野生大豆與栽培大豆雜交F1代ISSR多態(tài)性分析

熊振宇 李海波 余爽

摘要[目的]探究野生大豆與栽培大豆之間遺傳多態(tài)性的差異，以期為大豆雜交育種的親本選配提供理論依據(jù)。 [方法]用20對(duì)ISSR引物對(duì)野生大豆與栽培大豆及其10份雜種F1材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，探討野生大豆與栽培大豆之間的遺傳關(guān)系。 [結(jié)果]此次試驗(yàn)共擴(kuò)增出167條帶，其中121條為多態(tài)性帶，多態(tài)率達(dá)72.45 %；雜交F1代材料與其母本中黃19及父本ZYD04350間的平均遺傳相似系數(shù)分別為0.65和0.47。 [結(jié)論]栽培大豆與野生大豆雜交F1代材料間存在著豐富的變異，雜交F1代從母本獲得的遺傳物質(zhì)多于父本。

關(guān)鍵詞野生大豆；栽培大豆；ISSR；多態(tài)性

中圖分類號(hào)S565.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A文章編號(hào)0517-6611（2017）10-0137-03

ISSR Polymorphism Analysis of F1 Hybrids of Glycine soja and Glycine max

XIONG Zhenyu，LI Haibo，YU Shuang*（School of Biology and Pharmaceutical Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan，Hubei 430000）

Abstract[Objective] To sudy the difference of genetic polymorphism between Glycine soja and Glycine max，so as to provide theory evidence for Glycine max crossbreeding. [Method] Twenty primers were used for ISSR analysis on Glycine soja，Glycine max and 10 F1 hybrids，to study the genetic relationship of Glycine soja and Glycine max. [Result] Total 167 bands were amplified in the PCR reactions.Among them 121 were polymorphic bands and the polymorphic rate was 72.45%.The average genetic coefficients between Zhonghuang 19 and F1 progenies，ZYD04350 and F1 progenies were 0.65 and 0.47，respectively. [Conclusion]There was abundant genetic variation among F1 progenies derived from crossing between Glycine soja and Glycine max，

genetic material of F1 hybrids obtained from maternal was more than male parents.

Key wordsGlycine soja；Glycine max；ISSR；Polymorphism

大豆（Glycine max）作為重要的油料和糧食作物，在世界范圍內(nèi)得到了廣泛種植。隨著栽培大豆品種推廣年限的延長，品種間的遺傳基礎(chǔ)日益狹窄，變異幅度逐漸變小，優(yōu)異性狀不斷丟失[1-2]。因此優(yōu)良種質(zhì)資源的挖掘創(chuàng)新顯得十分重要。

野生大豆（Glycine soja）作為栽培大豆的祖先，在長期的自然選擇過程中，形成了極其豐富的變異類型，具有許多栽培大豆無法比擬的優(yōu)勢(shì)：①野生大豆富含蛋白質(zhì)，是一種高蛋白植物。徐豹等[3]、楊光宇等[4]研究表明，野生大豆的蛋白含量明顯高于栽培大豆，平均含量可達(dá)45.4%，最高達(dá)55.4%。②野生大豆單株莢數(shù)較多，種子繁殖系數(shù)較高。王克晶等[5-6]研究發(fā)現(xiàn)栽培大豆中一般種質(zhì)每株莢數(shù)都在100個(gè)以下，而在野生大豆中一般每株莢數(shù)可達(dá)400～500個(gè)，甚至上千個(gè)。③野生大豆具有抗逆性強(qiáng)、適應(yīng)范圍廣的特點(diǎn)。目前，相關(guān)學(xué)者已鑒定出抗旱、抗?jié)?、抗鹽堿等對(duì)逆境脅迫有較強(qiáng)抗性的野生大豆材料[7-8]。同時(shí)對(duì)于野生大豆在抗灰斑病、蚜蟲、大豆胞囊線蟲病、花葉病毒等生物脅迫方面也有相關(guān)報(bào)道[9-10]。野生大豆作為栽培大豆的近緣野生種，兩者之間不存在種間雜交障礙和遺傳隔離，故可以通過雜交技術(shù)將優(yōu)良野生大豆資源引入到栽培大豆育種研究中，這對(duì)大豆遺傳基礎(chǔ)的拓寬，優(yōu)良新品種的選育等起到極其重要的作用[11-14]。

