紫色紅曲霉FBKL3.0018產(chǎn)酯化酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

胡娜，吳鑫穎*，李付麗，王艷，邱樹毅，吳海

（1.貴州大學(xué)貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實驗室，貴州貴陽550025；2.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽550025；3.青酒集團(tuán)有限公司，貴州黔東南556000）

紫色紅曲霉FBKL3.0018產(chǎn)酯化酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

胡娜1，2，吳鑫穎1，2*，李付麗1，2，王艷1，2，邱樹毅1，2，吳海3

（1.貴州大學(xué)貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實驗室，貴州貴陽550025；2.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽550025；3.青酒集團(tuán)有限公司，貴州黔東南556000）

以從紫色紅曲霉FBKL3.0018中固態(tài)發(fā)酵得到的粗酶制劑為研究對象，對該菌株的酯化酶酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了較系統(tǒng)的研究。通過單因素實驗確定該酶最適溫度為40℃，在30℃條件下穩(wěn)定性較好，最適pH值為6.5，在pH5.5～7.5條件下穩(wěn)定性好。Fe2+、Na+、Mn2+、Mg2+、Li+、Zn2+對酯化酶酶活力有抑制作用，Ca2+在低濃度時有促進(jìn)作用，高濃度時有抑制作用。K+對酯化酶酶活力有促進(jìn)作用，并且隨著K+濃度的升高，促進(jìn)作用逐漸增強(qiáng)。吐溫-80、十二烷基硫酸鈉（SDS）、聚乙二醇6000、阿拉伯膠4種表面活性劑對酯化酶酶活力都有抑制作用。另外，甲醇和乙醇對該酯化酶酶活力有抑制作用，甲酸、乙酸、乳酸對酯化酶酶活力有促進(jìn)作用。乙酸乙酯在低濃度時對酯化酶酶活力有抑制作用，含量為30%時反而有促進(jìn)酶活力的作用。酯化酶最大反應(yīng)速度Vmax為0.016 mol/（L·min），米氏常數(shù)Km為0.015 4 mol/L。

紫色紅曲霉；固態(tài)發(fā)酵；酯化酶；酶學(xué)性質(zhì)

HU Na1,2,WU Xinying1,2*,LI Fuli1,2,WANG Yan1,2,QIU Shuyi1,2,WU Hai3
(1.Guizhou Key Lab of Fermentation Engineering and Biological Pharmacy,Guizhou University,Guiyang 550025,China;2.School of Liquor and Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China;3.Qingjiu Group Co.,Ltd.,Qiandongnan 556000,China)

酯化酶包括脂肪酶和酯酶，酯酶（羧酸酯酶carboxylesterases）與脂肪酶功能相似，都可以催化酯類的水解與合成[1]。白酒生產(chǎn)上常用高產(chǎn)酯化酶的菌株以及酯化酶制劑來提高酯的合成，有利于增加白酒香味成分中酯的含量[2-5]。目前，關(guān)于酯化酶酶學(xué)性質(zhì)的研究主要集中在酶的最適反應(yīng)溫度，最適pH值，溫度穩(wěn)定性，酸堿穩(wěn)定性，金屬離子、表面活性劑和有機(jī)溶劑等對酶活性的影響等[6]。

胡長浩等[7]對金黃色釀膿葡萄球菌（Staphylococcus aureus）FL-12產(chǎn)耐熱性脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)脂肪酶的最適溫度是45℃，最適pH值為10，有較好的酸堿穩(wěn)定性和溫度穩(wěn)定性。K+對該酶有激活作用，Pb2+、Ba2+有抑制作用，低濃度十二烷基硫酸鈉（sodiumdodecylsulfate，SDS）抑制該酶的活性，低濃度乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid，EDTA）對該酶幾乎沒有影響；1%的TritonX 100和吐溫-80對酶活有促進(jìn)作用。胡朝陽等[8]對不動桿菌GXL02產(chǎn)脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)酶的最適溫度為50℃，最適pH值為9.0，具有較好的溫度穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性。王琰等[9]對真菌FL002產(chǎn)耐酸性脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，最適pH為6.5，在pH6.0～8.5之間，酶的穩(wěn)定性較好，40℃時酶具有很好的穩(wěn)定性。研究還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)e2+、Ca2+對脂肪酶活性產(chǎn)生抑制作用，Cu2+、Ni2+抑制作用明顯，這跟其他脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果不同。黑曲霉產(chǎn)生的脂肪酶的活性受到多種金屬離子抑制，但對Ca2+卻有依賴性[10]，表明不同菌種來源的脂肪酶有不同的酶學(xué)性質(zhì)。SDS對脂肪酶有很強(qiáng)的抑制作用，而Triton-100卻有明顯激活作用。另外，吐溫-80對酶活性基本上沒有影響[11]。

