利心丸中防己諾林堿HPLC檢測方法的建立及其評價(jià)

白雪潔　于森　白雪媛

[摘要]目的建立利心丸中的防己諾林堿含量測定方法。方法采用高效液相色譜法，以Inertsil ODS-3（5um，4.6mm×250mm）色譜柱，甲醇一乙腈一水一二乙胺（52：20：28：0.08）為流動(dòng)相，檢測波長：282nm，流速：1.0mL/min。結(jié)果己諾林堿在0.1617～0.9702ug的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r=0.9996；平均加樣回收率是98.50%，RSD=1.26%。結(jié)論方法操作簡便，專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確度高，可用于利心丸的質(zhì)量控制。

[關(guān)鍵詞]利心丸；防己諾林堿；HPLC

[中圖分類號(hào)]R284.1

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]2095-0616（2017）03-57-04

利心丸（濃縮水丸）收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》第八冊，（標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)為WS3-B-32）。由貂心、地黃、防己、茯苓、牡丹皮等八味中藥材制成的中藥復(fù)方制劑。具有養(yǎng)心安神的功效，臨床主要用于風(fēng)濕性心臟病，心動(dòng)過速，心律不齊，心力衰竭等而見心血不足等癥者。關(guān)于利心丸的質(zhì)量控制，原標(biāo)準(zhǔn)主要采用顯微和紫外分光光度法進(jìn)行鑒別，方法過于簡單，無含量測定。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道主要集中在牡丹皮中丹皮酚的含量測定及對地黃、防己和牡丹皮的TLC定性鑒別。本文在相關(guān)文獻(xiàn)的研究基礎(chǔ)上，參照《中國藥典》（2015版，一部）防己藥材含量測定方法，首次對利心丸（濃縮水丸）中防己諾林堿的含量采用高效液相色譜法進(jìn)行分析，并建立了完整的質(zhì)量檢測方法。結(jié)果表明，本方法穩(wěn)定可靠、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好。可通過定量檢測利心丸（濃縮水丸）中防己諾林堿的含量，有效控制其產(chǎn)品質(zhì)量。

1.儀器與試藥

安捷倫1 100型高效液相色譜儀；KQ-250型臺(tái)式超聲波處理器（上海右一儀器有限公司）；HWS-26電熱恒溫水浴鍋（廣州滬瑞明儀器有限公司）；101A系列電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（常州華冠儀器制造有限公司）；P225D型天平（北京賽多利斯）。

防己諾林堿對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110793-200605），利心丸（濃縮水丸）樣品，吉林特研藥業(yè)有限公司生產(chǎn)（批號(hào)：20141201-20141205）；利心丸陰性樣品（自制）。甲醇、乙腈均為色譜純，水為純化水，其他試劑為分析純。

2.方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱：Inertsil ODS-3（5um，4.6mm×250mm）；流動(dòng)相：甲醇一乙腈一水一二乙胺（52：20：28：0.08）；檢測波長：282nm；流速：1mL/min；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10uL。

2.2溶液的制備

2.2.1對照品溶液的制備精密稱取防己諾林堿對照品5.39mg，置100mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制成53.9ug/mL的對照品溶液，備用。

2.2.2供試品溶液的制備取利心丸（濃縮水丸），研細(xì)，取約0.5g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加入2%鹽酸甲醇溶液50mL，稱定重量，回流提取30rain，放冷，再稱定重量，用2%鹽酸甲醇溶液補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3陰性對照溶液的制備取不含防己利心丸陰性樣品，按照利心丸（濃縮水丸）制備工藝制成缺防己的陰性樣品，再按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法，制成陰性對照溶液。

2.2.4專屬性考察分別精密吸取供試品溶液、對照品溶液陰性對照溶液（20、10、20uL）注入液相色譜儀中，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果表明，本方法具有良好的專屬性。色譜圖見圖1。

2.3線性關(guān)系考察

精密吸取2.2.1項(xiàng)下的防己諾林堿對照品3、6、9、12、15、18uL注入液相色譜儀進(jìn)行測定。以防己諾林堿進(jìn)樣量（ug）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)作圖，計(jì)算回歸方程為：Y=824.64X-1.463，r=0.9996。結(jié)果表明：防己諾林堿進(jìn)樣量在0.1617～0.9702ug范圍內(nèi)，進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.4中間精密度試驗(yàn)

