，滑膜充血、水腫，并且滑液量相對較多，見圖1。

2.2 三組大白兔處理前后TNF-α、IL-1β、MMP-1水平比較

三組大白兔處理前TNF-α、IL-1β、MMP-1水平比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；觀察組處理后TNF-α、IL-1β、MMP-1水平低于對照組和空白對照組（P<0.05），對照組處理后TNF-α、IL-1β、MMP-1水平低于空白對照組（P<0.05），見表1。

3討論

骨性關(guān)節(jié)炎是臨床上常見的疾病，它是一種病因不同，但是生物學、形態(tài)學及臨床表現(xiàn)相似的疾病，患者發(fā)病后不僅會引起關(guān)節(jié)軟骨損害，還會累及整個滑膜、軟骨、下骨、關(guān)節(jié)囊和關(guān)節(jié)周圍肌肉，嚴重者最終會引起關(guān)節(jié)軟骨退變、纖維化、潰瘍等，甚至威脅整個關(guān)節(jié)面。文獻報道表明，骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生與炎癥、創(chuàng)傷、年齡及肥胖等有關(guān)。患者發(fā)病后臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨退變、軟骨下硬化、滑膜組織增生等。近年來，醫(yī)用臭氧在骨關(guān)節(jié)炎中得到應用，且效果理想。本課題以大白兔為研究對象，采用醫(yī)用臭氧進行治療。本研究中，觀察組大白兔采用醫(yī)用臭氧進行6周處理后關(guān)節(jié)軟骨光澤明亮，光滑無裂紋，滑膜為白色、光澤、光滑，滑液量相對較少，無色；對照組新西蘭大白兔局部軟化，部分大白兔出血潰瘍，滑膜充血、水腫，并且滑液量相對較多。醫(yī)用臭氧是氧氣與臭氧根據(jù)一定的比例混合的氣體，其主要有效成分為臭氧，它是氧的同素異形體，分子由動態(tài)不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的三個氧原子組成，并且化學性能極其不穩(wěn)定[12-14]。同時，臭氧還是一種強氧化劑，具有較強的氧化消毒、殺菌能力，能產(chǎn)生活性氧和脂質(zhì)過氧化物，從而發(fā)揮疾病治療效果。國內(nèi)學者[15]進行一項試驗，試驗中將48例OA患者隨機分為臭氧治療組與玻璃酸鈉治療組，比較患者治療前后VAS及關(guān)節(jié)功能情況，結(jié)果顯示在解除關(guān)節(jié)疼痛及關(guān)節(jié)功能改善的優(yōu)良率方面，臭氧治療組優(yōu)于玻璃酸鈉組（P<0.05），同時，組間患者治療不良反應發(fā)生率比較差異無統(tǒng)計學意義。目前，臨床上對于OA的發(fā)病機制尚不完全知曉，發(fā)病后以關(guān)節(jié)軟骨降解為主，而TNF-α、IL-1β、MMP-1水平在OA的發(fā)生、發(fā)展中均發(fā)揮重要的作用，醫(yī)用臭氧的運用能有效地緩解機體關(guān)節(jié)活動能力限制，從而改善機體關(guān)節(jié)滑液的氧平衡，及時清除體內(nèi)的自由基，減輕氧化壓力，從而緩解機體炎癥，促進機體病灶關(guān)節(jié)早期恢復[15-19]。從本研究可以看出，醫(yī)用臭氧的應用能降低關(guān)節(jié)滑液中TNF-α、IL-1β、MMP-1水平，快速改善機體癥狀，為后續(xù)治療奠定基礎。但是，對于單一采用臭氧治療效果不理想者，則可以聯(lián)合其他方法治療，發(fā)揮不同治療方案優(yōu)勢，達到優(yōu)勢互補，提高臨床治療效果。

綜上所述，兔膝骨關(guān)節(jié)炎采用醫(yī)用臭氧治療效果理想，能降低關(guān)節(jié)滑液中TNF-α、IL-1β、MMP-1水平，為臨床治療膝骨關(guān)節(jié)炎提供依據(jù)和參考。

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（收稿日期：2016-09-22）