膀胱移行細胞癌組組織Bcl-2的表達及與臨床生物學行為的關系

楊立軍 鄭文武 周安傳 蘇曉哲 吳亞東 李珅

·論著·

膀胱移行細胞癌組組織Bcl-2的表達及與臨床生物學行為的關系

楊立軍 鄭文武 周安傳 蘇曉哲 吳亞東 李珅

目的 探討B(tài)cl-2在膀胱移行細胞癌及癌旁組織中的蛋白表達水平，分析其與臨床病理指標的關系及意義，為膀胱移行細胞癌的診斷及臨床治療提供理論依據。方法 用流式細胞分析技術檢測45例膀胱移行細胞癌及對應的45例癌旁組織及10例正常膀胱黏膜移行上皮組織中的Bcl-2蛋白的表達。結果 癌旁組織組Bcl-2陽性率高于正常膀胱組和膀胱移行細胞癌組，膀胱移行細胞癌組表達陽性率高于正常膀胱組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Bcl-2表達與膀胱移行細胞癌的組織學分級關系密切(P<0.05)，而與患者性別、年齡、淋巴轉移情況及腫瘤臨床分期等均無相關性(P>0.05)。膀胱移行細胞癌組織Bcl-2蛋白表達陽性的凋亡率明顯低于陰性表達(P<0.05)。結論Bcl-2在正常膀胱組織中低表達。Bcl-2隨著膀胱癌病理分級的增加陽性率逐漸增加，在膀胱移行細胞癌中，Bcl-2發(fā)揮重要作用，與膀胱移行細胞癌的生物學行為密切相關。

Bcl-2:膀胱移行細胞癌：癌旁：蛋白表達：流式細胞分析技術

研究發(fā)現(xiàn)，細胞增殖和凋亡因子失衡是腫瘤發(fā)生的關鍵因素，其受到內源性(遺傳、免疫、種族、內分泌等)和外源性因素(化學、物理、生物等)的影響[1]。凋亡抑制蛋白(IAP)是一類內源性抑制因子，其主要通過Caspases蛋白酶激活級聯(lián)反應途徑和腫瘤壞死因子受體介導的信號轉導途徑抑制細胞凋亡，其高表達引起凋亡不足，與腫瘤發(fā)生關系密切。Bcl-2蛋白是一種具有抑制細胞凋亡的作用蛋白，其通過細胞抗氧化作用、抑制線粒體釋放促凋亡的蛋白質、抑制促凋亡的Bax/Bak細胞毒作用等通路發(fā)揮抑制細胞凋亡。本文用流式細胞分析技術研究Bcl-2在膀胱移行細胞癌、癌旁組織中的蛋白表達水平，分析其與臨床生物學行為的關系及意義，為膀胱移行細胞癌的診斷及臨床治療提供理論方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料 標本取自2012至2013年在石家莊市第一醫(yī)院泌尿外科進行外科治療的住院患者，其中膀胱移行細胞癌45例(膀胱移行細胞癌組)、對應的癌旁組織45例(癌旁組織組)，正常膀胱黏膜組織10例(正常膀胱組)。膀胱移行細胞癌組均經術后病理證實，其中男33例，女12例；年齡26～68歲，平均年齡(50±10)歲；按照WHO病理分級：G1 12例，G2 20例，G3 13例；TNM臨床分期診斷標準：非浸潤性癌(Ta-1期)19例，浸潤性癌(T2～4期)26例;單發(fā)24例，多發(fā)21例；初發(fā)29例，復發(fā)16例；正常膀胱組患者10例均為前列腺增生癥、膀胱結石的膀胱黏膜組織且經病理證實，其中男7例，女3例；年齡27～69歲，平均年齡(51±9)歲。上述標本經4%多聚甲醛固定。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑：兔抗人Bcl-2多克隆抗體：SantaCruz公司；hanks(緩沖液)：百浩生物科技有限公司；AlexaFiuor488(異硫氰酸熒光素)：Proteintech公司：胃蛋白酶工作液：上海易欣生物科技有限公司

1.2.2 儀器：BDFACSEALIBUR流式細胞儀BDBioscience公司(U.S.A)

