雙孢菇胞內和胞外多糖對伴刀豆凝集素A誘導免疫性肝損傷小鼠的保護作用

鄭丹丹，姜楠，胡揚揚，楊健華，董亮君，王琦

（吉林農業(yè)大學1.食藥用菌教育部工程研究中心，2.動物科學技術學院，吉林長春130118）

雙孢菇胞內和胞外多糖對伴刀豆凝集素A誘導免疫性肝損傷小鼠的保護作用

鄭丹丹1，姜楠1，胡揚揚2，楊健華1，董亮君1，王琦1

（吉林農業(yè)大學1.食藥用菌教育部工程研究中心，2.動物科學技術學院，吉林長春130118）

目的研究雙孢菇胞內多糖（IPS）和胞外多糖（EPS）對伴刀豆凝集素A（Con A）所致小鼠免疫性肝損傷的保護作用。方法小鼠預先ig給予IPS或EPS 100，200和400 mg·kg-1，每日1次，連續(xù)12 d，末次給藥后4 h尾靜脈注射Con A 25 mg·kg-1制備免疫性肝損傷小鼠模型。8 h后眼球取血，取肝、脾和胸腺。全自動生化分析儀測定血清谷丙轉氨酶（GPT）和谷草轉氨酶（GOT）水平。流式細胞儀檢測脾細胞中CD4+和CD8+T淋巴細胞百分比。生化試劑盒檢測血清干擾素γ（IFN-γ）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）含量及肝組織中超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）水平。光學顯微鏡觀察肝組織切片的病理改變。結果與正常對照組相比，模型小鼠胸腺指數(shù)明顯降低（P＜0.01），肝、脾指數(shù)明顯增高（P＜0.01）；與模型組比較，預先給予IPS 100，200和400 mg·kg-1及EPS 200和400 mg·kg-1小鼠胸腺指數(shù)明顯升高（P＜0.01），肝、脾指數(shù)均明顯降低（P＜0.01）。與正常對照組相比，模型小鼠血清GOT和GPT活性及TNF-α和IFN-γ含量顯著升高（P＜0.01）；預先給予IPS及EPS 200和400 mg·kg-1小鼠血清GOT和GPT活性及TNF-α和IFN-γ含量較模型組顯著降低（P＜0.01）。與正常對照組相比，模型小鼠肝組織SOD活性降低（P＜0.01），MDA水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，預先給予IPS及EPS 200和400 mg·kg-1SOD活性明顯升高（P＜0.01），MDA水平降低（P＜0.01）。與正常對照組相比，模型小鼠脾細胞中CD4+T淋巴細胞百分比和CD4+/CD8+T淋巴細胞比值明顯下降（P＜0.01）；預先給予IPS和EPS 400 mg·kg-1CD4+T淋巴細胞百分比與模型組比較明顯升高（P＜0.01），CD4+/CD8+T淋巴細胞比值變化不明顯。鏡下觀察模型組小鼠肝組織出現(xiàn)明顯的病理改變，預先給予IPS和EPS能減輕Con A引起的病理變化。結論雙孢菇IPS和EPS對小鼠免疫性肝損傷有一定的保護作用，其機制可能與清除自由基、抑制脂質過氧化和調節(jié)免疫系統(tǒng)平衡有關。