本研究從濃香型白酒釀造的中溫大曲中篩選一株高產(chǎn)酯化酶的菌株（紫色紅曲霉FBKL3.0018），以此菌株固態(tài)發(fā)酵所得的酯化酶粗酶制劑為研究對象，進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究，為濃香型白酒生產(chǎn)過程中產(chǎn)酯產(chǎn)香和黃水的回收利用等方面奠定良好的研究基礎(chǔ)[12]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫色紅曲霉FBKL3.0018：保存于貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實驗室。

所用原料為固態(tài)發(fā)酵所得的含酶培養(yǎng)物（簡稱粗酶制劑）。

Tris、鹽酸磷酸二氫鈉、甘氨酸、硫酸鎂、體積分?jǐn)?shù)95%乙醇、橄欖油、聚乙二醇、檸檬酸、檸檬酸鈉、氫氧化鈉、一水和硫酸錳、吐溫80、SDS、七水和硫酸亞鐵、無水硫酸鎂、無水氯化鈣、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV2550紫外可見分光光度計：日本島津集團(tuán)；MJX-250B-Z霉菌培養(yǎng)箱、BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；JJ-CJ-1FD潔凈工作臺：蘇州市金凈凈化設(shè)備科技有限公司；DK-98-11電熱恒溫水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司；XW-80A旋渦混合儀：海門市杜琪貝爾儀器制造有限公司；BCD-215DK冰箱：青島海爾股份有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 酶活測定方法

酯化酶酶活定義：1g含酶培養(yǎng)物于40℃、pH7.5的條件下，水解脂肪每分鐘生成1μmol的脂肪酸定義為1個酶活力單位，U。

酯化酶酶活的測定方法：按照參考文獻(xiàn)[13]的方法進(jìn)行，并根據(jù)以下公式進(jìn)行計算。

X=（B-A）×c/0.05 ×50 ×1/15 ×n=200/3 ×（B-A）×c ×n

式中：X為樣品酶活力，U/g；B為滴定樣品時消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；A為滴定空白時消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；c為氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，mol/L；0.05為氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度換算系數(shù)；50為0.05mol/L氫氧化鈉溶液1.00mL相當(dāng)于脂肪酸50μmol；1/15為反應(yīng)時間15 min，以1 min計；n為稀釋倍數(shù)。

1.3.2 最適溫度及其穩(wěn)定性

按照酶活力測定方法，測定酯化酶在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃環(huán)境中的酶活。以酶活力最高時為100%，計算相對酶活，確定酶的最適溫度。

將酯化酶制劑分別在30℃、40℃、50℃溫度環(huán)境中保溫7 h，分別在1 h、2 h、3 h、5 h、7 h時測定酯化酶殘余酶活。以保溫處理前的初始的酶活力為100%，計算保溫處理后殘余的相對酶活。

1.3.3 最適pH及其穩(wěn)定性

按照酶活力測定方法，測定酯化酶在pH5.5、pH6.5、pH7.5、pH8.5、pH9.5的緩沖溶液中的酶活。以酶活力最高時計為100%，計算相對酶活，確定酶的最適pH。

將酯化酶制劑在以上pH值條件下室溫放置24 h，分別在0 h、4 h、8 h、12 h、24 h時測定酯化酶殘余酶活。以處理前的初始的酶活力為100%，來計算處理后殘余的相對酶活。1.3.4金屬離子對酶活的影響

