雷公藤紅素的長(zhǎng)期毒性研究

王 慧海南省藥物研究所，海南 ?？?570314

雷公藤紅素的長(zhǎng)期毒性研究

王 慧
海南省藥物研究所，海南 ?？?570314

目的：研究雷公藤紅素口服給藥的長(zhǎng)期毒性情況，確定其安全劑量。方法：分別通過設(shè)立高、中、低劑量組、空白對(duì)照組等組別，研究口服給藥3個(gè)月后對(duì)大鼠的毒性情況，結(jié)合給藥后大鼠的一般狀況、體重、攝食量、血液學(xué)檢查、尸解結(jié)果和組織病理學(xué)檢查結(jié)果進(jìn)行綜合判定，判斷動(dòng)物是否發(fā)生毒性反應(yīng)，確定大鼠無毒性反應(yīng)劑量、毒性反應(yīng)劑量或安全劑量范圍。結(jié)果：對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，3個(gè)給藥劑量在實(shí)驗(yàn)期及恢復(fù)期間均不影響大鼠體重、攝食量、臟器系數(shù)、血常規(guī)指標(biāo)、血清生化學(xué)指標(biāo)，對(duì)高劑量組進(jìn)行組織病理學(xué)檢查也尚未發(fā)現(xiàn)異常的組織病理學(xué)病變。結(jié)論：給予大鼠灌胃雷公藤紅素3個(gè)月，未觀察到與受試物本身相關(guān)的毒性反應(yīng)，在劑量470ug/kg下未見有害作用，此劑量可作為安全劑量。

雷公藤紅素；長(zhǎng)期毒性；毒性研究

雷公藤紅素(Celastrol，又名南蛇藤素)主要來源于中藥雷公藤的根皮，具有抗炎、抗氧化等活性。近年來發(fā)現(xiàn)雷公藤具有很好的抗腫瘤作用，并且市場(chǎng)需求逐年上升，盡管雷公藤紅素具有顯著的藥理活性[1]，但其毒性也不容忽視[2]，是其臨床應(yīng)用的最大問題。因此，研究對(duì)其毒性情況進(jìn)行全面而深入的認(rèn)識(shí)，在保持或提高其藥理活性的同時(shí)應(yīng)該盡可能降低其毒性。

1 儀器與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠，體重80～100g，雌雄各半。由長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司(生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(湘)2014-0011)提供。使用屏障級(jí)動(dòng)物房(使用許可證號(hào)：SYXK(瓊)2014-0025)飼養(yǎng)。A級(jí)大、小鼠維持飼料喂養(yǎng)，由長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司(生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(湘)2014-0011)提供。飲水經(jīng)消毒后由動(dòng)物自由飲用，符合SPF級(jí)動(dòng)物飲水要求。

1.2 材料 雷公藤紅素(海南省藥物研究所自提，純度90.1%)；羧甲基纖維素鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)批號(hào)：20140406)；血液化驗(yàn)分析系統(tǒng)分析試劑(稀釋液、溶血?jiǎng)┖颓逑磩?由EXIGO公司提供；血生化檢測(cè)試劑由日本和光，朗道公司提供。

1.3 儀器 DT5-2離心機(jī)(時(shí)代北利)；AUW220D電子天平(島津)；YP30K電子天平(上海良平)；TP1020脫水機(jī)(萊卡)；EG1150H石蠟包埋機(jī)(萊卡)；RM2245輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(萊卡)；HI1210攤片機(jī)(萊卡)；立式顯微鏡(索尼)；血生化測(cè)定儀(Echo plus)；動(dòng)物血細(xì)胞分析儀(Exigo)。

