黔產(chǎn)野生水芹水溶性總黃酮純化工藝

陳曉靚 郭曉青 羅顯華 吳娜怡郁 代甜甜

摘要[目的]考察大孔樹脂對黔產(chǎn)野生水芹（簡稱水芹）水溶性總黃酮的純化條件。[方法]測定 AB-8、DM-130和HP-20 3種大孔樹脂對水芹總黃酮的吸附量及解吸率，篩選樹脂型號；以總黃酮含量為指標，采用單因素試驗優(yōu)選HP-20樹脂純化工藝。[結(jié)果]HP-20型大孔樹脂分離純化水芹總黃酮最佳的工藝條件為：料液比為1∶30（g∶ mL），靜置吸附時間為6 h，解吸液乙醇溶液的體積分數(shù)為70%，pH為3，解吸溫度為40 ℃，經(jīng)HP-20處理后的水芹總黃酮純度較高（提高了9.4倍）。[結(jié)論]HP-20樹脂較適于分離純化黔產(chǎn)野生水芹水溶性總黃酮，為水芹的開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

關(guān)鍵詞黔產(chǎn)野生水芹；大孔樹脂；靜態(tài)吸附；總黃酮類；純化工藝

中圖分類號S647；R284.2文獻標識碼

A文章編號0517-6611（2017）12-0106-04

Abstract[Objective] The research aimed to study the purification conditions of watersoluble total flavonoids from wild Oenanthe javanica in Guizhou Province.[Method]The adsorption quantity and desorption rate of three kinds of macroporous resins （AB-8、DM-130 and HP-20） were measured for total flavonoids of Oenanthe javanica，resin type was selected.Using the content of total flavonoids as index，the single factor experiment was used to optimize the purification process of HP-20 resin.[Result]The optimum process conditions of separation and purification of total flavonoids from Oenanthe javanica for HP-20 macroporous resin：solidliquid ratio was 1∶30 （g∶ mL），standing time was 6 h，the volume fraction of the desorption ethanol solution was 70%，pH value of sample was 3，the desorption temperature was 40 ℃。The total flavonoids had high purity after HP-20 macroporous resin （increased 9.4 times）.[Conclusion]HP-20 resin is suitable for separation and purification of watersoluble total flavonoids，to provide a scientific basis for the development and utilization of Oenanthe javanica.

Key wordsWild Oenanthe javanica in Guizhou Province；Macroporous resin；Static adsorption；Total flavonoids；Purification process

黃酮類化合物具有廣泛的藥理活性，如使血管的滲透壓保持正常、降低血管脆性、降低人體膽固醇含量、抗過敏、降血壓、抑制癌變和糖病毒作用等[1-5]，在醫(yī)藥食品等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，近年來成為國內(nèi)外諸多學者研究開發(fā)和利用的熱點。因此，有效地分離提純黔產(chǎn)野生水芹中總黃酮類物質(zhì)對開發(fā)中藥新藥和充分利用我國中草藥資源具有重要意義。

大孔吸附樹脂是一類有機高分子聚合物吸附劑，具有容量大、吸附速度快、選擇性好、再生漸變等優(yōu)點，因而被廣泛用于天然產(chǎn)物的分離純化，是提取分離中草藥有效成分的一種有效方法[6-9]。目前水芹總黃酮的提取工藝已有報道[10]，但利用大孔樹脂分離提純水芹中水溶性總黃酮鮮見報道。水芹水溶性總黃酮含量較高，作為藥食兼用的食物，以水提取總黃酮食用性較強，因此為了更合理地開發(fā)利用黔產(chǎn)野生水芹資源，該研究以水芹水溶性總黃酮含量為考察目標，選用大孔樹脂分離純化水芹水溶性總黃酮，采用靜態(tài)試驗考察大孔樹脂對水芹總黃酮分離純化工藝條件及效果，研究分離純化水芹總黃酮的最佳工藝條件及各種影響因素，從而為生產(chǎn)中最有效開發(fā)利用黔產(chǎn)野生水芹提供科學依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試材料。野生水芹采自貴州省貴陽周邊，將樣品用去離子水清洗干凈，瀝干表面水分，置恒溫干燥箱中60 ℃干燥至恒重，粉碎后過15 μm的篩，密封保存待用。

1.1.2試劑。大孔樹脂AB-8、DM-130和HP-20，其他試劑均為分析純。

1.1.3儀器與設(shè)備。FA 1604A 型電子天平（上海精天電子儀器有限公司）；TU-1810型紫外可見分光光度計 （北京市普析通用儀器有限責任公司）；WGL-45B型真空干燥箱（天津市邰思婷儀器有限公司）；SHA-2型制冷水浴恒溫振蕩器（金壇市醫(yī)療儀器廠）；ZN-500微型高速粉碎機（長沙市中南制藥機械廠）。