雙孢菇；多糖；免疫性肝損傷；T淋巴細胞

雙孢菇（二孢蘑菇，Agaricus bisporus）俗稱為白蘑菇、圓蘑菇或洋蘑菇，屬中低溫性菇類，因為擔子上通常著生2個擔孢子而得名。遺傳研究表明，典型的雙孢菇以次級同宗配合為主、異宗配合為輔的遺傳方式來完成其生活史，它的四孢變種以異宗配合的遺傳方式來完成其生活史［1］，是一種高蛋白、低脂肪、低能量的蕈類，所含蛋白質總量是其他水果和蔬菜的3～10倍。很多研究發(fā)現(xiàn)，雙孢菇具有抗腫瘤、抗病毒、抗菌、抗氧化、抗過敏、抗高膽固醇血癥和輔助治療糖尿病等作用［2-4］。以雙孢菇勻漿液為主要成分的“健肝片”，是治療肝炎的一種輔助藥品，對早期肝炎、慢性肝炎和肝腫大都有一定療效［5-6］。近年來，真菌多糖作為食品、藥品和化工行業(yè)的原料受到了人們的廣泛關注。采用液體發(fā)酵不但可以獲得大量的多糖，而且還包含有單寧、苦味酸、黃酮類化合物、萜類和甾體皂苷等。如曹小紅等［7］報道了灰樹花孢（Grifola frondosa）胞外多糖對小鼠急性肝損傷具有良好的修復作用。董開忠等［8］報道了冬蟲夏草胞內多糖對免疫性肝損傷小鼠有一定的保護作用。毛勇等［9］報道了雙孢菇胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）能提高糖尿病小鼠肝超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性，降低丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，增強糖尿病小鼠肝抗氧化能力，推測雙孢菇胞內多糖（intracellular polysaccharides，IPS）和EPS對肝具有保護作用。本研究制備免疫性肝損傷小鼠模型，進一步研究IPS和EPS對小鼠免疫性肝損傷的修復作用，為雙孢菇發(fā)酵多糖應用于保肝提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 雙孢菇多糖的制備

雙孢菇子實體于2012年夏季采集于西藏日喀則地區(qū)，菌株編號為T12387，根據(jù)顯微鏡觀察及基因測序，內轉錄間隔區(qū)（ITS）序列比對及簡單重復序列區(qū)間（ISSR）比對，以99%置信限確定為野生的雙孢蘑菇蕈株。此蕈株全部保藏在吉林省長春市吉林農業(yè)大學食藥用菌教育部工程研究中心的菌種庫中。經本實驗室分離、傳代及保藏菌種，將該菌種進行液體發(fā)酵，獲得的菌絲球在＜60℃烘干，粉碎，蒸餾水浸提，Sevage法除蛋白，透析，95%乙醇沉淀，分離純化獲得IPS［10］。發(fā)酵液經過濃縮，除蛋白，透析及乙醇沉淀，真空干燥，分離純化獲得EPS［9］。根據(jù)苯酚硫酸法測得IPS和EPS的純度分別為72.6%和77.5%，其成分主要為葡萄糖、木糖和甘露糖等。本研究均采用同一批多糖制品。

1.2 試劑和儀器

水飛薊賓膠囊購于天津天士力圣特制藥有限公司；伴刀豆凝集素A（concanavalin A，Con A）購于美國Sigma公司；SOD活性測定試劑盒（貨號20131202）、MDA含量測定試劑盒（貨號20140117）和BCA蛋白質濃度測定試劑盒（貨號20151209）均購于南京建成生物工程研究所；腫瘤壞死因子α（tumornecrosis factor-α，TNF-α）測定試劑盒（貨號88-7324-22）和干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）測定試劑盒（貨號88-7314-22）均購于美國eBioscience公司；CD3e-APC試劑盒（貨號561826）、CD4-PE試劑盒（貨號557308）和CD8-FITC試劑盒（貨號553030）均購于美國BD公司。680型酶標儀（美國Bio Rad公司）；SW-CJ-1FD型超凈工作臺（蘇州蘇潔凈化設備有限公司）；Accuri C6流式細胞儀（美國BD公司）；TD5A型離心機（湖南凱達科學儀器有限公司）；石蠟切片機（德國Leica公司）；APES防脫載玻片（上海尚寶生物科技有限公司）；全自動生化分析儀（邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）。