1.3 試驗方法 應用流式細胞分析技術檢測。

1.4 試驗步驟 在檢測蛋白免疫熒光標記物時，設hanks(緩沖液)為陰性對照，二抗AlexaFiuor488(異硫氰酸熒光素)為陽性對照。具體操作步驟如下：

1.4.1 標本蠟塊的處理：在切片機上將蠟塊包埋的組織切取3～5片40～50μm厚的組織片。

1.4.2 脫蠟：將切取的組織片放入試管中，用二甲苯5～8ml(室溫)浸泡2～3d，其間更換1次或2次二甲苯，脫凈石蠟。

1.4.3 水化：依次用100%、95%、70%、50%濃度的乙醇6～8ml對組織進行水化，每次水化10～15min，棄掉乙醇。加入0.9%氯化鈉溶液5～8ml浸泡30min，棄掉0.9%氯化鈉溶液。

1.4.4 消化：經水化的組織加入0.5%胃蛋白酶(pH值1.5～2.0)2ml，置37℃恒溫水浴中，每10分鐘振蕩1次。30min后，立即加入0.9%氯化鈉溶液終止消化。

1.4.5 過濾：將消化好的組織放在120目不銹鋼網上，下置一平皿，用眼科剪刀將組織剪碎，用眼科鑷子輕輕搓組織，邊搓邊用0.9%氯化鈉溶液沖洗，直至將組織搓完。將平皿中的混懸液用300目銅網過濾去掉細胞團塊。

1.4.6 離心：將收集的細胞懸液離心沉淀1 500r/min，4min，去掉多余懸清液，以0.9%氯化鈉溶液漂洗1次，離心沉淀1 000r/min，4min，去掉多余懸清液，再以0.9%氯化鈉溶液漂洗1次，再離心沉淀800r/min，4min，去掉多余懸清液，剩約0.5ml。

1.4.7 標抗：將Bcl-2一抗按1∶50進行稀釋。離心后的組織加入Bcl-2抗體工作液0.1ml，靜置1h，加入hanks(0.01mol/L)5～8ml，離心沉淀800r/min，4min，棄懸清液，再加入二抗(AlexaFiuor488)100μl，2h后，加入hanks5～8ml，離心同上，除去未結合的熒光二抗，上機檢測。

1.5 結果評定標準Bcl-2蛋白表達含量以細胞的平均熒光強度表示，為了使免疫熒光定量分析更加完備，將平均熒光強度換算成熒光指數(shù)(FI)，用FI來表示Bcl-2在組織中的相對表達含量，按照組織細胞表達熒光指數(shù)大小對其進行統(tǒng)計分類，F(xiàn)I≤1判定表達量為陰性，F(xiàn)I>1判定為陽性。應用流式細胞儀檢測Bcl-2陽性和陰性表達細胞的凋亡率。

2 結果

2.1 3組Bcl-2蛋白在膀胱組織中的表達比較Bcl-2在正常膀胱組、膀胱移行細胞癌組、癌旁組織組的陽性表達率為10.00%、51.11%、73.33%，癌旁組織組Bcl-2陽性率高于正常膀胱組和膀胱移行細胞癌組，膀胱移行細胞癌組表達陽性率高于正常膀胱組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組Bcl-2表達陽性率比較 例

注：與正常膀胱組比較，*P<0.05；與膀胱移行細胞癌組比較，#P<0.05

2.2 膀胱移行細胞癌組Bcl-2表達陽性率與臨床病理特征的關系Bcl-2表達與膀胱移行細胞癌的組織學分級初發(fā)、復發(fā)情況關系密切(P<0.05)，而與患者性別、年齡、淋巴轉移情況及腫瘤臨床分期等均無相關性(P>0.05)。見表2。

表2 膀胱移行細胞癌組Bcl-2表達陽性率與臨床病理特征的關系 n=45，例(%)

注:與G1比較，*P<0.05；與G2比較，#P<0.05；與初發(fā)比較，△P<0.05

2.2Bcl-2蛋白表達與凋亡率的關系 膀胱移行細胞癌組織Bcl-2蛋白表達陽性的凋亡率明顯低于陰性表達(P<0.05)。見表3。

組別凋亡率t值P值陽性(n=23)4．29±0．6716．3410．000陰性(n=22)8．85±1．15

3 討論

研究表明，細胞凋亡過程中線粒體是具有重要作用的超微結構，凋亡過程中線粒體通透性轉換孔、跨膜電位變化、細胞色素C等均依賴于線粒體[2]。線粒體膜上Bcl-2家族蛋白可以調節(jié)線粒體內外膜的滲透性改變線粒體形態(tài)，細胞色素C釋放，進一步與其他物質組裝成凋亡小體，激活caspase9、caspase3，引起caspases級聯(lián)激活反應導致細胞凋亡,或直接作用于細胞核引起細胞凋亡。由此可見,線粒體除了具有經典的生物學效應外,還具有調控細胞存亡的重要作用[1]。