將酯化酶制劑與不同含量的FeSO4、MnSO4、MgSO4、CaCl2、ZnCl2、LiSO4、CuSO4、FeCl3溶液以1∶9（V/V）的比例混合均勻，使混合后的各離子濃度為1 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L。室溫（25℃）條件下放置1 h，最適條件下測定酶活力。對照組以相同體積的蒸餾水代替金屬離子溶液，將對照組酶活力計為100%，計算各相對酶活。

1.3.5 表面活性劑對酶活的影響

將酯化酶制劑與不同濃度的吐溫-80、SDS、聚乙二醇6000、阿拉伯膠溶液以1∶9（V/V）的比例混合均勻，使混合后的表面活性劑溶液含量為0.05%、0.1%、0.5%。室溫（25℃）條件下放置2 h，最適條件下測定酶活力。對照組以相同體積的蒸餾水代替表面活性劑溶液，將對照組酶活力計為100%，計算各相對酶活。

1.3.6 有機(jī)溶劑對酶活的影響

將酯化酶制劑與甲醇、乙醇、甲酸、乙酸、乳酸、乙酸乙酯以適當(dāng)比例混合均勻，使混合后的有機(jī)溶液含量分別為10%、15%、20%、25%、30%。室溫（25℃）條件下放置24h，最適條件下測定酶活力。對照組采用相同體積的蒸餾水代替有機(jī)溶劑溶液，將對照組酶活力計為100%，計算各相對酶活。

1.3.7 酯化酶米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速度Vmax值的測定

分別配制100 mmol/L、120 mmol/L、140 mmol/L、160 mmol/L、180 mmol/L、200 mmol/L、300 mmol/L、400 mmol/L、500 mmol/L的不同濃度（S）橄欖油乳化液，在最適條件下進(jìn)行反應(yīng)，測定其水解反應(yīng)速度（V）。繪制1/S與1/V的線性方程，計算酶反應(yīng)的Km、Vmax值。

2 結(jié)果與分析

2.1 最適反應(yīng)溫度

酯化酶在不同的溫度條件下其酶活的測定結(jié)果見圖1。

由圖1可知，酯化酶在40℃條件下反應(yīng)時酶活力最高。在一定范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，酶活升高。但過高的溫度會使酶失活。以40℃反應(yīng)時的酶活力為100%，30℃時酶活力為65%左右，超過40℃酶活力急劇下降。這與參考文獻(xiàn)[14]中根霉產(chǎn)酯化酶最適溫度40℃相符合。因此，該酯化酶的最適反應(yīng)溫度為40℃。

圖1 溫度對酯化酶酶活的影響Fig.1 Effect of temperature on esterifying enzyme activity

2.2 溫度穩(wěn)定性

圖2 酯化酶溫度穩(wěn)定性Fig.2 Temperature stability of esterifying enzyme activity

由圖2可知，30℃條件下酯化酶酶活力下降較緩慢，3 h時酯化酶活力仍保持在87.93%左右，7 h時酯化酶殘余酶活力為60.87%。40℃條件下，酯化酶酶活力在2 h時酶活力降為82.76%，之后酶活力下降迅速，7 h時酶活力僅剩初始酶活力的13.91%。50℃條件下，酯化酶酶活力下降非常迅速，1 h時酶活力僅為9.48%，7 h時酶活力僅為初始酶活力的5.22%。由此可以得出，該酯化酶在30℃條件下穩(wěn)定性較好，隨溫度的升高穩(wěn)定性變差，當(dāng)溫度達(dá)到50℃時，酯化酶的酶活力損失已經(jīng)很大，該溫度下酯化酶穩(wěn)定性很差。