1.3 小鼠免疫性肝損傷模型的制備

雄性ICR小鼠，SPF級，18～22 g，購于北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK（京）2009-0004。飼養(yǎng)條件：溫度22～26℃，濕度50%～ 70%，12/12 h晝夜間斷照明，每天添加飼料2次，換水1次，小鼠自由進食、飲水。ICR小鼠隨機分為正常對照組、模型組、陽性藥組、IPS和EPS組，每組15只。IPS或EPS組ig給予IPS或EPS 100，200和400 mg·kg-1［11-12］；陽性藥組ig給予水飛薊賓47.25 mg·kg-1［13-16］，正常對照組和模型組ig給予等體積生理鹽水，每日1次，連續(xù)給藥12 d。末次給藥后4 h，除正常對照組外，模型組、IPS組、EPS組和陽性藥組均尾靜脈注射Con A 25 mg·kg-1誘導Con A免疫性肝損傷模型［17-19］。禁食不禁水后8 h，肝損傷程度達到高峰，眼球取血，之后處死小鼠，分別稱取肝、脾和胸腺進行實驗指標的測定。

1.4 免疫器官臟器指數(shù)測定

測量小鼠體質量和肝、脾和胸腺質量，按下列公式計算臟器指數(shù)：臟器指數(shù)=臟器質量（mg）/體質量（g）。

1.5 血清谷丙轉氨酶（glutamic-pyruvic transam?inase，GPT）和谷草轉氨酶（glutamic-oxalacetic transaminase，GOT）活性檢測

小鼠眼球取血，4℃，1000×g分離血清，全自動生化分析儀測定GPT和GOT活性。

1.6 小鼠脾中T淋巴細胞亞群CD4+和CD8+百分比及CD4+/CD8+比值的測定

剝離小鼠脾，置于200目無菌濾網(wǎng)中，加入RPMI 1640培養(yǎng)液1 mL，研磨充分后，4℃，447×g離心5 min。棄上清液，收集淋巴細胞，用PBS溶液洗滌，加入500μL紅細胞裂解液，室溫裂解5～8 min。4℃，447×g離心5 min，棄上清，收集淋巴細胞，用PBS洗滌，PBS 1 mL重懸細胞。300目尼龍膜小心過濾后，用細胞計數(shù)板計數(shù)，收集的細胞密度為1×109L-1。每個離心管分別加入10μL CD3，CD4和CD8熒光標記抗體，充分混勻，4℃避光孵育45 min。用100μL PBS溶液輕輕地重懸細胞沉淀，用錫箔紙包好樣品，上流式細胞儀檢測CD4+和CD8+T淋巴細胞，并計算CD4+/CD8+比值。實驗設空白對照、抗CD3單標、抗CD4和抗CD8單標對照組，排除假陽性。

1.7 血清中IFN-γ和TNF-α含量的測定

小鼠血液在4℃冰箱中放置3 h后，1000×g分離血清，按照IFN-γ和TNF-α試劑盒操作測定其含量。

1.8 肝組織SOD活性和MDA含量檢測

稱取小鼠肝左葉0.2 g，冷生理鹽水洗凈積血后制備10%肝勻漿，按照試劑盒說明書操作測定SOD活性和MDA含量。

1.9 肝組織病理觀察

取小鼠肝右葉，用10%甲醛溶液浸泡固定，48 h后制作肝組織切片，HE染色，光學顯微鏡下觀察其病理變化。

1.10 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 Con A免疫性肝損傷模型的確定

以Con A 20和25 mg·kg-1進行預實驗，根據(jù)小鼠活動狀況、血清GPT和GOT活性、T淋巴細胞亞群和細胞因子的變化及臟器觀察等進行比較，選擇Con A 25 mg·kg-1進行實驗。在正式實驗中，Con A注射后3 h，模型組、IPS和EPS 100 mg·kg-1組各有1只小鼠死亡，其他小鼠出現(xiàn)少動、精神萎靡、不嗜飲水和尿液黃等癥狀。8 h后，每組隨機取3只小鼠進行模型指標鑒定。模型組和各給藥組血清中GPT和GOT活性明顯高于正常對照組（P＜0.01）。大體觀察發(fā)現(xiàn)，除正常對照組外，其余各組肝表面顏色變暗，呈現(xiàn)顆粒狀，其他臟器如心、肺和腎等均無明顯病變。組織病理觀察發(fā)現(xiàn)，肝實質內大量淋巴細胞浸潤，顯示Con A引起的特異性肝損傷，表明模型制備成功。

