基于ITS的我國?？浦参锓肿酉到y(tǒng)學研究

劉玲 陳仁芳 陳祥平 范小敏 柯皓天 呂銀 杜國良

摘要[目的]基于ITS序列初步探討我國?？浦参锏姆肿酉到y(tǒng)學。[方法]測定33份桑科材料的ITS序列，通過最大簡約法分析它們的分子系統(tǒng)學，并將分析結果與經(jīng)典分類做比較。[結果]在原始類群和單系類群的確定上與經(jīng)典分類基本一致；“刺桑、葉被木、圓葉刺桑與桑屬的親緣關系近”這一結果與經(jīng)典分類不一致。[結論]該研究為我國?？浦参锏南到y(tǒng)學分析積累了分子生物學資料。

關鍵詞?？浦参?；ITS序列；分子系統(tǒng)學

中圖分類號S888文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）12-0126-04

Abstract[Objective] To analyze molecular phylogeny of Moraceae in China based on ITS. [Method] The ITS sequences of 33 individuals were determined， and the molecular phylogeny was alalyzed by maximum parsimonious.Then we compared the results of the analysis with the classical classification. [Result] The determination of primitive and monophyletic groups is basically consistent with the classical classification. The result showed that Taxotrophis ilicifolius， Streblus taxoides， Taxotrophis aquifolioides were close to Morus Linn. is not consistent with the classical classification. [Conclusion] This research had accumulated molecular biology data for the classification of Moraceae in China.

Key wordsMoraceae；ITS sequence；Molecular phylogeny

?？浦参锏姆诸愖钤缈勺匪莸?753年林奈的《植物種志》[1]，隨后Moretti等[2]、Seringe等[3]、Bureau等[4]、Koidzumi等[5]都對?？浦参锏姆诸愡M行了研究。我國植物分類學家陳嶸在《中國樹木分類學》中將我國?？浦参锓譃?屬[6]。胡先骕[7]在《植物分類學簡編》中將?？浦参锓譃?亞科?！吨袊参镏尽凡捎肊ngler（1936年）系統(tǒng)將?？浦参锓譃?亞科12屬[8]。 2002年吳征鎰等[9]提出被子植物的一個“多系-多期-多域”新分類系統(tǒng)，以此為依據(jù)在《中國被子植物科屬綜論》中將桑科植物分為5族12屬，并將大麻亞科提升為大麻科。張宏達[10]在《種子植物系統(tǒng)學》中將?？浦参锓譃?亞科8屬，同樣將大麻亞科提升為大麻科。

目前，關于?？频姆肿酉到y(tǒng)學研究僅見Zerega等[11]利用26S rDNA和葉綠體ndhF基因序列研究了美洲?？浦参锏姆肿酉到y(tǒng)發(fā)育。而我國?？浦参锏姆肿酉到y(tǒng)學研究鮮見報道。

高等植物核糖體DNA內轉錄間隔區(qū)（Internal transcribed spacer，ITS）位于18S、5.8S和26S基因之間，由于不加入成熟的核糖體，受到的選擇壓力較小，進化速度較快，在被子植物中相對長度具有保守性，適用于屬間、種間的系統(tǒng)發(fā)育分析[12-14]。該研究收集我國33份?？撇牧?，以北美蟻棲樹屬蟻棲樹（Cecropia peltala Linn.）為外類群，測定它們的ITS序列，用最大簡約法分析我國桑科植物的系統(tǒng)發(fā)育關系，初步分析我國?？浦参锏姆肿酉到y(tǒng)學，為我國?？浦参锓诸惙e累分子生物學資料。

1材料與方法

1.1材料

試驗材料取自海南、廣西、云南、貴州、重慶、四川、新疆等地（表1），采集各樣品葉片，材料經(jīng)鑒定核實無誤后采回。

1.2方法

1.2.1DNA提取與質量測定。

DNA提取采用稍加改進的CTAB法[15]，從約0.15 g硅膠干燥的嫩葉中提取，DNA的質量和濃度用1%瓊脂糖凝膠電泳和微量紫外分光光度計檢測，電泳時用λDNA作Marker；電泳完成后用凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.2.2PCR擴增與測序。

PCR反應體系共20 μL，包括DNA模板（10 ng/μL）1 μL，10×PCR Buffer 2 μL，Mg2+（2.5 mmol/L）1.6 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）1.6 μL，正反向引物（50 ng/μL）各1 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.15 μL，ddH2O補足至20 μL。PCR反應擴增程序：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性1 min，55℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共33個循環(huán)；72 ℃延伸7 min，最后10 ℃保存。擴增引物ITS5：5′—GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG—3′，ITS4：5′—TCCTCCGCTTATTGATATGC—3′[16]，測序由上海生物工程技術服務有限公司完成。