Bcl-2基因是一種原癌基因，研究發(fā)現(xiàn)許多基因結構與Bcl-2相似，參與細胞凋亡的調解，因此將這些基因統(tǒng)稱為Bcl-2基因家族。Bcl-2基因是t(14∶18)染色體異位斷點處發(fā)現(xiàn)的一種癌基因。Bcl-2家族迄今為止發(fā)現(xiàn)的Bcl-2家族同源蛋白不少于15種,均含有一種以上Bcl-2家族共有同源序列(BH1-BH4)。Bcl-2蛋白家族是一組和Bcl-2蛋白在氨基酸序列和(或)蛋白質空間結構上具有有同源性的蛋白質，根據功能可以分為兩類：抗凋亡和促凋亡蛋白。Bcl-2家族中抑制凋亡因子與促進凋亡因子的比例決定細胞的命運。Bcl-2蛋白家族按結構可以分為三類：(1)前凋亡蛋白：BH3-only蛋白，具有共同的基序，稱為BH3結構域，它感應不同的信號啟動細胞凋亡。BH3-only蛋白已被進一步分為“增敏劑/誘導劑”，如Noxa,Bfm或Bik，可抗凋亡Bcl-2蛋白作用并中和它的抗凋亡功能，和“直接激活劑”，如Bid和Bim，它們有能力直接激活促凋亡Bcl-2蛋白BaxandBak,多數(shù)抗凋亡蛋白含BH1和BH2區(qū),與Bcl-2高度同源的含1～4四個區(qū)[2]。(2)促凋亡蛋白Bax和Bak，含結構域BH1、BH2、BH3；它們直接參與MOM穿孔反應。(3)抗凋亡Bcl-2蛋白，含結構域BH1、BH2、BH3、BH4如Bcl-2，bclxl，中，Mcl-1和A1，通過直接與促凋亡成員作用抑制細胞死亡。前凋亡蛋白之間、抗凋亡蛋白之間及這兩類蛋白之間可相互作用形成同源或異二聚體,形成一個復雜的調控網絡,前凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的相對比值在決定細胞生存抑或死亡中可能起關鍵作用。

Bcl-2蛋白是抗凋亡蛋白之一，位于線粒體內膜、核膜和內質網，分子量為26 000，它是人類濾泡狀淋巴瘤的細胞遺傳學標志。目前，關于Bcl-2抑制細胞凋亡的研究很多，Bcl-2的高表達可保護各種凋亡刺激，因此Bcl-2低表達或缺失的細胞死亡率明顯增加。

Bcl-2蛋白家族對細胞凋亡的調控作用：(1)Bcl-2家族對線粒體通路的凋控，該通路的線粒體滲透性改變形成的PT孔 (permeabilitytransitionpore)開放和線粒體內致凋亡的多種蛋白釋放均受Bcl-2家族凋控。Bcl-2或其他抗凋亡蛋白過表達使許多本可致PT孔開放、細胞色素C及凋亡誘導因子 (apoptosisinducingfactor,AIF)釋放的刺激失效，從而抑制細胞凋亡;而前凋亡蛋白Bax過表達導致線粒體跨膜電位丟失及細胞色素C釋放導致細胞凋亡[3]。Shimizu等[4]發(fā)現(xiàn)重組前凋亡蛋白Bax和Bak能加速電壓依賴的陰離子通道(voltagedependentanionchannel,VDAC)開放,而Bcl-XL則通過直接與之結合關閉VDAC,提示Bcl家族蛋白可通過VDAC調節(jié)線粒體膜的通透性,影響膜電位及細胞色素C釋放,從而促進或抑制凋亡[4]。(2)Bcl-2家族對內質網通路的凋控，研究表明，胞質中較高的鈣濃度，可導致線粒體PT孔道的形成和母體的膨脹。結果，線粒體外膜破裂，膜間隙中的促凋亡蛋白流入細胞質，促進細胞凋亡[4]。鈣濃度變化在內質網通路中是很關鍵的凋亡信號,Bcl-2家族除存在于線粒體膜表面外,也存在于內質網膜,能阻斷多種致使內質網釋放儲存鈣的凋亡刺激。Foyouzi等[5]發(fā)現(xiàn)Bcl-2的通過增加內質網膜對鈣離子通透性而減少內質網內可釋放的游離鈣離子濃度。(3)Bcl-2家族對死亡受體通路的凋控，死亡受體通路通過Fas,TNFR激活Caspase8直接激活Caspase3引起凋亡,主要存在于線粒體表面的Bcl-2應該對此通路無影響。但在另一些情況下Bcl-2可抑制死亡受體通路誘發(fā)的凋亡。