2.3 最適pH值

圖3pH值對酯化酶酶活的影響Fig.3 Effect of pH on esterifying enzyme activity

由圖3可知，隨著pH值升高，酶活升高，在pH6.5條件下酶活力達(dá)到最高，之后隨著pH值升高，酶活力迅速下降。在一定范圍內(nèi)，隨著pH的升高，酶活升高，但過高的pH會使酶失活。因此，該酯化酶的最適pH值為6.5。該結(jié)果與大多數(shù)真菌酯化酶最適pH在弱酸性或中性范圍內(nèi)相符合[15]。

2.4 pH穩(wěn)定性

圖4 酯化酶的pH穩(wěn)定性Fig.4 pH stability of esterifying enzyme

由圖4可知，4 h時測定酯化酶活力結(jié)果發(fā)現(xiàn)，酯化酶活力下降，其中pH為6.5時酶活力下降最快，為初始酶活力的74.84%。pH為8.5時酶活力下降幅度最小，為初始酶活力的98.41%。4～12 h時，5個pH條件下酶活力都是持續(xù)下降。12～24 h時，pH8.5條件下酶活力下降最快且幅度最大，降至初始酶活力的39.68%，pH9.5時酶活力降至初始酶活力的42.68%。pH5.5、pH6.5、pH7.5條件下酶活力繼續(xù)下降，但下降幅度較小。

從整體來看，偏堿性條件下，酯化酶的穩(wěn)定性較差，僅24 h就降至初始酶活力的40%左右。pH5.5、pH6.5、pH7.5條件下，酯化酶的穩(wěn)定性較好，其中pH7.5條件下，酯化酶的穩(wěn)定性最好，24 h后酶活力為初始酶活力的68.70%。因此，該酯化酶在pH5.5～7.5穩(wěn)定性較好。該實驗結(jié)果與少根根霉（Rhizopus arrhizus）BUCT產(chǎn)酯化酶在pH6.0～8.0范圍內(nèi)酶活都較穩(wěn)定相類似[16]。

2.5 金屬離子對酶活的影響

圖5 不同金屬離子濃度對酯化酶活性的影響Fig.5 Effect of different metal ions concentration on esterifying enzyme activity

由圖5可知，F(xiàn)e2+、Na+在低濃度時對酯化酶酶活力有抑制作用，但隨著金屬離子濃度升高，F(xiàn)e2+、Na+對酯化酶酶活力的抑制作用減弱，而且有促進(jìn)作用。Ca2+卻與此相反，低濃度時對酯化酶酶活力有促進(jìn)作用，高濃度時對酯化酶酶活力有抑制作用。Mn2+、Mg2+、Li+對酯化酶酶活力有抑制作用，但隨著金屬離子濃度升高，這種抑制作用會減弱。Zn2+對酯化酶酶活力也有抑制作用，但隨著金屬離子濃度的升高，抑制作用逐漸增強(qiáng)。K+對酯化酶酶活力有促進(jìn)作用，并且隨著K+濃度的升高，促進(jìn)作用逐漸增強(qiáng)。一般來說，Ca2+可提高酯化酶酶活穩(wěn)定性和酶活，Zn2+和Mg2+在一定程度上也可抑制酯化酶活性[17]。

2.6 表面活性劑對酶活的影響

圖6 表面活性劑對酯化酶活性的影響Fig.6 Effect of surface active agents on esterifying enzyme activity

由圖6可知，4種表面活性劑對酯化酶酶活力都有抑制作用。其中，吐溫-80對酯化酶酶活力在低濃度時抑制最低，當(dāng)吐溫-80含量達(dá)到0.5%時，酶活力為初始酶活力的84.55%，其酶活降低不大。SDS對酶活抑制作用在低濃度時就有抑制，但在高濃度時（0.50%）抑制作用最強(qiáng)，其殘余酶活力僅為初始酶活力的27.27%。聚乙二醇6000及阿拉伯膠對酶活的抑制作用在高濃度時反而較弱，低濃度時較強(qiáng)。相比之下，阿拉伯膠抑制作用整體低于聚乙二醇6000。這與參考文獻(xiàn)[18]中表面活性劑吐溫-80對脂肪酶酶活影響不大，而SDS則起抑制作用相符合。

