黃枝油杉遺傳多樣性的ISSR分析

謝偉玲　柴勝豐　蔣運生　唐健民　陳宗游　鄒蓉　韋霄

摘要： 該研究采用ISSR分子標記，對黃枝油杉7個自然種群的遺傳多樣性進行了分析。結(jié)果表明：用12條ISSR引物對218個黃枝油杉個體進行擴增，共擴增出125個位點。在物種水平上，多態(tài)性位點百分數(shù)（PPL）為100.00%，Shannon信息多樣性指數(shù)（I）為0.417 7，Neis基因多樣性指數(shù)（H）為0.266 6；在種群水平上，多態(tài)性位點百分數(shù)（PPL）在71.20%～92.00%之間，平均值為80.69%，Shannon信息多樣性指數(shù)（I）在0.327 3～0.388 6之間，平均值為0.354 8，Neis基因多樣性指數(shù)（H）在0.213 9～0.247 8之間，平均值為0.229 1。這說明黃枝油杉在物種水平和種群水平上均顯示出較高的遺傳多樣性。Neis遺傳多樣性分析（Gst=0.143 3）和AMOVA分析（Φst=17.91%）表明，黃枝油杉的遺傳變異主要存在于種群內(nèi)，種群間的遺傳分化程度較低，種群間保持一定的基因交流（Nm=2.989 0>1）。Mantel分析顯示，黃枝油杉種群間的遺傳距離和地理距離之間不存在顯著的相關(guān)關(guān)系（r=0.456 7， P=0.061 0>0.05）。

關(guān)鍵詞： 黃枝油杉， ISSR分子標記， 遺傳多樣性， 遺傳結(jié)構(gòu)， 保護策略

中圖分類號： Q943

文獻標識碼： A

文章編號： 10003142（2017）01003606

Abstract： ISSR markers were used to investigate the genetic diversity of seven natural populations of Keteleeria calcarea. Twelve ISSR primers produced 125 loci. At the species level， the percentage of polymorphic loci （PPL） was 100.00%， Shannons Information index （I） was 0.417 7 and Neis gene diversity index （H） was 0.266 6. At the population level， the percentage of polymorphic loci was 71.20%-92.00% and the average value was 80.69%， Shannons Information index （I） was 0.327 3-0.388 6 with the average value 0.3548 and Neis gene diversity index （H） was 0.213 9-0.247 8 with the average value 0.229 1. K. calcarea in both species and population levels showed higher genetic diversity. Neis genetic diversity analysis （Gst=0.143 3） and AMOVA analysis （Φst=17.91%） showed that the genetic variation of K. calcarea mainly occurred within populations， and the genetic differentiation among populations was low. The gene flow （Nm） between populations was high （2.989 0）. Mantel analysis showed that the genetic distance of K. calcarea natural populations had no significant correlation with their geographic distance （r=0.456 7， P=0.061 0>0.05）.

Key words： Keteleeria calcarea， ISSR markers， genetic diversity， genetic structure， conservation strategy

黃枝油杉（Keteleeria calcarea）是一種松科（Pinaceae）油杉屬（Keteleeria）的喜陽、常綠大喬木（何平，2005），為我國特有的珍稀瀕危樹種，同時是第三紀古老原始的樹種，主要分布于我國貴州、湖南、廣西一帶（李樹剛和梁疇芬，1990；沈燕等，2009；覃海寧，2010），例如平塘、獨山、江永、融安、桂林等地，生于海拔560～1 100 m的石灰?guī)r山坡。由于根系發(fā)達，并具有發(fā)達的皮層，因而具有很強的穿插力和貯藏較多水分，故能耐石山干旱生境，可用于石山綠化（彭少麟，2003）；其材質(zhì)堅固、木材紋理直、樹干通直、耐水浸，可用于造船、建筑、家具等（蔣柏生等，2008）。此外，由于其樹形優(yōu)美，枝繁葉茂、雄偉挺拔，可用作觀賞樹種（傅立國，1989）。20世紀70年代以來，黃枝油杉天然種群遭受嚴重破壞，野外種群數(shù)量銳減，分布區(qū)域狹窄，且母樹開花結(jié)實少，種子發(fā)育不良，天然更新能力較弱，已處于瀕危狀態(tài)。目前關(guān)于黃枝油杉的研究報道很少，大多集中在無性繁育技術(shù)（蔣柏生等，2008）、資源分布現(xiàn)狀（沈燕等，2009）、化學成分分析（何道航等，2006）、種群生態(tài)學（符支宏，2014）等方面。關(guān)于黃枝油杉遺傳多樣性的研究，至今尚未見有報道。