2.2 IPS和EPS對免疫性肝損傷小鼠臟器指數(shù)的影響

除正常對照組外，其余各組小鼠肝出現(xiàn)不同程度的損傷，肝表面有大小不同的壞死斑，整肝呈現(xiàn)顆粒狀，其他臟器如心、肺和腎等無異常，表明Con A誘導肝損傷具有靶向性。圖1結果表明，與正常對照組相比，模型組小鼠肝、脾指數(shù)明顯增高（P＜0.01），表明出現(xiàn)肝、脾腫大；IPS和EPS給藥均能夠有效降低肝、脾指數(shù)，以200 mg·kg-1效果最為明顯（P＜0.01）。模型組小鼠的胸腺指數(shù)較正常對照組明顯降低（P＜0.01），IPS和EPS給藥組能顯著升高胸腺指數(shù)，200 mg·kg-1組升高最為明顯（P＜0.01）。

2.3 IPS和EPS對免疫性肝損傷小鼠血清轉氨酶及肝組織SOD活性和MDA含量的影響

圖2結果顯示，與正常對照組比較，模型組小鼠血清GPT和GOT水平顯著升高，肝組織中SOD活性明顯降低，MDA含量明顯升高（P＜0.01）。與模型組相比，IPS和EPS給藥組血清GOT和GPT水平明顯降低，肝組織中SOD活性顯著升高，MDA含量明顯降低（P＜0.01），但尚未恢復到正常對照組水平。

Fig.1 Effect of Agaricus bisporus intracellular poly?saccharide（IPS）and exopolysaccharides（EPS）on index of liver（A），spleen（B）and thymus（C）of mice with autoimmune liver injury induced by concanavalin A（Con A）.Silybin 47.25 mg·kg-1，IPS and EPS 100，200 and 400 mg·kg-1were ig given once daily for 12 d，re?spectively.Then，Con A 25 mg·kg-1was injected from the tail vein at 4 h after the last ig given drugs.The liver，spleen and thy?mus were taken 8 h after Con A was given.Organ index=organ mass（mg）/body mass（g）.x±s，n=10.＊＊P＜0.01，compared with normalgroup；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with modelgroup.

2.4 IPS和EPS對免疫性肝損傷小鼠脾細胞中T淋巴細胞亞群的影響

小鼠脾細胞中T淋巴細胞亞群CD4+和CD8+百分比及其比值如圖3所示。與正常對照組比較，模型組CD4+百分比和CD4+/CD8+比值明顯降低（P＜0.01）。與模型組比較，陽性藥組、IPS 400 mg·kg-1組和EPS 400 mg·kg-1組CD4+百分比明顯升高（P＜0.01），EPS 200和400 mg·kg-1組CD8+百分比升高（P＜0.05），各給藥組CD4+/CD8+比值與模型組比較無明顯差異。

2.5 IPS和EPS對免疫性肝損傷小鼠血清TNF-α和IFN-γ含量的影響

Fig.2 Effect of IPS and EPS on serum glutamic-oxalacetic transaminase（GOT）（A）and glutamic-pyruvic transam?inase（GPT）（B）activity and superoxide dismutase（SOD）activity（C）and malondialdehyde（MDA）content（D）in liver of mice with autoimmune liver injury induced by Con A.See Fig.1 for the mouse treatment.，n=10.＊＊P＜0.01，compared with normalgroup；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with modelgroup.

Fig.3 Effect of IPS and EPS on CD4+（A），CD8+（B）and CD4+/CD8+（C）ratio of T lymphocytes in spleen of mice with autoimmune liver injury induced by Con A. See Fig.1 for the mouse treatment.x±s，n=10.＊＊P＜0.01，compared with normalgroup；##P＜0.01，compared with modelgroup.