取同一批利心丸樣品（批號(hào)：20141203）適量，共6份，精密稱定，分別按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，在同一實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，不同時(shí)間，由不同分析人員在不同的設(shè)備上進(jìn)行6次獨(dú)立測定，以測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差反映實(shí)驗(yàn)方法的精密度。測定結(jié)果表明，防己諾林堿的平均含量是55.58ug，g，RSD是1.94%（n=6），該方法中間精密度良好。

2.5重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批利心丸樣品（批號(hào)：20141203）6份，精密稱定，分別按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，在相同條件下，由同一分析人員在較短的間隔時(shí)間內(nèi)按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行6次獨(dú)立測定，計(jì)算防己諾林堿的含量，以測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差反映該測定方法的重復(fù)性。結(jié)果表明，樣品中防己諾林堿含量為55.08ug/g，RSD為1.43%（n=6）。表明本方法重復(fù)性良好。

2.6準(zhǔn)確度試驗(yàn)

精密稱取利心丸樣品6份（批號(hào)：20141203，防己諾林堿含量為55.08ug/g）各約0.25g，置于圓底燒瓶中，精密加入濃度為1.204ug，mL防己諾林堿對照品溶液1.0mL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法操作，制備供試品溶液，按上述色譜條件測定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

2.7樣品含量測定

取利心丸樣品各0.5g，精密稱定，進(jìn)行測定，計(jì)算防己諾林堿的含量，結(jié)果見表2。

2.8耐用性買驗(yàn)

2.8.1供試液穩(wěn)定性及儀器精密度實(shí)驗(yàn)取同一供試品溶液（批號(hào)：20141203）適量，按2.1”項(xiàng)下色譜條件不同時(shí)間重復(fù)進(jìn)樣測定6次，以測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）來反映測定儀器的精密度及供試液的穩(wěn)定性，結(jié)果見表3。根據(jù)上述測定結(jié)果可知，供試液在8h內(nèi)穩(wěn)定，且儀器精密度良好。

2.8.2柱溫對測定結(jié)果的影響按供試品溶液制備方法制備樣品液，按選定色譜條件分別于柱溫30℃、35℃、40℃進(jìn)樣測定，結(jié)果表明柱溫變化對分離效果及測定結(jié)果略有影響，但差異不大。

2.8.3不同品牌色譜柱按選定色譜條件分別采用三種色譜柱ZORBAX SB-Aq柱、Apollo C₁₈柱、Inertsil ODS-3色譜柱，進(jìn)樣測定。結(jié)果表明，Inertsil ODS-3色譜柱分離效果最好，故選用InertsilODS-3色譜柱。

3.討論

3.1目標(biāo)成分的選擇

關(guān)于利心丸的質(zhì)量研究，文獻(xiàn)報(bào)道主要集中在丹皮酚的含量測定及對地黃、防己和牡丹皮的TLC定性鑒別。本文通過系統(tǒng)的比較研究，首次建立防己諾林堿的含量檢測方法，是對利心丸原有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的必要補(bǔ)充，對指導(dǎo)制劑生產(chǎn)和控制產(chǎn)品質(zhì)量具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。

3.2色譜分離條件的選擇

流動(dòng)相的選擇，2015年版中國藥典防己藥材中防己諾林堿的測定方法，需要用冰醋酸調(diào)節(jié)pH-值，流動(dòng)相中還使用了十二烷基磺酸鈉，色譜條件較復(fù)雜。有文獻(xiàn)報(bào)道應(yīng)用乙腈一甲醇一水一三乙胺作為流動(dòng)相可對防己藥材中的防己諾林堿進(jìn)行良好的分離。本實(shí)驗(yàn)分別考查了甲醇一0.5%二乙胺、甲醇1%二乙胺、乙腈-0.5%二乙胺、乙腈-1%二乙胺等不同流動(dòng)相及不同比例，最后確定甲醇一乙腈一水一二乙胺（52：20：28：0.08）為流動(dòng)相，色譜條件比較簡單，分析圖譜的分離度、拖尾因子及對稱性等條件均達(dá)到《藥典》中的要求。本研究所建立的HPLC法可以使防己諾林堿與利心丸中的其他成分達(dá)到基線分離，分析時(shí)間短，結(jié)果準(zhǔn)確，可靠。

3.3樣品提取方法的選擇

本研究對利心丸不同的提取方法，索氏提取、水浴回流法和超聲提取法進(jìn)行了比較，并對不同的提取時(shí)間，20、30、40min進(jìn)行比較。最終優(yōu)選2%鹽酸甲醇溶液，加熱回流提取30min，作為樣品的提取方法。

本方法操作簡便，專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確度高，可用于利心丸中防己諾林堿的定量分析方法，為進(jìn)一步制定利心丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。