國內王養(yǎng)民等[6]報道:取應用免疫組化技術檢測57例經病理證實的膀胱腫瘤的Bcl-2的表達。結果顯示正常膀胱黏膜中無表達，膀胱移行細胞癌Ⅰ級15例,陽性率13.3%;Ⅱ級16例,陽性率6.2%;Ⅲ級18例,陽性率50.0%。膀胱橫紋肌肉瘤陽性1例,葡萄狀肉瘤陽性1例,內胚竇瘤陽性1例。從而得出結論:凋亡抑制基因Bcl-2蛋白在移行細胞癌及其他細胞類型的膀胱癌中有表達,如膀胱橫紋肌肉瘤、葡萄狀肉瘤及內胚竇瘤；而在Ⅲ級移行細胞癌中表達陽性率明顯高于Ⅰ、Ⅱ級腫瘤,說明Bcl-2蛋白的表達與膀胱腫瘤的分級有一定關聯(lián)；但Bcl-2蛋白的表達能否作為膀胱腫瘤標志物及與膀胱腫瘤患者存活有否關系仍需進一步深入的研究。Shiina等[7]用免疫組化的方法,結果發(fā)現(xiàn)Bcl-2 在膀胱移行細胞癌中表達為24.7%,在癌旁移行上皮中為96.1%。國內康元上等[8]在膀胱膀胱癌及癌旁組織p53、Bcl-2表達的初步研究的結果顯示：腫瘤上皮中表達為31.1%,而在癌旁組織中為53.3%～75.5%。說明Bcl-2在表淺性BTCC及癌旁組織的基底及基底下層高表達。癌組織與癌旁組織Bcl-2的表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。國內羅旭等[9]報道，Bcl-2在非浸潤性膀胱癌的陽性率低于浸潤性膀胱癌的陽性率，但相互間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。表明Bcl-2蛋白表達與膀胱癌的臨床分期無關。Bcl-2在復發(fā)性膀胱癌的陽性率高于初發(fā)性膀胱癌的陽性率，相互間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明Bcl-2蛋白表達與膀胱癌的復發(fā)有關，可作為膀胱癌術后預測腫瘤復發(fā)的監(jiān)測指標之一。國內習小慶等[10]報告的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級膀胱癌的陽性率分別為18.8%、52.0%和60.0%,表明其表達與癌組織的惡性程度有相關關系。有文獻報道,在子宮內膜增生、胃腸上皮發(fā)育異常、皮膚組織病中Bcl-2表達明顯增高,在前列腺、胃腸道癌旁組織中Bcl-2的表達亦明顯增高[11-13]。癌旁組織Bcl-2表達的增高,說明Bcl-2基因可能是腫瘤發(fā)生與進展的早期。

Bcl-2在正常膀胱黏膜中低表達,在移行細胞癌及其他細胞類型的膀胱癌如膀胱橫紋肌肉瘤、葡萄狀肉瘤及內胚竇瘤中有表達，在Ⅲ級移行細胞癌中表達陽性率明顯高于Ⅰ、Ⅱ級腫瘤,說明Bcl-2蛋白的表達與膀胱腫瘤的分級有關聯(lián)。Bcl-2在非浸潤性膀胱癌的陽性率低于浸潤性膀胱癌的陽性率，但相互間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。表明Bcl-2蛋白表達與膀胱癌的臨床分期無關。Bcl-2在復發(fā)性膀胱癌的陽性率高于初發(fā)性膀胱癌的陽性率，相互間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明Bcl-2蛋白表達與膀胱癌的復發(fā)有關，可作為膀胱癌術后預測腫瘤復發(fā)的參考指標之一。但Bcl-2蛋白的表達能否作為膀胱腫瘤標志物及與膀胱腫瘤患者的存活率是否有關系仍需進一步深入的研究。