Fig.4 Effect of IPS and EPS on tumor necrosis factor-α（TNF-α）（A）and interferon-γ（IFN-γ）（B）contents in serum of mice with autoimmune liver injury induced by Con A.See Fig.1 for the mouse treatment.x±s，n=10.＊＊P＜0.01，compared with normalgroup；##P＜0.01，compared with modelgroup.

圖4結果顯示，與正常對照組比較，模型組血清中TNF-α和IFN-γ含量明顯升高（P＜0.01）。與模型組相比，陽性藥組、IPS和EPS 200，400 mg·kg-1組血清中TNF-α和IFN-γ含量明顯降低（P＜0.01）。

2.6 IPS和EPS對免疫性肝損傷小鼠肝組織病理改變的影響

Fig.5 Effect of IPS and EPS on liver histopathological changes of mice with autoimmune liver injury induced by Con A（HE staining）.See Fig.1 for the mouse treatment.A：normal group；B：modelgroup；C：silybin group；D，E and F：IPS 100，200 and 400 mg·kg-1group，respectively；G，H and I：EPS 100，200 and 400 mg·kg-1group，respectively.The arrows show the necrotic hepatocytes.

圖5結果顯示，正常對照組（圖5A）小鼠肝組織結構清晰，肝索圍繞肝靜脈呈放射狀排列，肝細胞無變性壞死等病理變化；模型組（圖5B）小鼠肝組織呈著色不均，肝索排列不規(guī)則，大范圍出現(xiàn)水腫及氣球樣變性，肝竇內紅細胞淤積，伴有肝點狀或灶狀壞死及炎性細胞浸潤；IPS及EPS給藥組小鼠肝組織的恢復能力不及陽性藥組（圖5C），其200和400 mg·kg-1組（圖5E，F(xiàn)，H，I）與模型組相比病變程度有所減輕，中央靜脈周圍壞死細胞較少，細胞腫脹程度減輕。

3 討論

目前，食用菌深層發(fā)酵的產品在醫(yī)藥領域的應用已越來越被人們認可，發(fā)酵過程中產生多糖、多肽、萜類化合物、甾醇類、生物堿、苷類、酶、抗生素和氨基酸等多種活性化合物［20］，這些物質具有抗腫瘤、防衰老和增強免疫力等功效。雙孢菇是近年來開發(fā)的功能顯著的食藥兼用菌之一。本研究觀察其2種發(fā)酵多糖IPS和EPS對Con A所致肝損傷的保護作用。

Con A是從巴西橡膠刀豆中提取的植物凝集素，其誘發(fā)的小鼠肝損傷與人類病毒性肝炎及自身免疫性肝病的病理過程非常相似，是T淋巴細胞誘導的免疫性肝損傷，尤其是CD4+T淋巴細胞，具有肝特異性和靶向性。因此，該模型被認為更適合研究人類病毒性肝炎、自身免疫性肝病等的病理機制并進行抗免疫性肝損傷的藥物篩選，造模所需時間短，方法簡便，損傷自然恢復時間較長，為臨床和基礎研究提供了較穩(wěn)定的動物模型。因此被科研工作者廣泛采納［18，21］。

Con A通過活化的T淋巴細胞誘發(fā)特異性肝損傷，肝竇內存在大量的巨噬細胞，激活后產生TNF-α、IFN-γ和白細胞介素2等細胞因子，可直接損傷肝細胞［22］。TNF-α為誘導肝損傷的終末介質，它既是肝細胞凋亡的正性觸發(fā)因子，可通過激活核因子誘導多個調節(jié)免疫和炎癥過程的基因轉錄，包括誘導型一氧化氮合酶及IFN-γ，直接損傷血管內皮細胞，又可活化中性粒細胞促進其趨化聚集于肝，釋放蛋白酶或氧自由基引起肝細胞凋亡或壞死［23］。T淋巴細胞活化后產生的IFN-γ是巨噬細胞的重要激活劑，對促進肝內Kupffer細胞參與炎癥反應和刺激巨噬細胞分泌TNF-α起重要作用。大量活化的T淋巴細胞和IFN-γ聚集到肝，破壞血管內皮細胞，導致肝損傷。Con A與肝竇具有親和性，可以直接使循環(huán)T淋巴細胞匯入肝竇并在局部增殖，釋放多種細胞因子間接地損傷肝細胞。此外，由于Con A刺激及細胞因子的釋放激活機體免疫系統(tǒng)，脾中大量活化的T淋巴細胞產生細胞因子，T淋巴細胞與細胞因子隨血流到達肝，直接與肝細胞接觸或進一步激活巨噬細胞，破壞血管內皮細胞，導致肝損傷［24］。