2 方法

2.1 試驗(yàn)方法[3]將80只SD大鼠隨機(jī)分為供試品高、中、低劑量組及空白對(duì)照組，每組20只，雌雄各半，給藥組給予雷公藤470μg/kg、94μg/kg、和47μg/kg，空白對(duì)照組給予0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，各組均按大鼠10 mL/kg體重灌胃給藥，每天1次，連續(xù)灌胃給藥12周，停止給藥2周作為恢復(fù)期觀察，給藥期(12周)和恢復(fù)期(2周)各組大鼠于第1次給藥前及給藥后至恢復(fù)期結(jié)束每周末稱體重1次，并觀察動(dòng)物的一般狀況及計(jì)算每周動(dòng)物攝食量。給藥期和恢復(fù)期，各組分別取大鼠14、6只處死，雌雄各半，麻醉后采血，測(cè)定血常規(guī)、和血清生化學(xué)指標(biāo)，大鼠重要臟器稱重后計(jì)算臟器系數(shù)，病變器官進(jìn)行主要臟器的組織病理學(xué)檢查。結(jié)合大鼠的狀況、組織病理學(xué)檢查結(jié)果及檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合判定，判斷動(dòng)物是否發(fā)生毒性反應(yīng)，確定大鼠無毒反應(yīng)劑量、毒性反應(yīng)劑量或安全劑量范圍。

2.2 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS19.0軟件單因素方差分析[4]進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，數(shù)據(jù)以(x±SD)表示，采用t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 一般狀況 給藥期及恢復(fù)期間各組大鼠活動(dòng)靈活，反應(yīng)敏捷，被毛整潔，目光有神，眼、鼻、口無異常分泌物，進(jìn)食飲水正常，未見明顯毒性反應(yīng)，各組動(dòng)物均無死亡。

3.2 對(duì)大鼠體重的影響 給藥期間，雄性大鼠，低、高劑量組動(dòng)物體重與對(duì)照組比較，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；中劑量組動(dòng)物體重，在給藥第12周，與對(duì)照組比較有所下降(P<0.05)，恢復(fù)期，雄性中劑量組恢復(fù)期第1周，與對(duì)照組比較降低(P<0.05)。其他組別與對(duì)照組比較，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表1。

雌性大鼠低劑量組動(dòng)物體重，在給藥第3周，與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；高劑量組動(dòng)物體重，在給藥第7、8、9周，與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；中劑量組動(dòng)物體重與對(duì)照組比較，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)?；謴?fù)期雌性各組與對(duì)照組比較，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表2。

表1 給藥期及恢復(fù)期的雄性大鼠體重 (g，x±SD)

注： 與對(duì)照組比較，*P<0.05。

表2 給藥期及恢復(fù)期的雌性大鼠體重 (g，x±SD)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

3.3 對(duì)大鼠攝食量的影響 給藥期間的雄性大鼠攝食量，中劑量組與對(duì)照組比較，第12周的動(dòng)物攝食量明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，高、低劑量組雄性大鼠與對(duì)照組比較差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

給藥期間的雌性大鼠攝食量，高劑量組與對(duì)照組比較，第7、8周的動(dòng)物攝食量明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其它時(shí)間差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；低、中劑量組雌性大鼠與對(duì)照組比較差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表4。恢復(fù)期，各組之間飼料消耗量差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 給藥期及恢復(fù)期的雄性大鼠攝食量 (g，x±SD)

注： 與對(duì)照組比較，*P<0.05。

表4 給藥期及恢復(fù)期的雌性大鼠攝食量 (g，x±SD)

注： 與對(duì)照組比較，*P<0.05。

3.4 對(duì)大鼠臟器系數(shù)的影響 給藥期：與對(duì)照組比較，雄性大鼠高劑量組肝臟系數(shù)及腎臟系數(shù)均明顯增大(P<0.05)，其他各臟器系數(shù)及中、低劑量組各臟器系數(shù)比較差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與對(duì)照組比較，雌性大鼠低劑量組肝臟系數(shù)明顯增大(P<0.05)，中劑量組由于個(gè)別大鼠脾臟系數(shù)較大，使該項(xiàng)指標(biāo)均值偏高，標(biāo)準(zhǔn)差較大，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其他各臟器系數(shù)及低劑量各項(xiàng)臟器系數(shù)差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表5。

恢復(fù)期：高、中、低劑量組的各項(xiàng)臟器系數(shù)與對(duì)照組比較，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表6。

表5 給藥期大鼠的臟器系數(shù) (x±SD,n=7)

注：與對(duì)照組比較*P<0.05。

表6 恢復(fù)期大鼠的臟器系數(shù) (x±SD,n=3)