1.2方法

1.2.1水溶性總黃酮含量的測定。

1.2.1.1黃酮類化合物的顯色反應(yīng)。

黃酮類化合物分子中存在酚羥基和苯并吡喃酮環(huán)，根據(jù)還原試驗（NaBH4）、金屬鹽類試劑的絡(luò)合反應(yīng)（鎂鹽）、硼酸顯色反應(yīng)和堿性顯色反應(yīng)等一系列的顯色反應(yīng)[11]，檢驗各類黃酮類化合物類型。通過顯色反應(yīng)（表1），表明黔產(chǎn)野生水芹中含有二氫黃酮（醇）類、異黃酮類、5-羥基黃酮、2-羥基查耳酮以及黃酮醇類等物質(zhì)。這些多羥基黃酮類物質(zhì)在水中溶解度較高，易形成糖苷類物質(zhì)，使水芹的水溶性總黃酮更具實用價值。

1.2.1.2標準曲線的繪制。

根據(jù)參考文獻[12-14]采用亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法測定水芹中總黃酮含量，并得出標準曲線的回歸方程：A=6.1848 C-0.004 3（R2=0.996 3），式中，C為蘆丁質(zhì)量濃度（mg/mL），A為吸光度。

1.2.1.3水溶性總黃酮粗提液的制備。取黔產(chǎn)野生水芹干粉2 g，按料液比1∶40（g∶mL）的比例與去離子水混合，攪拌均勻，采用90 ℃水浴加熱浸提，浸提時間20 min。浸提液冷卻至室溫后8 000 r/min離心10 min，上清液用100 mL容量瓶定容，得到水芹水溶性總黃酮待測液。

1.2.1.4總黃酮含量的測定。

取1 mL待測液，按“1.2.1.2”方法測定吸光度，根據(jù)式（1）求出樣品液中總黃酮含量。

式中，C為總黃酮質(zhì)量濃度（mg/mL），由標準曲線吸光度換算而得； V為樣品液體積（mL）；W樣為樣品質(zhì)量（g）。經(jīng)計算，水芹水溶性總黃酮粗提液中總黃酮含量為1.28 mg/g。

1.2.2大孔樹脂的預(yù)處理及篩選。

根據(jù)參考文獻[15]的方法，對AB-8、DM-130和HP-20 3種大孔樹脂進行預(yù)處理。以大孔樹脂對水芹總黃酮吸附量[計算方法為式（2）和式（3）]和解吸率[計算方法為式（4）]為指標，比較AB-8、DM-130和HP-20 3種大孔樹脂的吸附性能。

式中，Q為吸附量（mg/g）；C0為初始質(zhì)量濃度（mg/mL）；C1為平衡質(zhì)量濃度（mg/mL）；C2為解吸液質(zhì)量濃度（mg/mL）；V為吸附液體積（mL）；W為樹脂質(zhì)量（g）。

1.2.3HP-20大孔樹脂的靜態(tài)吸附單因素試驗。

1.2.3.1吸附料液比。準確稱取處理好的HP-20樹脂2 g，共4份，置于100 mL錐形瓶中，分別加入黔產(chǎn)野生水芹提取液20、40、60和80 mL，使樹脂質(zhì)量與樣液體積的比值為1∶10、1∶20、1∶30和1∶40（g∶mL）。置于室溫下，振蕩吸附8 h，使其達到飽和吸附，吸取上層液測定總黃酮濃度，按式（2）計算樹脂吸附量。

1.2.3.2吸附時間。準確稱取處理好的HP-20樹脂2 g，共4份，置于100 mL錐形瓶中，加入黔產(chǎn)野生水芹提取液60 mL。置于室溫下，分別振蕩吸附4、6、8和10 h，預(yù)使其達到最佳吸附，吸取上層液測定總黃酮濃度，按式（2）計算樹脂吸附量。

1.2.3.3乙醇洗脫體積分數(shù)。根據(jù)最佳吸附條件，稱取2 g HP-20樹脂4份，對水芹總黃酮物質(zhì)進行吸附。吸附結(jié)束后，分別用40 mL體積分數(shù)為30%、50%、70%和90%的乙醇溶液置于室溫下對吸附于HP-20樹脂上的黃酮類物質(zhì)進行解吸1 h。測定解吸液中黃酮類物質(zhì)的含量，根據(jù)式（4）計算解吸率，以此選擇最佳的乙醇解吸液體積分數(shù)。

1.2.3.4pH。同“1.2.3.3”先進行吸附。吸附結(jié)束后用40 mL 體積分數(shù)為70%的乙醇溶液對吸附于HP-20樹脂上的黃酮類物質(zhì)進行解吸。調(diào)節(jié)解吸液的pH，測定pH分別為2、3、5和7時解吸液中黃酮類物質(zhì)的含量，根據(jù)式（4）計算解吸率，選擇最佳的pH。

1.2.3.5解析溫度。

同“1.2.3.3”先進行吸附。吸附結(jié)束后用40 mL體積分數(shù)為70%的乙醇溶液、調(diào)節(jié)解吸液的pH為3，分別置于20、40、60和80 ℃條件下對吸附于樹脂上的黃酮類物質(zhì)進行解吸，測定解吸液中黃酮類物質(zhì)的含量，根據(jù)式（4）計算解吸率，選擇最佳解吸溫度。