本研究結果可見，注射Con A后8 h，小鼠肝、脾指數(shù)明顯增高，胸腺指數(shù)明顯降低；血清GPT和GOT活性顯著上升，TNF-α和IFN-γ含量顯著上升；脾細胞中CD4+T淋巴細胞百分比明顯降低，CD4+/CD8+T淋巴細胞比值明顯下降；肝組織SOD活性降低，MDA水平升高；肝組織出現(xiàn)明顯病理改變。上述結果表明，Con A引起肝的氧化應激損傷，氧自由基攻擊肝細胞膜和線粒體膜上的多不飽和脂肪酸，引起一系列脂質過氧化反應，使膜通透性發(fā)生改變，導致GPT及GOT大量釋放到血液中。本研究預先ig給予小鼠IPS或EPS 100～400 mg·kg-1，每日1次，連續(xù)12 d，可減輕之后注射Con A引起的上述肝損傷，說明IPS和EPS可以提高SOD活性，增強肝清除自由基的能力，抵御脂質過氧化反應，保護肝細胞膜和線粒體膜，達到肝保護作用。IPS和EPS顯著降低血清TNF-α和IFN-γ的含量，增加脾細胞中CD4+T淋巴細胞百分比，在一定程度上抑制了肝損傷小鼠免疫系統(tǒng)的過度激活，減輕大量淋巴細胞和細胞因子對肝造成的損傷。

本研究初步證實了IPS和EPS對肝的保護作用，其確切的有效成分及作用機制還需深入研究。

［1］Wang ZS，Liao JH，Chen MY，CaiZX.Breeding and industrial development of Agaricus bisporus［J］.Acta Edulis Fungi（食用菌學報），2012，19（3）：1-14.

［2］Dutta S.Role of mushrooms as nutraceutical：an overview［J］.Int J Pharm Biol Sci，2013，4（4）：B59-B66.

［3］Rathee S，Rathee D，Rathee D，Kumar V，Rathee P. Mushrooms as therapeutic agents［J］.Rev Braz Farmacogn，2012，22（2）：459-474.

［4］Xu T，Beelman RB，Lambert JD.The cancer preventive effects of edible mushrooms［J］.Anti?cancer Agents Med Chem，2012，12（10）：1255-1263.

［5］Kanaya N，Kubo M，Liu Z，Chu P，Wang C，Yuan YC，et al.Protective effects of white button mushroom（Agaricus bisporus）against hepatic steatosis in ovariectomized mice as a model of postmenopausal women［J］.PLoS One，2011，6（10）：e26654.

［6］Uyanoglu M，Canbek M，van Griensven LJ，Yamac M，Senturk H，Kartkaya K，et al.Effects of polysaccharide from fruiting bodies of A garicus bisporus，Agaricus brasiliensis，and Phellinus linteus on alcoholic liver injury［J］.Int J Food Sci Nutr，2014，65（4）：482-488.

［7］Cao XH，Zhu H，Wang CL，Lu MF，Zeng B，Wang AH.Protective effect of exo-polysaccharides produced by Grifola frondosa on carbon tetrachloride induced liver injury in mice［J］.Nat Prod Res Dev（天然產物研究與開發(fā)），2010，22（5）：777-780.

［8］Dong KZ，Gao YS，Wang XH，Ma YQ，Su L. Protective effect of mycelial polysaccharides from Cordyceps sinensis on immunological liver injury in mice［J］.Med J Chin PLA（解放軍醫(yī)學雜志），2016，41（4）：284-288.

