立論于肝脾同治研究逍遙散對(duì)老年性癡呆模型鼠行為學(xué)及神經(jīng)可塑性的影響

李瓊鋒 杜義斌 趙 義

(云南省中醫(yī)醫(yī)院老年病科,昆明,650021)

立論于肝脾同治研究逍遙散對(duì)老年性癡呆模型鼠行為學(xué)及神經(jīng)可塑性的影響

李瓊鋒 杜義斌 趙 義

(云南省中醫(yī)醫(yī)院老年病科,昆明,650021)

目的:立論于肝脾同治研究逍遙散對(duì)老年性癡呆模型鼠行為學(xué)及神經(jīng)可塑性生長(zhǎng)相關(guān)蛋白(GAP-43)和突觸素(SYN)的影響。方法:72只健康SPF級(jí)雄性大鼠,根據(jù)隨機(jī)數(shù)子表法隨機(jī)分為3組,假手術(shù)組、癡呆組和逍遙散組,每組各24只。癡呆組和逍遙散組進(jìn)行老年癡呆AD大鼠的模型制備,假手術(shù)組:常規(guī)飼料飲水SPF級(jí)飼養(yǎng);癡呆組:在空白組的基礎(chǔ)上,給予等量0.2 mL/10 g無(wú)菌生理鹽水灌胃;逍遙散組:在空白組的基礎(chǔ)上,逍遙散水煎液,給予0.2 mL/10 g的逍遙散水煎液灌胃。1次/d,療程6周。采用Y型迷宮進(jìn)行大鼠的學(xué)習(xí)記憶行為檢測(cè),透射電子顯微鏡(TEM)觀察海馬CA1區(qū)突觸結(jié)構(gòu),免疫組化檢測(cè)海馬CA1區(qū)生長(zhǎng)相關(guān)蛋白(GAP-43)的表達(dá)情況,蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)檢測(cè)突觸素(SYN)的表達(dá)情況。結(jié)果:1)與假手術(shù)組比較,癡呆組和逍遙散組中EN均增加(P<0.05),CN均減少(P<0.05);其中逍遙散組EN低于癡呆組(P<0.05),CN則高于癡呆組(P<0.05)。2)TEM下觀察假手術(shù)組突觸結(jié)構(gòu)和形態(tài)正常,逍遙散組大鼠海馬CA1區(qū)突觸結(jié)構(gòu)和形態(tài)均較癡呆組規(guī)則(P<0.05)。3)與假手術(shù)比較,癡呆組和逍遙散組GAP-43和SYN表達(dá)均下調(diào)(P<0.05),而逍遙散組中GAP-43和SYN的表達(dá)則高于癡呆組(P<0.05)。結(jié)論:逍遙散(肝脾同治)有效改善老年性癡呆模型鼠的學(xué)習(xí)記憶行為學(xué)和突觸結(jié)構(gòu)形態(tài),其機(jī)制可能與上調(diào)了生長(zhǎng)相關(guān)蛋白(GAP-43)免疫組化8和突觸素(SYN)神經(jīng)可塑性相關(guān)蛋白有關(guān)。

肝脾同治;逍遙散;老年性癡呆;行為學(xué);神經(jīng)可塑性

老年性癡呆即阿爾茲海默病(Alzheimer′sdisease,AD)，是機(jī)體大腦皮質(zhì)不斷退化而出現(xiàn)不同認(rèn)知領(lǐng)域減退的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病,目前發(fā)病原因尚不明了。中醫(yī)學(xué)患者年老體虛,氣血津液虧虛,因虛致瘀,痰濁蒙竅,腦竅失養(yǎng)而出現(xiàn)此癥,因此我們認(rèn)為AD病因病機(jī)不外乎虛、瘀、痰三者?！端貑?wèn)》一書(shū)中描述到:“肝為將軍之臟,喜調(diào)達(dá)而惡抑郁”,《臨證指南醫(yī)案.肝風(fēng)》有“肝體陰而用陽(yáng)”,《難經(jīng)》曰:“脾藏二神意與智,意不安,思無(wú)慮,神奪愚也”,脾乃后天之本,氣血生化之源,脾氣健運(yùn)氣血生化有源則可上達(dá)濡養(yǎng)腦竅,下滲于腎以充髓海,因此我們認(rèn)為治療AD的核心在于肝脾兩臟?！跺羞b散》首載于《太平惠民和劑局方》一書(shū),是肝脾同治之經(jīng)典方,可通過(guò)土木同調(diào),從而實(shí)現(xiàn)氣血并治,則血充腦靈,氣暢神安。我們?cè)谂R床立論于肝脾同治理論,利用逍遙散治療老年性癡呆,獲得理想療效,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 72只購(gòu)于昆明楚商科技有限公司的健康SPF級(jí)雄性大鼠,平均體重(280±21)g,飼養(yǎng)環(huán)境設(shè)置:室溫23～25 ℃,相對(duì)濕度(56±6)%。