2結(jié)果與分析

2.13種大孔樹脂對水芹總黃酮吸附性能的影響

黃酮類化合物是一類其骨架具有15個碳原子的化合物，骨架中含有2個苯環(huán)，2個苯環(huán)由一個C3部分橋聯(lián)，具有弱極性。因此，根據(jù)相似相容原理[16-19]，選取對分離黃酮類化合物作用較好的3種非極性樹脂AB-8、DM-130和HP-20來考察對黔產(chǎn)野生水芹黃酮的吸附能力。結(jié)果表明（表2），非極性樹脂HP-20對水芹的吸附量和解吸率均優(yōu)于樹脂AB-8和DM-130，因此，樹脂AB-8和DM-130不適用于黔產(chǎn)野生水芹黃酮的吸附和解吸，在此采用樹脂HP-20對水芹提取液中的總黃酮物質(zhì)進行靜態(tài)單因素試驗考察。

2.2HP-20樹脂對黔產(chǎn)野生水芹提取液中黃酮類物質(zhì)的靜態(tài)吸附單因素試驗

2.2.1吸附料液比對HP-20樹脂靜態(tài)吸附的影響。

由圖1可知，當HP-20樹脂的質(zhì)量為2 g、水芹提取液體積為60 mL（料液比為1∶30）時，HP-20樹脂的吸附效果最好，達38.16 mg/g。當料液比為1∶10或1∶20時，HP-20樹脂對水芹中黃酮類物質(zhì)的吸附量都不太理想，可能是由于料液比較小時，在試驗時間內(nèi)樹脂吸附未達到飽和；相反料液比達1∶40時，HP-20樹脂的吸附量反而減小，可能是因為大孔樹脂進行了選擇性吸附。

2.2.2吸附時間對HP-20樹脂靜態(tài)吸附作用的影響。

由圖2可知，其他條件不變的情況下（料液比為1∶30，室溫），HP-20樹脂對水芹總黃酮的吸附量隨著時間的加長而增大，當吸附時間為6 h時，吸附量達44.01 mg/g，較4 h吸附量增加了2倍多，但隨著時間的加長，吸附量變化并不明顯。因此，選擇吸附時間6 h為最佳的靜態(tài)吸附時間。

2.2.3乙醇洗脫體積分數(shù)對HP-20樹脂靜態(tài)解吸作用的影響。

從圖3可以看出，當乙醇體積分數(shù)為30%時，解吸率僅為22.28%，隨著乙醇體積分數(shù)的增加，當體積分數(shù)為70%時解吸率達51.43%，雖然隨著體積分數(shù)的增加，解吸率仍然增大，但不明顯。綜合考慮回收率和后期生產(chǎn)成本，選擇體積分數(shù)為70%的乙醇溶液作為HP-20樹脂解吸液為宜。

2.2.4pH 對HP-20樹脂靜態(tài)解吸作用的影響。

由圖4可知，隨著pH的降低，解吸率逐漸增大。當pH為3時，解吸率為68.73%，pH為2時，解吸率為69.01%，但如果pH過低，即解吸液酸性太強，可能會對黃酮苷類物質(zhì)的性質(zhì)產(chǎn)生影響，如發(fā)生酸水解等。因此，選擇解吸液最適pH為3。

2.2.5解析溫度對HP-20樹脂靜態(tài)解吸作用的影響。

由圖5可知，在乙醇體積分數(shù)和pH最優(yōu)的情況下，使樹脂解吸溫度處于40 ℃時解吸率達到最大，為77.73%，隨著溫度的升高，解吸率反而降低了，可能因為溫度過高，促使黃酮類物質(zhì)的水解。因此，綜合因素選擇40 ℃為最佳解吸溫度。

2.3水芹水溶性總黃酮提純產(chǎn)物分析

在最佳提純工藝條件下制備水芹水溶性總黃酮提純產(chǎn)物，按照式（1）求出總黃酮含量，計算提純產(chǎn)物后的樣品中總黃酮含量為12.03 mg/g，比水芹干粉的含量（1.28 mg/g）提高了約9.4倍。

3結(jié)論

該研究通過對3種不同型號的大孔樹脂進行了靜態(tài)吸附-解吸吸附的篩選，發(fā)現(xiàn)HP-20型樹脂對黔產(chǎn)野生水芹中總黃酮的吸附和解吸效果最好，因此采用HP-20型樹脂對黔產(chǎn)野生水芹水溶性總黃酮進行純化，并進一步對純化工藝條件進行優(yōu)化，最佳純化工藝條件為：HP-20型樹脂與粗提液比例為1∶30（g∶mL），靜置吸附時間為6 h，吸附量最大達44.01 mg/g；用70%乙醇溶液在pH為3，40 ℃的條件下進行解析，解吸率最大為77.73%。在最佳的提純工藝條件下制備的產(chǎn)物中總黃酮含量提高了9.4倍，說明提純效果較好。

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