ISSR是基于PCR 技術(shù)、以簡單重復序列為引物的一種分子標記技術(shù)，由Zietkiewicz et al（1994）提出，具有多態(tài)性水平高、產(chǎn)物特異性強、DNA用量少以及穩(wěn)定性好等優(yōu)點，已廣泛應用于構(gòu)建遺傳圖譜（范付華等，2010；張林等，2012）、種質(zhì)資源鑒定（宋吉軒，2010；鄭鷺，2007）、品種親緣關(guān)系及分類研究（范付華等，2010；梁景霞等，2008）、分析遺傳多樣性（鄭鷺，2007；梁景霞等，2008）等方面。本文擬采用ISSR分子標記對黃枝油杉進行遺傳多樣性分析，揭示其種群遺傳多樣性水平和遺傳結(jié)構(gòu)，分析遺傳多樣性水平與瀕危原因的關(guān)系，并為黃枝油杉的資源保護制定科學合理的保護策略。

1材料與方法

1.1 材料

2014年9-12月，分別在桂林臨桂縣二塘沉橋村（LG）、桂林恭城縣三江三寨村（GC）、賀州富川縣麥嶺鎮(zhèn)櫟尾村（FC）、柳州融安縣都木村（RA）、河池南丹縣里湖鄉(xiāng)懷里村（ND）、貴州平塘縣者密鎮(zhèn)（PT）、貴州獨山縣堯棒鄉(xiāng)（DS）等黃枝油杉分布地采集7個種群生長良好的、健康的黃枝油杉葉片。每個種群各取27～33個個體，新鮮葉片迅速裝入封口袋，分別用硅膠迅速干燥固定，帶回試驗室分析。廣西植物研究所蔣運生研究員對所采集的樣品進行了鑒定，確定是黃枝油杉（Keteleeria calcarea）。各采樣地點的自然概況如表1所示。

1.2 方法

1.2.1 黃枝油杉總DNA的提取采用CTAB法提取黃枝油杉的總DNA，但在水浴前用-20 ℃預冷的丙酮洗兩次（代文娟，2006）。用濃度為0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗DNA的質(zhì)量和完整性，DNA的純度和濃度用NanoDrop 2000c 超微量分光光度計檢測，存儲在-20 ℃冰箱備用。

1.2.2 ISSR的擴增與檢測從100條ISSR引物中篩選出了12條擴增效果好、重復性好、具有多態(tài)性的引物（表2）對黃枝油杉7個自然種群共218個個體進行ISSR分析。采用25 μL體系，其中含有2.5 μL的10×PCR buffer、1.5 U的 Taq DNA聚合酶、1.0 μmol·L1的引物、2.0 mmol·L1 的Mg2+、0.10 mmol·L1 的dNTP、以及30 ng的模板DNA，剩余用滅菌的ddH2O補夠25 μL；擴增程序為94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，53～58 ℃（不同的引物，其退火溫度不同，具體見表2）退火45 s，72 ℃延伸90 s，以上3個步驟循環(huán)50次；最后72 ℃延伸7 min。PCR擴增產(chǎn)物用濃度為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳1～1.5 h，溴化乙錠（0.5 μg·mL1）染色20 min，用UVP凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。