1.2.2 儀器 腦立體定位儀(北京拜安吉科技有限公司提供,型號(hào):SR-5R),干粉劑(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院多肽室提供),10%水合氯醛(武漢遠(yuǎn)成共創(chuàng)科技有限公司生產(chǎn))。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 根據(jù)隨機(jī)數(shù)子表法隨機(jī)分為3組,假手術(shù)組、癡呆組和逍遙散組,每組24只。老年癡呆AD大鼠的模型制備,10%水合氯醛按照大鼠體重腹腔注射麻醉(4 mL/kg),固定在大鼠腦立體定位儀上,常規(guī)備皮,分離暴露顱骨,參照包新民《大鼠腦立體定位儀圖譜》在右側(cè)前囟后3.0 cm,中線右側(cè)2.0 cm,馬克筆標(biāo)記定點(diǎn),用牙科鉆轉(zhuǎn)開(kāi)顱骨,微量注射器垂直進(jìn)針2.5 cm定位海馬區(qū),緩慢注射5 μL的凝聚態(tài)Aβ1-42,凝聚態(tài)的制備是將Aβ1-42干粉劑溶于2 g/L的無(wú)菌生理鹽水中。注射完以后留針5 min再出針并縫合皮膚。假手術(shù)組同上方法注入5 μL的無(wú)菌生理鹽水。

1.2.2 干預(yù)方法 1)假手術(shù)組:常規(guī)飼料飲水SPF級(jí)飼養(yǎng);2)癡呆組:在空白組的基礎(chǔ)上,給予等量0.2 mL/10 g無(wú)菌生理鹽水灌胃;3)逍遙散組:在空白組的基礎(chǔ)上,逍遙散(柴胡、當(dāng)歸、白芍、白術(shù)、茯苓、生姜各15 g、薄荷5 g)水煎獲取逍遙散水煎液,給予0.2 mL/10 g的逍遙散水煎液灌胃，1次/d,療程為6周。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.2.3.1 老年癡呆行為學(xué)檢測(cè) 治療結(jié)束后,各組大鼠采用Y型迷宮進(jìn)行大鼠的學(xué)習(xí)記憶行為檢測(cè),觀察其學(xué)習(xí)記憶能力。將大鼠放于Y型迷宮中適應(yīng)5 min熟悉環(huán)境,起步區(qū),安全區(qū)等,開(kāi)始試驗(yàn)后選擇安靜黑暗的環(huán)境,設(shè)定75 V電壓,通電后若大鼠10 s內(nèi)一次性跑到安全區(qū),即為“正確反應(yīng)”,否則為“錯(cuò)誤反應(yīng)”。安全區(qū)無(wú)規(guī)則變換,每次測(cè)試間隔1 min,連續(xù)測(cè)試重復(fù),記錄大鼠達(dá)到學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)(10次中有9次為正確反應(yīng)),錯(cuò)誤反應(yīng)次數(shù)(EN),越小學(xué)習(xí)能力越強(qiáng);正確反應(yīng)次數(shù)(CN),是學(xué)習(xí)測(cè)試24 h后,連續(xù)電擊10次的記錄,值越大記憶能力越強(qiáng)。

1.2.3.2 透射電子顯微鏡(TEM)觀察海馬CA1區(qū)突觸結(jié)構(gòu) 治療后每組8只大鼠麻醉猝死,取腦分離大鼠海馬CA1區(qū),迅速用2%戊二醛和l%鋨酸后固定l h,常規(guī)脫水、固定和環(huán)氧樹(shù)脂包埋,超薄切片機(jī)(LKB-8800,瑞典)切片,醋酸鈾、檸檬酸鉛雙染色,透射電子顯微鏡(JEM-2100日本電子株式會(huì)社)下觀察并拍片。

1.2.3.3 免疫組化檢測(cè)海馬CA1區(qū)生長(zhǎng)相關(guān)蛋白(GAP-43)的表達(dá)情況 治療后每組8只大鼠麻醉猝死,斷頭取腦,4%多聚甲醛固定,隨后采用常規(guī)梯度酒精進(jìn)行脫水,石蠟包埋后連續(xù)冠狀切4 μm厚度片。根據(jù)GAP-43免疫組化試劑盒(CST公司,美國(guó)),標(biāo)準(zhǔn)SP法操作,DAB顯色,顯微鏡觀察GAP-43的表達(dá)情況。