3.5 對(duì)大鼠血常規(guī)的影響 給藥期：與對(duì)照組比較，雌性大鼠高劑量血小板指標(biāo)具有顯著意義(P<0.05)，同組其它指標(biāo)及其它各組指標(biāo)均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；雄性大鼠各組指標(biāo)均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表7。

恢復(fù)期：與對(duì)照組比較，雄性大鼠中劑量紅細(xì)胞指標(biāo)具有顯著意義(P<0.05)，同組其它指標(biāo)及其它各組指標(biāo)均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；雌性大鼠各組指標(biāo)均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表8。

表7 給藥期大鼠血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果 (x±SD,n=7)

注：與對(duì)照組比較*P<0.05。

表8 恢復(fù)期大鼠血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果 (x±SD,n=3)

3.6 對(duì)大鼠血清生化學(xué)指標(biāo)的影響 給藥期：雄性大鼠檢測(cè)與對(duì)照組比較，中劑量組AST明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其它同組指標(biāo)及其它各組指標(biāo)與對(duì)照組比較，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；雌性大鼠檢測(cè)結(jié)果與對(duì)照組比較，中劑量組AST明顯升高，高劑量組ALP明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其它同組指標(biāo)及其它各組指標(biāo)與對(duì)照組比較，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表9。

恢復(fù)期：雄性大鼠檢測(cè)結(jié)果與對(duì)照組比較，各劑量組所有指標(biāo)差異不具有顯著性意義(P>0.05)；雌性大鼠檢測(cè)結(jié)果與對(duì)照組比較，中劑量組及高劑量AST由于個(gè)別大鼠測(cè)定值較高，標(biāo)準(zhǔn)差較大，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其它同組指標(biāo)及其它各組指標(biāo)與對(duì)照組比較，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表10。

表9 給藥期大鼠血清生化學(xué)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果 (x±SD,n=7)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

表10 恢復(fù)期大鼠血清生化學(xué)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果 (x±SD,n=3)

3.7 剖檢觀察結(jié)果及病理組織學(xué)檢查 實(shí)驗(yàn)期及恢復(fù)期發(fā)現(xiàn)，供試品本身并不引起大鼠組織器官形狀、體積大小、色澤、位置、硬度、外膜等的異常改變。取部分高劑量組及對(duì)照組動(dòng)物剖檢，未發(fā)現(xiàn)與供試品本身相關(guān)的病理學(xué)檢查，因此不進(jìn)行中、低劑量組檢查。

4 討論

雷公藤紅素長(zhǎng)期毒性劑量組的劑量設(shè)置，是根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期研究中得到LD50 4.69mg/kg決定，大鼠3個(gè)月長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)中高、中、低3個(gè)劑量可分別采用1/10、1/50、1/100左右的LD50，符合長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)設(shè)計(jì)原則[5]。

經(jīng)3個(gè)月給藥及恢復(fù)期研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤紅素(470μg/kg、94μg/kg和47μg/kg)未引起大鼠一般狀況異常、組織器官異常及組織病理學(xué)病變，雖然大鼠體重、攝食量及個(gè)別臟器系數(shù)、血常規(guī)指標(biāo)及血清生化指標(biāo)在給藥期或恢復(fù)期出現(xiàn)部分?jǐn)?shù)據(jù)的差異性，但從整體研究周期數(shù)據(jù)來看，均未體現(xiàn)任何規(guī)律性，也不存在任何劑量相關(guān)性及性別相關(guān)性，認(rèn)為此指標(biāo)的的差異性不存在實(shí)際意義，應(yīng)并無毒理學(xué)意義。

綜上所述，在本實(shí)驗(yàn)室條件下，大鼠經(jīng)口灌胃給予雷公藤紅素3個(gè)月，未觀察到與受試物本身相關(guān)的毒性反應(yīng)，在劑量470μg/kg以下未見有害作用，在此劑量以下使用，可作為安全劑量。

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海南省自然科學(xué)基金(NO：814286)。

王慧(1984-)，漢族,女，本科，助理研究員，研究方向?yàn)樗幚韺W(xué)研究。E-mail：42321346@qq.com

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1007-8517(2017)06-0039-07

2017-01-13 編輯：梁志慶)