1.2.3 數(shù)據(jù)整理及分析對種群遺傳參數(shù)的統(tǒng)計分析要在兩個假設(shè)下才能進行，即（1）種群處于HardyWeinberg平衡；（2）電泳遷移率相同的條帶是擴增基因組上相同DNA片段的產(chǎn)物。ISSR為顯性標記，根據(jù)電泳圖譜中擴增產(chǎn)物的有無及其分子量大小，將電泳圖譜中同一遷移位置上有清晰條帶（包括弱帶）的記為“1”，沒有條帶的記為“0”。應用POPGENE1.31軟件計算Neis基因多樣性指數(shù)（H）、多態(tài)性位點百分數(shù)（PPL）、觀察到的等位基因數(shù)（Na）、Shannon信息多樣性指數(shù)（I）、有效等位基因數(shù)（Ne），基因分化系數(shù)（Gst）、種群內(nèi)的基因多樣性（Hs）、種群總的基因多樣性（Ht）及 Neis遺傳距離（D），基因流（Nm）等。用win AMOVA 1.55軟件分析種群間和種群內(nèi)的遺傳變異。根據(jù)Neis遺傳距離（D）應用NTSYSpc 2.02軟件對7個黃枝油杉種群進行聚類分析。進一步用TFPGA軟件進行Mantel test分析，檢測7個黃枝油杉種群的遺傳距離和地理距離之間的關(guān)系。

2結(jié)果與分析

2.1 黃枝油杉的遺傳多樣性

用12條ISSR引物對218個黃枝油杉個體進行擴增，共擴增出125個位點。由表3可知，在物種水平上，Shannon 信息多樣性指數(shù)（I）為0.417 7，多態(tài)性位點百分數(shù)（PPL）為100.00%，有效等位基因數(shù)（Ne）為1.427 2，Neis基因多樣性指數(shù)（H）為0.266 6。

在種群水平上，7個種群的多態(tài)性位點百分數(shù)（PPL）在71.20%～92.00%之間，平均值為80.69%；Shannon 信息多樣性指數(shù)（I）在0.327 3～0.388 6之間，平均值為0.354 8，Neis基因多樣性指數(shù)（H）在0.213 9～0.247 8之間，平均值為0.229 1。其中遺傳多樣性最高的是柳州融安都木村（RA）種群（H=0.247 8， I=0.388 6， PPL=92.00%），其次是賀州富川櫟尾村（FC）種群（H=0.246 5， I=0.380 5， PPL=84.80%），最低的是貴州獨山堯棒鄉(xiāng)（DS）種群（H=

0.213 9， I=0.327 3， PPL=71.20%）。

2.2 黃枝油杉種群的遺傳結(jié)構(gòu)

基因分化系數(shù)（Gst）由種群總的基因多樣性（Ht）和種群內(nèi)的基因多樣性（Hs）計算得出。黃枝油杉種群總的基因多樣性（Ht）為0.267 4，種群內(nèi)的基因多樣性（Hs）為0.229 1， 基因分化系數(shù) （Gst）為0.143 3，由此可知，黃枝油杉總的遺傳變異中發(fā)生在種群之間的遺傳變異只有14.33%，其余的85.67%發(fā)生于種群內(nèi)。進一步對黃枝油杉的7個種群的遺傳變異進行AMOVA分析，種群間遺傳分化系數(shù)Φst=17.91%，表明在總的遺傳變異中，有17.91%的遺傳變異是發(fā)生在種群之間的，82.09%的遺傳變異是發(fā)生在種群內(nèi)的（表4），說明黃枝油杉的遺傳變異主要發(fā)生在種群內(nèi)，種群間的遺傳分化較小?；蛄鱊m =2.989 0>1，表明黃枝油杉種群之間保持一定的基因交流，不容易出現(xiàn)遺傳分化的現(xiàn)象。

2.3 黃枝油杉種群的聚類分析

根據(jù)Neis遺傳距離（表5）用NTSYSpc 2.02軟件對7個黃枝油杉種群進行聚類分析，聚類結(jié)果見圖1。由表5可知，河池南丹懷里村種群（ND）和貴州獨山堯棒鄉(xiāng)種群（DS）的遺傳一致度最大（0.966 9），遺傳距離最?。?.033 6）；賀州富川櫟尾村種群（FC）和貴州獨山堯棒鄉(xiāng)種群（DS）的遺傳一致度最?。?.916 1），遺傳距離最大（0.087 7）。由圖1的UPGMA聚類圖可知， 貴州獨山堯棒鄉(xiāng)種群（DS）和河池南丹懷里村種群（ND）先聚為一類，其余的5個種群聚為一大類，最后全部種群再匯聚成一類，7個種群并不是按照地理距離進行分支。進一步用TFPGA軟件進行Mantel test分析，結(jié)果表明黃枝油杉種群之間的遺傳距離和地理距離之間無顯著性差異（r=0.456 7， P=0.061 0>0.05）。