1.2.3.4 蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)檢測(cè)突觸素(SYN)的表達(dá)情況 治療后每組8只大鼠麻醉斷頭取腦放入液氮中,腦組織研磨提取蛋白上清液,BCA測(cè)定蛋白含量,計(jì)算上樣量,配置SDS-PAGE蛋白電泳膠,常規(guī)電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉雜交和ECL曝光顯影,掃描成像,用ImageLab進(jìn)行圖像分析。GAPDH作為內(nèi)參。試劑均購(gòu)于CST公司。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,多組間采用單因素方差分析,兩兩比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶行為學(xué)比較 與假手術(shù)組比較,癡呆組和逍遙散組中EN均增加(P<0.05),CN均減少(P<0.05);其中逍遙散組EN低于癡呆組(P<0.05),CN則高于癡呆組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 TEM觀察大鼠海馬CA1區(qū)突觸超微結(jié)構(gòu)變化 TEM下觀察假手術(shù)組突觸結(jié)構(gòu)和形態(tài)正常,逍遙散組大鼠海馬CA1區(qū)突觸結(jié)構(gòu)和形態(tài)均較癡呆組規(guī)則(P<0.05),逍遙組中突觸前區(qū)分布均勻,小泡豐富,較少線粒體凝聚。見(jiàn)圖1。

表1 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶行為學(xué)比較

注:與假手術(shù)組比較,*P<0.05;與癡呆組比較,△P<0.05。

圖1 TEM大鼠海馬CA1區(qū)突觸超微結(jié)構(gòu)變化(40 000×)

2.3 各組免疫組化GAP-43的表達(dá)情況 免疫組化GAP-43表達(dá)上癡呆組較假手術(shù)組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減低(P<0.05),而逍遙散組中GAP-43的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)則高于癡呆組(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 各組免疫組化GAP-43的表達(dá)情況(400×)

圖3 不同組別Western Blot條帶結(jié)果

圖4 不同組別Western Blot灰度值結(jié)果

注：與癡呆組比較,*P<0.05;與假手術(shù)組比較,#P<0.05。

2.4 各組大鼠Western Blot中SYN表達(dá)情況 與假手術(shù)比較,癡呆組和逍遙散組Western Blot中SYN表達(dá)均下調(diào)(P<0.05),而逍遙散組中SYN的蛋白表達(dá)則高于癡呆組(P<0.05)。見(jiàn)圖3、圖4。