［9］Mao Y，Mao J，Meng X.Extraction optimization and bioactivity of exopolysaccharides from Agari?cus bisporus［J］.Carbohydr Polym，2013，92（2）：1602-1607.

［10］Gao HW，Li ZL，Liu ZL，Yu L.Isolation，purifica?tion and chemical structure analysis of Agaricus bisporus intracellular polysaccharide and exopoly?saccharides［J］.J.Nanjing Univ Tradit Chin Med（南京中醫(yī)藥大學學報），1999，15（4）：224-225.

［11］Liu T，Ma L，Zhao J，Ma Q，Su DQ，Ji FC.The protective effects of polysaccharide from Vitis vinifera on immunologicalliver injury in mice and its mech?anism［J］.Acta Nutr Sin（營養(yǎng)學報），2008，30（6）：5960-601.

［12］Fang SY，Xu MH，Ye LB，Gu HX，Bao LL，Zhang XY.Study on protective action of Cordyceps on immunological liver injury in mice model［J］.Chin J Immunol（中國免疫學雜志），2011，27（10）：891-894.

［13］Wang HW，Li SC，He HB，Zeng X，Di GJ，Zhang CC，et al.Protection of Panax japonicus extractagainst acute alcoholic liver injury in mice［J］.Chin J Clin Pharmacol Ther（中國臨床藥理學與治療學），2012，17（9）：961-966.

［14］Guo H，He H，Yu GC，Du J.Hepatoprotective effects of corn peptides on immunological liver injury in mice［J］.J Chin Cereals Oils Assoc（中國糧油學報），2009，24（10）：41-45.

［15］Serviddio G，Bellanti F，Stanca E，Lunetti P，Blonda M，Tamborra R，et al.Silybin exerts antiox?idant effects and induces mitochondrial biogenesis in liver of rat with secondary biliary cirrhosis［J］. Free Radic BiolMed，2014，73：117-126.

［16］Stanca E，Serviddio G，Bellanti F，Vendemiale G，Siculella L，Giudetti AM.Down-regulation of LPCAT expression increases platelet-activating factor level in cirrhotic rat liver：potential antiinflammatory effect of silybin［J］.Biochim Biophys Acta，2013，1832（12）：2019-2026.

［17］Huang ZB，Huang Y，Zhou RR，Chen RC，Yi PP，Li N，et al.Protective role of high mobility group box-1 protein antibody in Con A-induced liver injury in mice［J］.Chin J Infect Control（中國感染控制雜志），2015，14（12）：793-797.

［18］Heymann F，Hamesch K，Weiskirchen R，Tacke F. The concanavalin A model of acute hepatitis in mice［J］.Lab Anim，2015，49（1 Suppl）：12-20.

［19］Xiao H，Pan WM，Sun W，Chen HY，Xu JF.Protec?tive effect of soluble protein mB7-H4 on liver injury of mice induced by Con A［J］.J Jilin Univ（Med Ed）〔吉林大學學報（醫(yī)學版）〕，2016，42（1）：36-39.

［20］Tang YJ，Zhong JJ.Submerged fermentation of higher fungi for production of valuable bioactive metabolites［J］.J East China Univ Sci Technol（華東理工大學學報），2001，27（6）：704-711.

［21］Zheng CH，Xie XH.Advances in concanavalin A-induced liver injury on immune cells and cyto?kines［J］.Acad J PLA Postgrad Med School（解放軍醫(yī)學院學報），2016，37（2）：191-194.

［22］Hu XD，Jiang SL，Liu CH，Hu YY，Liu C，Sun MY，et al.Preventive effects of 1，25-（OH）2VD3 against Con A-induced mouse hepatitis through promot?ing vitamin D receptor gene expression［J］.Acta PharmacolSin，2010，31（6）：703-708.

［23］Erhardt A，Tiegs G.Tolerance induction in response to liver inflammation［J］.Dig Dis，2010，28（1）：86-92.