1.3數(shù)據(jù)分析

測序結果用Sequencher4.1.4軟件拼接，對少數(shù)誤判堿基根據(jù)堿基峰形進行更正。利用ClustalX 1.83c軟件[17]進行序列比對，根據(jù)GenBank公布的菩提樹（Ficus religiosa，AY063582）18S rRNA基因3′端堿基序列attgtcga，5.8S基因的5′端堿基序列aagaacg，3′端堿基序列acacgcc，26S rRNA基因5′端堿基序列aacgcgaac，確定34份材料的ITS及ITS1、5.8S、ITS2的序列范圍。用Bioedit軟件除去非ITS序列。用DNAstar軟件分析ITS序列長度、GC含量。用PAUP Ver.4.0b10軟件[18]基于最大簡約法分析進化關系。

2結果與分析

2.1ITS序列長度、GC含量由表2可知，34份材料的ITS長度在574～651 bp，GC含量在54.22%～66.03%；ITS1長度在223～283 bp，GC含量在52.73%～69.75%；5.8S長度在124～169 bp，GC含量在52.23%～58.06%；ITS2長度在204～236 bp，GC含量在53.71%～70.51%。

2.2基于ITS的進化關系

用PAUP Ver.4.0b10軟件最大簡約法分析供試材料間的進化關系，構建的系統(tǒng)發(fā)育樹參數(shù)如下：樹長（Tree length）為2 060，一致性指數(shù)（Consistency index，CI）為0.552 4，保持性指數(shù)（Retention index，RI）為0.656 9，調整后的一致性指數(shù)（Rescaled consistency index，RC）為0.362 9。序列比對共693個位點，其中74個不變位點，189個變異非信息位點，430個信息位點。

分支圖首先將外類群蟻棲樹分出，接著分出的是葎草，自檢支持率Bootstrap為100%，后面依次是藤構、楮、構樹、牛筋藤。剩余材料分為兩大支，Branch 1和Branch 2。Branch 1包括榕屬，見血封喉，鵲腎樹，自檢支持率Bootstrap為54%。Branch 2首先將假鵲腎樹分出，接著分出的是細齒水蛇麻、葨芝、柘樹，自檢支持率Bootstrap為73%。波羅蜜屬和桑屬分別聚為1支，支持率為100%。圓葉刺桑、刺桑、葉被木聚為1支，自檢支持率Bootstrap為97%，并且它們與桑屬聚在一大支，支持率為100%。

3結論與討論

（1）構屬和牛筋藤屬是原始類群。

分支圖緊接外類群分出的是構屬的藤構、楮、構樹和牛筋藤屬的牛筋藤。根據(jù)外類群確定法，認為構屬和牛筋藤屬為原始類群。

《中國植物志》將?？品譃?亞科、7族、12屬，桑亞科是第1亞科，認為該亞科是原始類群。構屬和牛筋藤屬分別是桑亞科的族3構樹族的第3、4屬，族1、族2分別是水蛇麻族和桑族，它們比族3更原始；《中國被子植物科屬綜論》中，桑族是?？频牡?族，屬于原始類群，桑屬、構屬、牛筋藤屬是其前3屬。因此，在原始類群的確定上該研究與經(jīng)典分類基本一致。

（2）榕屬、波羅蜜屬、桑屬為單系類群，鵲腎樹屬為非單系類群。

分支圖將榕屬、波羅蜜屬、桑屬分在一個分支，認為這3個屬是單系類群；與2種經(jīng)典分類一致。

鵲腎樹屬的鵲腎樹、假鵲腎樹、葉被木、刺桑、圓葉刺桑分在不同分支，認為鵲腎樹屬為非單系類群。2種經(jīng)典分類都將鵲腎樹屬分為5組。組1.鵲腎樹組（Sect.Streblus），2種：鵲腎樹、米揚噎（Streblus tonkinensis）；組2.葉被木組（Sect.Phyllochlamys），1種：葉被木；組3.假鵲腎樹組（Sect.Pseudostreblus），1種：假鵲腎樹；組4.尾葉刺桑組（Sect.Taxotrophis），我國1種，尾葉刺桑（Streblus zeylanicus）；組5.刺桑組（Sect.Pseudotrophis），我國2種，雙果桑（Streblusmacrophyllus）、刺桑?！逗Ｄ现参镏尽穼⒓蠃o腎樹命名為Pseudostreblus indicus，將葉被木命名為Phyllochlamys taxoides，將刺桑命名為Taxotrophis ilicifolius[17]，從這些同種異名也可以看出鵲腎樹屬為非單系類群。