3 討論

《素問(wèn)·經(jīng)脈別論》一書(shū)中曰:“食氣入胃,散精于肝,淫氣于筋”，我們認(rèn)為此句話應(yīng)理解為食氣入胃,透過(guò)脾的運(yùn)化,將營(yíng)養(yǎng)散播到全身。這體現(xiàn)了古代醫(yī)賢認(rèn)為脾為后天之本之觀點(diǎn),脾氣健運(yùn),氣血生化有源,飲食水谷精微不斷輸送至肝臟以滋養(yǎng)全身筋骨脈絡(luò),所以元代李杲在其《脾胃論·脾胃盛衰論》中描述:“百病皆由脾胃衰而生也”?，F(xiàn)代解剖學(xué)資料證實(shí)被胃腸道所吸收的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)隨之進(jìn)入胃腸外血絡(luò),隨后進(jìn)入肝門靜脈,部分營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)停留于肝臟內(nèi)以肝糖原形式儲(chǔ)存,這就醫(yī)圣張仲景“肝主筋,故胃散谷氣于肝,則浸淫滋養(yǎng)于筋也”的觀點(diǎn)一致,清末名醫(yī)柳寶詒在其臨床醫(yī)冊(cè)中記載:“血藏肝,而生于脾……滋潤(rùn)肝陰尤應(yīng)培土,以補(bǔ)營(yíng)血之源”,上述醫(yī)賢的觀點(diǎn)充分體現(xiàn)了肝脾同治的重要性[1]。對(duì)大量傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)進(jìn)行研讀,并根據(jù)循證醫(yī)學(xué)研究結(jié)果我們認(rèn)為AD的發(fā)生發(fā)展與肝脾兩臟的病變密不可分,肝藏血主疏泄,與情志調(diào)節(jié)及思憶息息相關(guān),精血同源,肝血充則髓海盈,若肝血虧虛不能涵養(yǎng)怒志而致情志失調(diào),氣機(jī)不暢而郁結(jié)成病,皆可發(fā)為癡呆?！峨y經(jīng)》一書(shū)云:“脾藏意與智”,《醫(yī)方類聚》亦有記載:“脾藏二神意與智”,脾乃后天之本,腎為后天之本,先天養(yǎng)后天,活力資助,后天養(yǎng)先天,培育充養(yǎng),如若脾氣虧虛,氣血生化乏源,則上無(wú)法充盈腦竅,下無(wú)法培育腎精而髓?；鸁o(wú)源。此外,脾主運(yùn)化,脾虛則水濕內(nèi)停,痰濁叢生,肝失疏泄則氣機(jī)散布不暢,導(dǎo)致氣滯血瘀,上沖蒙于清竅,神明失養(yǎng)而成呆病?；谏鲜隼碚撐覀儚母纹⑼沃痔接懼委烝D的臨床思路,以逍遙散為手段對(duì)AD模型大鼠進(jìn)行治療,結(jié)果顯示逍遙散理想地提高了AD大鼠行為學(xué)習(xí)能力,這說(shuō)明肝脾同治符合AD的治則。逍遙散源自《太平惠民和劑局方》,是疏肝調(diào)脾的經(jīng)典名方,實(shí)現(xiàn)氣血兼顧、肝脾同調(diào)的目的。方中柴胡疏肝解郁,肝氣調(diào)達(dá),處君藥之位,當(dāng)歸養(yǎng)血和血,白芍養(yǎng)血斂陰,柔肝緩急,三藥合用補(bǔ)肝體而助肝用,血和其肝和,血充則肝柔,當(dāng)歸聯(lián)合白芍共為臣藥以藏神魂,舍意智。木郁不達(dá)而致脾虛不運(yùn),故加白術(shù)、茯苓、甘草以益氣健脾,既可實(shí)土以御木侮,又可充盈氣血生化之源,以解蒙蔽,聰神明,共為佐藥。方中加少許薄荷以加強(qiáng)悅神魂、暢情志之功,生姜溫運(yùn)和中,辛散達(dá)郁,亦為佐藥。諸藥合用,氣血并治,肝脾兼顧,使筋肉并健,清陽(yáng)得升而氣機(jī)得暢,精氣上注則神明得安,氣暢神安,腦脈得養(yǎng),神聰自和,組方嚴(yán)謹(jǐn),具有中藥治療AD的理論基礎(chǔ)。

近年來(lái)隨著分子生物學(xué)研究的日益深入,研究人員發(fā)現(xiàn)認(rèn)知功能與神經(jīng)元突觸的可塑性關(guān)系密切[2-4]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的可塑性存在于各級(jí)環(huán)節(jié),包括神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、突觸連接以及神經(jīng)環(huán)路等,其中突觸是最不穩(wěn)定因素,亦是可塑性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[5-6]。最新研究顯示GAP-43對(duì)神經(jīng)的生長(zhǎng)、再生以及突觸形態(tài)、功能的維持有著重要作用,甚至被視為神經(jīng)再塑的標(biāo)志性因子[7-8]。根據(jù)超微結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)隨著神經(jīng)元的生長(zhǎng)或再生,神經(jīng)組織內(nèi)有大量GAP43在突觸組織合成,并分布于軸突生長(zhǎng)錐質(zhì)膜面中,不斷刺激生長(zhǎng)錐質(zhì)膜面從而實(shí)現(xiàn)促進(jìn)軸突生長(zhǎng)的目的,胚胎時(shí)期GAP-43大量分泌以促進(jìn)神經(jīng)元生長(zhǎng)發(fā)育,隨著機(jī)體逐漸發(fā)育成熟GAP43濃度逐漸降低,但在新皮質(zhì)、海馬等組織GAP-43仍以較高水平分布于此[9-10]。當(dāng)修復(fù)受損腦組織時(shí),側(cè)枝長(zhǎng)芽及反應(yīng)性軸突再生均有GAP-43濃度的變化,在本研究中我們發(fā)現(xiàn)AD模型大鼠腦組織GAP-43濃度大量減少,而隨著逍遙散的使用,AD大鼠腦組織的GAP-43反應(yīng)性增多,從而促進(jìn)了神經(jīng)元的不斷修復(fù),促進(jìn)病情發(fā)育。在研究中我們同時(shí)檢測(cè)了SYN的濃度變化,我們可以清楚觀察到經(jīng)過(guò)AD造模的大鼠SYN濃度急劇減少,而逍遙散組大鼠雖然SYN濃度較假手術(shù)組減少,但與AD組比較明顯上調(diào),這說(shuō)明逍遙散改善AD模型大鼠認(rèn)知可能還與改變SYN蛋白濃度有關(guān)。SYN蛋白是突觸前終末的特異性蛋白因子之一,其濃度變化直接體現(xiàn)了反應(yīng)體內(nèi)突觸的數(shù)量及分布情況[11-15],有研究人員利用醫(yī)學(xué)手段改善癡呆大鼠腦血流的同時(shí)發(fā)現(xiàn)促進(jìn)了新的樹(shù)突和軸突生長(zhǎng),于此同時(shí)檢測(cè)到SYN濃度隨之上調(diào),我們?cè)谘芯恐幸嗬秒婄R對(duì)不同組別大鼠的突觸超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察,結(jié)果發(fā)現(xiàn)逍遙散組大鼠海馬CA1區(qū)突觸結(jié)構(gòu)和形態(tài)均較癡呆組規(guī)則,逍遙組中突觸前區(qū)分布均勻,小泡豐富,較少線粒體凝聚,與此同時(shí)我們利用Western blotting技術(shù)觀察到SYN蛋白在隨著突觸形態(tài)改善的同時(shí)水平逐漸上調(diào),因此我們有理由相信逍遙散通過(guò)增加SYN的表達(dá)從來(lái)他促進(jìn)突觸重建。