伴隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，遺傳多樣性的檢測(cè)已從傳統(tǒng)的表型標(biāo)記、同工酶標(biāo)記發(fā)展到分子標(biāo)記。AFLP、RFLP、RAPD等分子標(biāo)記技術(shù)都在檢測(cè)植物遺傳多樣性研究中得到應(yīng)用，但都存在一些缺點(diǎn)。AFLP分子標(biāo)記操作較為繁瑣、耗時(shí)；RFLP分子標(biāo)記技術(shù)需用到同位素，對(duì)人體傷害較大；RAPD分子標(biāo)記技術(shù)穩(wěn)定性差。而ISSR（Inter Simple Sequence Repeat，簡單序列重復(fù)區(qū)間）分子標(biāo)記技術(shù)是 Zietkiewicz等[15]發(fā)明的，與其他分子標(biāo)記相比，具有適用范圍廣、成本低、操作簡單、穩(wěn)定性高和多態(tài)性豐富等特點(diǎn)。目前，ISSR分子標(biāo)記技術(shù)在油菜[16]、水稻[17]、茶樹[18]、小麥[19]和百合[20]等植物的遺傳多樣性分析、基因定位、種子純度鑒定等研究中得到了廣泛利用。利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)探討野生大豆與栽培大豆雜交F1代植株與其親本間遺傳多態(tài)性的差異，以期為大豆雜交育種的親本選配提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1植物材料。試驗(yàn)材料為中黃19（栽培大豆）、ZYD04350（野生大豆）及其10個(gè)雜交F1代植株，材料名稱見表1。

1.2方法

1.2.1DNA提取。選取盛花期大豆植株頂部幼嫩的葉片，液氮保存。總DNA的提取采用CTAB法[21]，并根據(jù)大豆自身特點(diǎn)加以改良。DNA質(zhì)量檢測(cè)采用1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.2 ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立。ISSR-PCR反應(yīng)體系為2×PCR mix 12.5 μL，ISSR引物（10 ng/μL）2 μL，DNA模板（10 ng/μL）2 μL，補(bǔ)水至25 μL。反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，50～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸80 s，循環(huán)30次；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

1.2.3瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。利用20對(duì)多態(tài)性引物對(duì)試驗(yàn)材料進(jìn)行篩選，擴(kuò)增產(chǎn)物利用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，100 V電壓條件下電泳，直至標(biāo)記染料完全跑出（約1 h）。電泳結(jié)束后于凝膠成像系統(tǒng)內(nèi)分析、拍照。

1.3數(shù)據(jù)分析將瓊脂糖凝膠電泳圖根據(jù)條帶的有無轉(zhuǎn)化為0/1數(shù)據(jù)（有條帶的記1，無條帶的記0），利用NTSYSpc2軟件分析材料間的遺傳相似系數(shù)和構(gòu)建聚類樹狀圖。

2結(jié)果與分析

2.1DNA質(zhì)量檢測(cè)CTAB法提取植物材料葉片DNA，1%瓊脂糖電泳檢測(cè)結(jié)果如圖1所示， 所提DNA條帶清晰，無雜質(zhì)、無降解，質(zhì)量較高，可以用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2ISSR-PCR擴(kuò)增利用20對(duì)ISSR引物對(duì)野生大豆與栽培大豆及其10個(gè)雜交F1代進(jìn)行擴(kuò)增，各引物擴(kuò)增的帶數(shù)及多態(tài)性條帶數(shù)目如表3所示。共得到167條帶，其中引物B2擴(kuò)增帶數(shù)最多，為15條，引物B9和B15最少，為5條，平均每個(gè)引物擴(kuò)增條帶8.15條。其中多態(tài)性條帶121條，多態(tài)率為72.45%。圖2是引物B2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖。