3討論

3.1 黃枝油杉遺傳多樣性評價

一般認為，瀕危物種擁有較低的遺傳多樣性水平，但研究發(fā)現(xiàn)，一些瀕危物種的遺傳多樣性水平保持在較高水平（錢迎倩和馬克平，1994；Grant，1991；Soltis PS & Soltis DE，1991）。在物種水平上，黃枝油杉的多態(tài)性位點百分數(shù)（PPL）為100.00%， Shannon信息多樣性指數(shù)（I）為0.417 7，Neis基因多樣性指數(shù)（H）為0.266 6，與其他的瀕危裸子植物，如代文娟（2006）研究的資源冷杉（PPL=63.38%，I=0.234 9，H=0.152 7）、袁建國（2005）研究的百山祖冷杉（PPL=42.68%，I=0.242 0，H=0.165 7）及李江偉（2014）研究的臺灣杉（PPL=78.21%，I=0.377 8，H=0.249 4）等相比，黃枝油杉總的遺傳多樣性顯示出較高的水平，表明黃枝油杉的適應環(huán)境的能力較強，進化潛力較大（Hogbin & Peakall，1999），其瀕危的原因并不是遺傳多樣性低的內(nèi)部因素造成的；但比劉曉燕（2007）研究的華東黃杉（PPL=90.79%，I=0.497 4，H=0.336 1）及張蕊（2009）研究的南方紅豆杉（PPL=98.89%，I=0.606 3，H=0.419 2）等的遺傳多樣性水平低。

Neis遺傳多樣性和AMOVA分析結(jié)果都揭示了黃枝油杉的遺傳變異主要發(fā)生在種群內(nèi)。黃枝油杉的基因分化系數(shù)（Gst）為0.143 3，總的遺傳變異中發(fā)生在種群之間的遺傳變異有14.33%，其余的85.67%發(fā)生于種群內(nèi)。AMOVA分析結(jié)果表明在總的遺傳變異中，有17.91%的遺傳變異是發(fā)生于種群之間的，82.09%的遺傳變異是發(fā)生在種群內(nèi)的?；蛄鱊m =2.989 0>1，表明黃枝油杉種群之間保持一定的基因交流，有效抵制了遺傳漂變的影響，不容易出現(xiàn)遺傳分化的現(xiàn)象。大量研究結(jié)果表明（Loveless & Hamriek，1984），裸子植物的生物學特性（如風媒傳粉、壽命長、頻繁的基因交流等）對其遺傳變異維持高水平和種群間較小的分化很有利，即使其分布范圍很窄，但其種群仍會擁有整個物種的大多數(shù)遺傳變異。

根據(jù)Neis遺傳距離對7個黃枝油杉種群進行聚類分析，結(jié)果顯示黃枝油杉7個種群并不是按照地理距離進行分支。進一步用TFPGA軟件進行Mantel test分析，結(jié)果表明黃枝油杉種群之間的遺傳距離和地理距離之間無顯著性差異（r=0.456 7， P=0.061 0>0.05）。