通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)研究,我們發(fā)現(xiàn)逍遙散可改善AD模型大鼠的認(rèn)知能力,于此同時(shí),其明顯修復(fù)了突觸的形態(tài),而這一作用機(jī)制可能與上調(diào)GAP-43及SYN等突觸相關(guān)性蛋白濃度有關(guān)。

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(2017-03-27收稿 責(zé)任編輯：王明)

Effect of Xiaoyao Powder on Praxiology and Neural Plasticity in Rats with Alzheimer′s Diseases from Simultaneous Treatment in Liver and Spleen Theory

Li Qionfeng, Du Yibin, Zhao Yi

(GeratologyDepartment,YunnanMunicipalHospitalofTraditionalChineseMedicine,Kunming650021,China)

Objective: To study the effect of Xiaoyao Powder on praxiology and neural plasticity of growth protein (GAP-43) and synaptophysin (SYN) in rats with alzheimer′s diseases from simultaneous treatment in liver and spleen theory. Methods: Seventy-two healthy male SPF rats were randomly divided into 3 groups: sham operation group, dementia group and Xiaoyao Powder group, with 24 rats in each group. Rats in the dementia group and Xiaoyao Powder group had operation for senile dementia in AD model. Sham operation group

conventional feeding of grade SPF; dementia group was additionally treated with 0.2 mL/10 g sterile saline, while Xiaoyao Powder group received Xiaoyao Powder based on the blank group treatment and was given by 0.2 mL/10 g decoction lavage, once a day for 6 weeks. Y maze was applied for the study of learing and memorial behavior, and synaptic structure in hippocampal CA1 region was detected by transmission electron microscopy (TEM), immunohistochemistry was used to detect the expression of hippocampus CA1 growth protein (GAP-43), and Western blot (Western Blot) was applied to detect the expression of synaptophysin (SYN). Results: 1) Compared with the sham operation group, EN of the dementia group and Xiaoyao Powder group was increased (P<0.05) and CN decreased (P<0.05). EN in the Xiaoyao Powder group was lower than that of dementia group (P<0.05) and CN was higher than that in senile dementia group (P<0.05). 2) The structure and morphology of the synapses were observed in the sham operated group. The structure and morphology of CA1 in the hippocampus of the Xiaoyao Powder group were significantly lower than those in the dementia group (P<0.05). 3) Compared with sham operation group, the expression of GAP-43 and SYN in the dementia group and the Xiaoyao Powder group were all down-regulated (P<0.05), while the expression of GAP-43 and SYN in Xiaoyao Powder group was higher than that in dementia group (P<0.05). Conclusion: Xiaoyao Powder (from simultaneous treatment for Liver and spleen theory) may effectively improve the learning and memorial behavior of senile dementia model rats and its synaptic structure form. Its mechanism may be related to the up-regulation of growth associated protein (GAP-43) immunohistochemistry 8 and synaptophysin (SYN) on neural plasticity associated protein.

Liver and spleen; Xiaoyao Powder; Alzheimer′s disease; Praxiology; Neural plasticity

云南省科技計(jì)劃項(xiàng)目[編號(hào):2015FB205(033)]

李瓊鋒(1966.12—),女,本科,副主任醫(yī)師,研究方向:老年常見(jiàn)病,E-mail:dlk5131568@sina.com

杜義斌(1968.07—),男,碩士,主任醫(yī)師,老年病二科主任,研究方向:老年常見(jiàn)病,E-mail:dybys@126.com

R285.5

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10.3969/j.issn.1673-7202.2017.05.042