本試驗Bcl-2在正常膀胱黏膜中低表達,在膀胱移行細胞癌及癌旁細胞中高表達，在Ⅲ級移行細胞癌中表達陽性率明顯高于Ⅰ、Ⅱ級腫瘤,Ⅰ級與Ⅲ級，Ⅱ級與Ⅲ級相互間差異顯著(P<0.05)，說明Bcl-2蛋白的表達與膀胱腫瘤的分級有一定關聯(lián)，隨著膀胱癌惡性程度的增加Bcl-2蛋白的表達亦增加。Bcl-2在非浸潤性膀胱癌的陽性率低于浸潤性膀胱癌的陽性率，但相互間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。表明Bcl-2蛋白表達與膀胱癌的臨床分期無關。Bcl-2在復發(fā)性膀胱癌的陽性率高于初發(fā)性膀胱癌的陽性率，相互間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明Bcl-2蛋白表達與膀胱癌的復發(fā)有關，可作為膀胱癌術后預測腫瘤復發(fā)的參考指標之一。但Bcl-2蛋白的表達能否作為膀胱腫瘤標志物及與膀胱腫瘤患者的存活率是否有關系仍需進一步深入的研究。本研究結果也顯示Bcl-2表達陽性的凋亡率明顯低于陰性表達，即Bcl-2表達與凋亡率呈負相關，表明Bcl-2參與BTCC的凋亡機制。本實驗研究表明在膀胱移行細胞癌Bcl-2的表達隨著膀胱腫瘤的分化程度越差陽性表達就增加，呈現(xiàn)正相關(P<0.05)。

綜上所述，在膀胱移行細胞癌中，Bcl-2發(fā)揮重要作用，與膀胱移行細胞癌的生物學行為密切相關，深入研究Bcl-2在膀胱移行細胞癌中的蛋白表達及與其生物學行為的關系，對臨床指導治療、判斷預后提供理論依據。

1 徐開屏,孫鳳艷.線粒體釋放的促凋亡蛋白和細胞凋亡.中國神經科學雜志,2002，18：734-735.

2ZamzamiN,BrennerC,MarzoI,etal.SubcellularandsumitochondrialmodeofactionofBcl-2likeoncoproteins.Oncogene,1998,16:2265-2282.

3WalkerC,RobertsonL,MyskowM,etal.ExpressionoftheBcl-2proteininnormalanddysplasticbronchialepithliumandlungcarcinoma.BrJCancer,1995,72:164-169.

4ShimizuS,NaritaM,TsujimotoY.Bcl-2familyproteinsregulatethereleaseofapoptogeniccytochromecbythemitochondrialchannelVDAC.Nature,1999,399:483-487.

5Foyouzi-YoussefiR,ArnaudeauS,BornerC,etal.Bcl-2decreasesthefreeCa2+concentrationwithintheendoplasmmicreticulum.ProcNatlAcadSciUSA,2000,97:5723-5728.

6 王養(yǎng)民,王榮霞,哈英娣,等.Bcl-2在膀胱腫瘤中的表達及臨床意義.西北國防醫(yī)學雜志,2000，21：107-108.

7ShiinaH,TgawM,UrakmiS,etal.TmmunohistochemicalanalysisofBcl-2expressionintransitionalcellcarcinomaofbladder.JClinPathol,1996,49:395-399.

8 康元上，石永福，徐鴻毅,等.膀胱癌及癌旁組織p53,Bcl-2的初步研究.腫瘤研究與臨床,2002，14：313-315.

9 羅旭，李春鳴.Bcl-2在膀胱癌中的表達及意義.貴州醫(yī)藥,2001，25：582-583.

10 習小慶,葛根,彭瑞元,等.膀胱癌組織中Bcl-2癌蛋白分布及意義.中華泌尿外科雜志,1997,18:304-305.

11ColombelM,SymmansF,GilS,etal.Proteinoftheapoptosis-suppressingoncoproteinBcl-2inhormore-refractoryhumanprostatecancer.AmJPathol,1993,143:390-400.

12LauwerGY,ScottGV,HendricksJ.ImmunonhistochemicalevidenceofabberratBcl-2proteinexpressioningastricepithelialdysplasia.Cancer,1994,73:2900-2904.

13BronnerMP,CulinC,ReedJC,etal.TheBcl-2proto-onco-geneandthegastro-intestinalepithelialtumorprogressionmodel.AmJPathol,1995,146:20-26.

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.10.012

050051 河北省石家莊市第一醫(yī)院泌尿外科(楊立軍、蘇曉哲、吳亞東、李珅)；河北省石家莊市第二醫(yī)院中西醫(yī)結合科(鄭文武)；河北省辛集市中西院中西醫(yī)結合外科(周安傳)

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A

1002-7386(2017)10-1486-04

2016-11-15)