3.2 黃枝油杉保護建議

瀕危植物是植物遺傳育種的珍貴材料，很多瀕危植物具有巨大的經(jīng)濟價值和文化價值。瀕危植物是研究植物起源、進化的有力證據(jù)。植物瀕危是內(nèi)部因素和外部環(huán)境共同作用的結(jié)果，內(nèi)部因素包括遺傳力、生殖力、適應力等，外部環(huán)境包括自然災害、人為因素等。黃枝油杉為我國特有的珍稀瀕危樹種和中亞熱帶珍貴樹種，目前具有較高的遺傳多樣性，說明其瀕危的原因并不是遺傳多樣性低的內(nèi)部因素造成的。建議將遺傳多樣性最高的柳州融安都木村（RA）種群作為重點保護單元；建議保護好所有的黃枝油杉自然分布區(qū)生態(tài)環(huán)境，并盡可能保護種群內(nèi)的所有個體，防止人類繼續(xù)亂砍濫伐以及破壞其生境和生物群落結(jié)構(gòu)。此外，當?shù)氐牧謽I(yè)主管部門應加強對黃枝油杉的宣傳保護教育，讓當?shù)厝罕娏私恻S枝油杉的重要意義及價值，使廣大群眾形成自覺保護黃枝油杉的意識；有關(guān)執(zhí)法部門應該引起高度重視，嚴厲打擊和查處破壞黃枝油杉的犯罪活動，阻止黃枝油杉繼續(xù)遭受破壞。

參考文獻：

AI JG，2005. Studies on the endangerment mechanism and conservation strategies for Abies beshanzuensis [D]. Hangzhou：Zhejiang University. [哀建國，2005. 百山祖冷杉瀕危機制與保護對策研究 [D]. 杭州：浙江大學.]

DAI WJ，2006. Study on conservation genetics of Abies ziyuanensis [D]. Guilin：Guangxi Normal University： 8-9. [代文娟，2006. 資源冷杉的保護遺傳學研究 [D]. 桂林：廣西師范大學： 8-9.]

FU LG，1989. China rare and endangered plants [M]. Shanghai：Shanghai Education Press. [傅立國，1989. 中國珍稀瀕危植物 [M]. 上海：上海教育出版社.]

FAN FH，SHI WJ，RUAN RC，et al，2010. ISSR fingerprint and genetic relationship of 23 rice cultivars （ Lines ） [J]. Guizhou Agric Sci，38（9）：5-8. [范付華，施文娟，阮仁超，等，2010. 23個水稻品種（系）的ISSR指紋圖譜及其親緣關(guān)系 [J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學，38（9）：5-8.]

FU ZH，2014. Ecological study of Keteleeria calcarea populations of Guilin [D]. Guilin： Guangxi Normal University. [符支宏，2014. 桂林黃枝油杉種群生態(tài)學研究 [D]. 桂林： 廣西師范大學.]

Grant V，1991. The evolutionary process：a critical study of evolutionary theory [J]. 2nd ED. New York：Columbia University Press.

HOGBIN PM，PEAKALL R，1999. Evaluation of the contribution of genetic research to the management of the endangered plant Zieria prostrate [J]. Conserv Biol，13（3）：514-522.

HE P，2005. The rare and endangered plant protection biology [M]. Chongqing Southwest Normal University Press. [何平，2005. 珍稀瀕危植物保護生物學 [M]. 重慶：西南師范大學出版社.]

HE DH，PANG Y，SONG SY，et al，2006. Chemical constituents of essential oil from twigs of Keteleeria calcarea [J]. Biomass Chem Eng，40（2）：8-10. [何道航，龐義，宋少云，等，2006. 黃枝油杉嫩枝中精油的化學成分研究 [J]. 生物質(zhì)化學工程，40（2）：8-10.]

JIANG BS，WEN GX，TANG Y，et al，2008. Effects of different treatments on cottage cultivation and growth of Keteleeria calcarea [J]. Guihaia，28（4）：549-552. [蔣柏生，文桂喜，唐蕓，等，2008. 不同處理對瀕危植物黃枝油杉扦插育苗的影響 [J]. 廣西植物，28（4）：549-552.]

LOVELESS MD，HAMRIEK JL，1984. Ecological determinant of genetic structure in plant populations [J]. Ann Rev Evol Syst，15：65-95.

LI SG，LIANG CF，1990. Plant resources in Guangxi [M]. Beijing： Beijing Science and Technology Press. [李樹剛，梁疇芬，1990. 廣西植物資源 [M]. 北京：北京科學技術(shù)出版社.]

LIU XY，2007. Genetic diversity analysis and protection of endanged plant Pseudotsuga gaussenii Flous [D]. Nanchang：Nanchang University. [劉曉燕，2007. 瀕危植物華東黃杉遺傳多樣性分析及保育 [D]. 南昌：南昌大學.]