因此，基于ITS的研究結果對單系類群的確定與經(jīng)典分類一致。

（3）見血封喉與榕屬的親緣關系近，細齒水蛇麻與柘屬的親緣關系近，刺桑、葉被木、圓葉刺桑與桑屬的親緣關系近。

分支圖中，見血封喉與榕屬聚在一支，說明它們的親緣關系近。在《中國植物志》中，見血封喉族和榕族分別是族6和族7。在《中國被子植物科屬綜論》中，見血封喉族和榕族分別位于族3和族4。因此，2種經(jīng)典分類都支持這一結果。

分支圖將細齒水蛇麻與柘屬分在一個分支上，表示它們的親緣關系近。在《中國植物志》中，細齒水蛇麻屬于族1水蛇麻族，柘屬處在族5波羅蜜族，認為它們的親緣關系較遠；而在《中國被子植物科屬綜論》中，柘屬和細齒水蛇麻分別屬于桑族的第5、7屬，系統(tǒng)位置較近。因此，該結果支持吳征鎰等的觀點。

2種經(jīng)典分類都認為桑屬是原始類群，刺桑、圓葉刺桑和葉被木都屬于族4.鵲腎樹族鵲腎樹屬。桑屬和鵲腎樹屬雖然都在桑亞科或者桑族，但它們的系統(tǒng)位置有一定距離。因此，2種經(jīng)典分類都不支持刺桑、葉被木、圓葉刺桑與桑屬的親緣關系近。

參考文獻

[1] LINNAEUS C V.Species plantarum[M].Stockholm：Laurentii Salvii，1753：986.

[2] MORETTI G.Prodromo di una monografia delle specie del genere Morus[J].Istituto lombardo di scienze elettere，1842（1）：167.

[3] SERINGE N C.Description Culture et taille des Murierrs[M].Paris：Victor Masson，1855.

[4] BUREAU L E.Moraceae[M]//CANDOLLE A P.Prodromus Systematis Naturalis Regni Vegetabilis（part XⅦ）.Geneva：[s.n.]，1873.

[5] KOIDZUMI G.Taxonomical discussion on Morus plants[J].Bull Imp Sericult Exp Stat，1917（3）：1-62.

[6] 陳嶸.中國樹木分類學[M].北京：科學技術出版社，1953：228-231.

[7] 胡先骕.植物分類學簡編[M].北京：高等教育出版社，1955：56.

[8] 張秀實，吳征鎰，曹子余.中國植物志：第23卷第1分冊[M].北京：科學出版社，1998.

[9] 吳征鎰，路安民，湯彥承，等.中國被子植物科屬綜論[M].北京：科學出版社，2003：560-562.

[10] 張宏達.種子植物系統(tǒng)學[M].北京：科學出版社，2004：98-101.

[11] ZEREGA N J C，CLEMENT W L，DATWYLER S L，et al.Biogeography and divergence times in the mulberry family（Moraceae）[J].Mol Phylogenetics Evol，2005，37（2）：402-416.

[12] BALDWIN B G，SANDERSON M J，PORTER J M，et al.The its region of nuclear ribosomal DNA：A valuable source of evidence on angiosperm phylogeny[J].Ann Mo Bot Gard，1995，82（2）：247.

[13] KRESS W J，LIU A Z，NEWMAN M，et al.The molecular phylogeny of Alpinia （Zingiberaceae）：A complex and polyphyletic genus of gingers[J].Am J of Bot，2005，92（1）：167-178.

[14] 史全良，趙衛(wèi)國.桑樹ITS序列測定及特點的初步分析[J].蠶業(yè)科學，2001，27（2）：140-141.

[15] THOMPSON J D，GIBSON T J，PLEWNIAK F，et al.The ClustalX windows interface：Flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools[J].Nucleic acids research，1997，25（24）：4876-4882.

[16] SWOFFORD D L.PAUP*：Phylogenetic analysis using parsimony（and other methods）[M].Version 4.[s.l.]：[s.n.]，2001.

[17] 陳煥鏞.海南植物志：第二卷[M].北京：科學出版社，1965：371-400.