2.3親本及雜交F1代遺傳相似系數(shù)分析試驗(yàn)利用20對(duì)ISSR引物對(duì)2個(gè)親本及其10個(gè)雜交F1進(jìn)行多態(tài)性分析，將電泳結(jié)果轉(zhuǎn)化為0/1數(shù)據(jù)，并利用NTSYSpc2軟件進(jìn)行遺傳系數(shù)分析，其結(jié)果如表4所示。2個(gè)親本間的遺傳相似系數(shù)最小為0.35，子代材料A1與A9之間遺傳相似系數(shù)最大為0.87。10個(gè)子代單株與母本的遺傳相似系數(shù)在0.55～0.71，平均遺傳相似系數(shù)為0.65。子代單株與父本間的遺傳相似系數(shù)在0.38～0.53，平均遺傳相似系數(shù)為0.47。

2.4親本及雜交F1代聚類分析 根據(jù)遺傳相似系數(shù)矩陣進(jìn)行UPGMA聚類分析，結(jié)果如圖3所示。通過聚類圖可知，群體被分為二大類，第1類為父本，第2類為母本及雜交F1代單株，其可分為母本P1和雜交F1代二大亞支，在雜交F1代亞支中，又分為3個(gè)分支，第1分支包括A1、A9和A10，第2分支包括A2、A8、A3和A4，第3分支包括A5、A6和A7。親本P1與P2被分在二大類中，在聚類圖中距離最遠(yuǎn)，說明雙親野生大豆與栽培大豆存在著不同的遺傳背景。母本與所有雜交F1代被分在第二大類中，說明雜交F1代與母本間的親緣關(guān)系更近。從圖3可以看出，母本P1、父本P2和所有雜交F1代分別處于3個(gè)亞支中，暗示在親緣關(guān)系上，雜交F1代之間比其與雙親間更近。

3結(jié)論與討論

該研究利用ISSR分子標(biāo)記分析野生大豆與栽培大豆及其F1代的遺傳多態(tài)性差異，結(jié)果表明ISSR分子標(biāo)記具有較高的多態(tài)性。其擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)無須利用復(fù)雜繁瑣的聚丙烯酰胺凝膠電泳，2%瓊脂糖電泳即可很好地分辨，操作簡單，方便快捷。因此，ISSR作為一種良好的分子標(biāo)記技術(shù)，在分子標(biāo)記輔助育種和遺傳多樣性檢測(cè)等研究中有廣闊的前景[22]。

該研究中，雜交F1代及雙親在遺傳相似系數(shù)上有較大差異。親本野生大豆與栽培大豆間遺傳相似系數(shù)為0.35，為所有試驗(yàn)材料中最小，說明野生大豆與栽培大豆間存在著遺傳多樣性的差異。另外，各子代材料與父本及母本的平均遺傳相似系數(shù)分別為0.47和0.65，低于父母本之間遺傳相似系數(shù)，暗示著子代材料已融合雙親遺傳物質(zhì)。

通過雙親及雜交F1代的遺傳相似系數(shù)及聚類分析圖可以發(fā)現(xiàn)，雜交F1代存在不均等的獲得雙親遺傳物質(zhì)的現(xiàn)象，這種不均等性表現(xiàn)為雜交F1代能更多地得到母本的遺傳物質(zhì)。一個(gè)可能的原因是雜交F1代獲得母本的細(xì)胞質(zhì)遺傳物質(zhì)——線粒體及葉綠體基因。但在劉夢(mèng)培等[23]的研究中，利用ISSR分子標(biāo)記分析3個(gè)雜交組合及其子代的遺傳變異中僅有1個(gè)組合出現(xiàn)這種現(xiàn)象，說明此種現(xiàn)象不只是由細(xì)胞質(zhì)遺傳造成的，還可能存在其他原因。同時(shí)在生產(chǎn)上將優(yōu)良種質(zhì)作為母本配制雜交組合，子代有更大幾率獲得更多母本的優(yōu)良性狀，對(duì)雜交育種中的親本選配工作具有積極的作用。

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