2.7 酯化酶對有機(jī)溶劑的耐受性

圖7 酯化酶對有機(jī)溶劑的耐受性Fig.7 Tolerance of esterifying enzymes in organic solvents

由圖7可知，甲醇和乙醇對該酯化酶酶活力有抑制作用，甲酸、乙酸、乳酸對酯化酶酶活力有促進(jìn)作用。乙酸乙酯在低濃度時對酯化酶酶活力有抑制作用，含量為30%時反而有促進(jìn)酶活力的作用。

甲醇在含量10%的條件下對酯化酶酶活力有較弱的抑制作用，殘余酶活力為初始酶活力的83.33%，但含量為30%時，抑制作用顯著增強(qiáng)，殘余酶活力僅為初始酶活力的16.18%。乙醇在含量為10%時對酯化酶酶活力的抑制作用就較強(qiáng)，殘余酶活力為初始酶活力的40.91%，乙醇含量為30%時抑制作用進(jìn)一步加強(qiáng)，殘余酶活力為初始酶活力的38.24%。甲酸含量為10%時對酯化酶酶活力促進(jìn)作用較強(qiáng)，酶活力達(dá)到初始酶活力的280.30%，而在含量為30%時促進(jìn)作用減弱，為初始酶活力的142.65%。乙酸含量為10%時對酯化酶酶活力的促進(jìn)作用最強(qiáng)，達(dá)到初始酶活力的424.24%，含量為30%時促進(jìn)作用減弱，為初始酶活力的233.82%。對乳酸而言，其含量為10%時酶活力為初始酶活力的200%，含量30%時促進(jìn)作用減弱，為初始酶活力的118.17%。乙酸乙酯在含量10%時對酯化酶酶活力有抑制作用，酶活力為初始酶活力的53.03%，但是當(dāng)乙酸乙酯含量達(dá)到30%時，對酯化酶酶活力反而有促進(jìn)作用，酶活力為初始酶活力的132.35%。

2.8 酯化酶Km和Vmax值的測定

圖8 酯化酶的酶促動力反應(yīng)曲線Fig.8 Enzymatic dynamic response curve of esterifying enzyme

從圖8可以得出，由雙倒數(shù)法求得該酯化酶的最大反應(yīng)速度Vmax為0.016mol/（L·min），米氏常數(shù)Km為0.0154mol/L。

3 結(jié)論

對紫色紅曲霉固態(tài)發(fā)酵得到的粗酶粉制劑進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)，酶的最適反應(yīng)溫度為40℃，最適pH值為6.5，在30℃條件下穩(wěn)定性較好，隨溫度的升高穩(wěn)定性變差，在中性偏酸性條件下穩(wěn)定性好。最大反應(yīng)速度Vmax為0.016 mol/（L·min），米氏常數(shù)Km為0.015 4 mol/L。Fe2+、Na+、Mn2+、Mg2+、Li+、Zn2+對酯化酶酶活力有抑制作用，Ca2+在低濃度時有促進(jìn)作用，高濃度時有抑制作用。K+對酯化酶酶活力有促進(jìn)作用，并且隨著K+濃度的升高，促進(jìn)作用逐漸增強(qiáng)。吐溫-80、SDS、聚乙二醇6000、阿拉伯膠4種表面活性劑對酯化酶酶活力都有抑制作用。另外，甲醇和乙醇對該酯化酶酶活力有抑制作用，甲酸、乙酸、乳酸對酯化酶酶活力有促進(jìn)作用。乙酸乙酯在低濃度時對酯化酶酶活力有抑制作用，含量為30%時反而有促進(jìn)酶活力的作用。

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TS261.1

0254-5071（2017）05-0123-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.05.026

2017-01-16

貴州省科技合作計劃項目（黔科合LH字【2014】7675號）；貴州省星火計劃項目（黔科合成轉(zhuǎn)字【2015】5337號）

胡娜（1993-），女，碩士研究生，研究方向為酶工程。

*通訊作者：吳鑫穎（1975-），女，副教授，碩士，研究方向為酶工程。