［24］Kremer M，Hines IN，Milton RJ，Wheeler MD. Favored T helper 1 response in a mouse model of hepatosteatosis is associated with enhanced T cellmediated hepatitis［J］.Hepatology，2006，44（1）：216-227.

Protective effect of Agaricus bisporus intracellular polysaccharides and exopolysaccharides against concanavalin A-induced immunologicalliver injury in mice

ZHENG Dan-dan1,JIANG Nan1,HU Yang-yang2,YANG Jian-hua1,DONG Liang-jun1,WANG Qi1
(1.Engineering Research Center ofChinese Ministry of Education for Edible and MedicinalFungi,2.Animal Science and Technology College,Jilin AgriculturalUniversity,Changchun 130118,China)

OBJECTIVETo evaluate the protective effect of Agaricus bisporus intracellular polysac?charides(IPS)and exopolysaccharides(EPS)on immunological liver injury induced by concanavalin A (Con A).METHODSMice were pretreated with IPS and EPS(100,200 and 400 mg·kg-1,ig)daily for 12 d.Immunologicalliver injury was induced by Con A 25 mg·kg-1by injection via the tailvein ofmice. Eighthours after injection of Con A,the indexes ofthe liver,spleen and thymus,serum levelofglutamicpyruvic transaminase(GPT),glutamic-oxalacetic transaminase(GOT),tumor necrosis factor-α(TNF-α) and interferon-γ(IFN-γ),splenic lymphocyte percentages of CD4+and CD8+,and liver homogenate content of superoxide dismutase(SOD)and malondialdehyde(MDA)were measured.Liver pathological changes were observed by HE staining.RESULTSCompared with normalgroup,the autoimmune liver injury in mice induced by Con A resulted in an increase in the liver index(P＜0.01),spleen index(P＜0.01),the activity of GPT(P＜0.01)and GOT(P＜0.01),the content of TNF-α(P＜0.01)and IFN-γ(P＜0.01),and the levelof MDA(P＜0.01),but a decrease in the thymus index(P＜0.01),the percentage ofCD4+(P＜0.01),the ratio of CD4+/CD8+(P＜0.01),and SOD activity(P＜0.01).Compared with modelgroup, treatmentwith IPS(200 and 400 mg·kg-1)and EPS(200 and 400 mg·kg-1)respectively resulted in an increase in the thymus index(P＜0.01)but in a decrease in the liver index and spleen index(P＜0.01). Similarly,the activity of GOT and GPT was decreased obviously(P＜0.01),and the contentof TNF-αand IFN-γin IPS and EPS 200 and 400 mg·kg-1groups was decreased.Compared with model group,the activity of SOD in IPS and EPS(200 and 400 mg·kg-1)group was increased(P＜0.01)while MDA was decreased(P＜0.01).Moreover,the percentage of CD4+Iymphocytes decreased(P＜0.01),whereas no significant difference was found in the ratio of CD4+/CD8+.Pathological changes of the liver were observed under a microscope.Pretreatment with IPS and EPS could effectively reduce the liver injury induced by Con A.CONCLUSIONIPS and EPS have certain protective effect on immunologicalliver injury,which may be related to their ability to clean up free radicals,controllipid peroxidation and regulate the balance ofthe immune system.

Agaricus bisporus;polysaccharides;immunologicalliver injury;T lymphocytes

WANG Qi,E-mail:q-wang2006@126.com

R285.5

：A

：1000-3002-（2017）04-0303-08

10.3867/j.issn.1000-3002.2017.04.002

Foundation item:The projectsupported by National Key Technologies R&D Program(2012BAC01B04);and National Basic Research Program of China(2014CB138304)

2016-12-09接受日期：2017-03-29）

（本文編輯：齊春會）

國家科技支撐計劃（2012BAC01B04）；國家重點基礎研究發(fā)展計劃（2014CB138304）

鄭丹丹，女，碩士研究生，主要從事藥理及免疫學研究，E-mail：sunnysky06@126.com；王琦，女，教授，博士生導師，主要從事食藥用菌研究。

王琦，E-mail:q-wang2006@126.com