LIANG JX，QI JM，F(xiàn)ANG PP，et al，2008. Genetic diversity and genetic relatives analysis of tobacco germplasm based on intersimple sequence repeat （ISSR） [J]. Sci Agric Sin，41（1）：286-294. [梁景霞，祁建民，方平平，等，2008. 煙草種質(zhì)資源遺傳多樣性與親緣關(guān)系的ISSR聚類分析 [J]. 中國農(nóng)業(yè)科學，41（1）：286-294.]

LI JW，YANG QJ，LIU XQ，et al，2014. Genetic diversity of Taiwania cryptomerioides detected by ISSR analysis [J]. Sci Silv Sin，50（6）：61-66. [李江偉，楊琴軍，劉秀群，等，2014. 臺灣杉遺傳多樣性的ISSR分析 [J]. 林業(yè)科學，50（6）：61-66.]

PENG SL，2003. Rare and endangered plants in Guangdong [M]. Guangzhou：Science Press. [彭少麟，2003. 廣東珍稀瀕危植物 [M]. 廣州：科學出版社.]

QIAN YQ，MA KP，1994. The principle and methods of biodiversity research [M]. Beijing：Science and Technology of China Press： 123-140. [錢迎倩，馬克平，1994. 生物多樣性研究的原理與方法 [M]. 北京：中國科學技術(shù)出版社： 123-140.]

QIN HN，LIU Y，2010. List of plants in Guangxi [M]. Beijing： Science Press. [覃海寧，劉演，2010. 廣西植物名錄 [M]. 北京：科學出版社.]

SOLTIS PS，SOLTIS DE，1991. Genetic variation in endemic and widespread plant species：examples from Saxifragaceae and Polystichum （Dryopteridaceae） [J]. Aliso，13（1）：215-223.

SHEN Y，CAO JW，LIU CL，et al，2009. Resource status and artificial cultivation technology of endangered Keteleeria calcarea in Hunan [J]. J Fujian For Sci Technol，36（3）：107-110. [沈燕，曹基武，劉春林，等，2009. 湖南瀕危植物黃枝油杉的資源現(xiàn)狀及人工栽培技術(shù) [J]. 福建林業(yè)科技，36（3）：107-110.]

SONG JX，2010. Guizhou sweetpotato germplasm resources determination and ISSR analysis of genetic diversity [D]. Chongqing： Southwest University. [宋吉軒，2010. 貴州甘薯種質(zhì)資源鑒定與ISSR遺傳多樣性分析 [D]. 重慶：西南大學.]

ZIETKIEWICZ E，RAFALSKI A，LABUDA D，1994. Genome fingerprinting by simple sequence repeat （SSR）anchored polymerase chain reaction amplification [J]. Genomics，20（2）：176-183.

ZHENG L，2007. The eva1uation and ISSR&SRAP molecular tagging of genetic variation in ricinus [D]. Fuzhou： Fujian Agriculture and Forestry University. [鄭鷺，2007. 蓖麻種質(zhì)資源鑒定評價及遺傳多樣性ISSR與SRAP分析 [D]. 福州：福州福建農(nóng)林大學.]

ZHANG R，ZHOU ZC，JIN GQ，et al，2009. Genetic diversity and genetic differentiation of Taxus wallichiana var. mairei provenances [J]. Sci Silv Sin，45（1）：50-55. [張蕊，周志春，金國慶，等，2009. 南方紅豆杉種源遺傳多樣性和遺傳分化 [J]. 林業(yè)科學，45（1）：50-55.]

ZHANG L，XU YC，CHENG HZ，et al，2012. Genetic relationship analysis and fingerprint construction of 62 cultivars of Hippeastrum spp. based on ISSR marker [J]. J Plant Resour Environ，21（4）：48-54. [張林，徐迎春，成海鐘，等，2012. 基于ISSR標記的62個朱頂紅品種的遺傳關(guān)系分析及指紋圖譜構(gòu)建 [J]. 植物資源與環(huán)境學報，21（4）：48-54.]