響應(yīng)面法優(yōu)化豬血漿蛋白制備鐵螯合肽的酶解工藝

殷俊峰 張福生 朱峰 郭俊 范翠玲 朱梅

摘要[目的]優(yōu)化響應(yīng)面法對(duì)豬血漿蛋白酶解制備鐵螯合多肽的工藝。[方法]應(yīng)用響應(yīng)面法對(duì)豬血漿蛋白酶解制備鐵螯合多肽的工藝進(jìn)行優(yōu)化，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇pH、水解溫度、水解時(shí)間為影響因素，以水解度為指標(biāo)，進(jìn)行3因素3水平的Box-Behnken 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用響應(yīng)面法分析3個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值的影響。[結(jié)果] 響應(yīng)面法優(yōu)化豬血漿蛋白制備蛋白粉的最佳工藝條件為 pH 77，溫度46.3 ℃，水解時(shí)間7.4 h；在此條件下，蛋白的水解度為35.52%，水解物螯合率為79.41%。[結(jié)論]該工藝可為豬血漿蛋白開(kāi)發(fā)利用提供新的思路。

關(guān)鍵詞響應(yīng)面法；豬血蛋白；水解；水解度

中圖分類號(hào)S879文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2017）23-0084-05

Optimization of Enzymatic Hydrolysis Process for Preparation of FeChelating Peptides from Porcine Plasma Proteins by Response Surface Methodology

YIN Junfeng1，ZHANG Fusheng1，ZHU Feng2 et al

（1. Institute of Agricultural Products Processing， Anhui Academy of Agricultural Sciences， Hefei， Anhui 230031；2.Anhui Mount Everest Biotechnology Co.， Ltd.， Taihe， Anhui 236600）

Abstract[Objective] To optimize the preparation of iron chelate polypeptide by hydrolysis of porcine plasma protein by response surface methodology. [Method] Response surface methodology was used to optimize the preparation of iron chelate polypeptide from porcine plasma protein hydrolysates，on the basis of single factor test， pH， hydrolysis temperature and hydrolysis time were selected as influencing factors， and hydrolysis degree as index，the BoxBehnken central composite experimental design of 3 factors and 3 levels， used the response surface method to analyze the influence of 3 factors on the response value.[Result]In response to the optimized process of preparation of protein powder surface method for preparation of porcine plasma protein pH 7.7， hydrolysis temperature 46.3 ℃， hydrolysis time 7.4 h， under this condition， hydrolysis degree of protein hydrolysate was 35.52%， chelation rate was 79.41%. [Conclusion] This process can provide new ideas for the development and utilization of pig plasma proteins.

Key wordsResponse surface analysis；Porcine serum protein；Hydrolysate；Degree of hydrolysate

作者簡(jiǎn)介殷俊峰（1969—），男，安徽鳳陽(yáng)人，副研究員，從事農(nóng)產(chǎn)品貯運(yùn)保鮮及加工研究。

收稿日期2017-07-19

豬血是生豬屠宰后的一種副產(chǎn)品，每100 g豬血中含蛋白質(zhì)16 g，高于牛肉、瘦豬肉蛋白質(zhì)的含量，而且容易消化吸收，豬血蛋白質(zhì)所含的氨基酸比例與人體中氨基酸的比例接近，富含鐵元素，膽固醇比豬肉還低，非常容易被機(jī)體利用。豬血血漿中粗蛋白含量超過(guò)75%，粗脂肪2%，消化能和代謝能非常高，能滿足動(dòng)物幼崽時(shí)期的營(yíng)養(yǎng)需求，賴氨酸含量高于其他動(dòng)物源飼料，氨基酸比例平衡，適口性好，蛋白質(zhì)消化率在 95%以上[1]，富含具有生物學(xué)特性的蛋白如IgG 、IgM等[2-3]。

鐵是人體必需的微量元素之一。缺鐵性貧血是指體內(nèi)與血紅蛋白結(jié)合的微量元素鐵不足所引發(fā)的一種細(xì)胞性貧血，目前服用補(bǔ)鐵劑是治療缺鐵性貧血最有效的途徑之一。氨基酸類補(bǔ)鐵劑具有抗干擾性好、穩(wěn)定性強(qiáng)和易吸收等優(yōu)點(diǎn)，但它存在著產(chǎn)品單一、價(jià)格高和專一性太強(qiáng)的缺點(diǎn)。氨基酸螯合物種類繁多，諸如天門冬氨酸亞鐵、賴氨酸亞鐵等一系列氨基酸亞鐵螯合物。姚磊等[4]通過(guò)硫酸亞鐵與L-甘氨酸發(fā)生螯合反應(yīng)，最終得到甘氨酸亞鐵的螯合率達(dá)到65.43%；張曉鳴等[5]研究發(fā)現(xiàn)，丙酮等有機(jī)溶劑可以有效分離提純水溶性氨基酸配合物；汪芳安等[6]通過(guò)控制反應(yīng)條件，使得氯化亞鐵與L-蛋氨酸發(fā)生螯合反應(yīng)，所得蛋氨酸亞鐵產(chǎn)品最終得率為66.80%；秦衛(wèi)東等[7]通過(guò)酶解脫脂豆粕，所得到的氨基酸液與亞鐵螯合生成復(fù)合氨基酸亞鐵。

該研究是以豬血清蛋白作為原料，以堿性蛋白酶水解豬血漿蛋白，通過(guò)單因素試驗(yàn)對(duì)水解溫度、水解pH、底物質(zhì)量濃度、加酶量和水解時(shí)間等工藝參數(shù)進(jìn)行研究，并用響應(yīng)面法優(yōu)化制備鐵螯合多肽的最佳工藝參數(shù)，以期為豬血蛋白資源的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1原料與主要試劑。新鮮豬血，黃山市鑫黃山特產(chǎn)有限公司；鹽酸、氫氧化鈉（分析純）、堿性蛋白酶，合肥博美生物科技有限公司。

1.1.2

主要儀器設(shè)備。 722型分光光度計(jì)，上海普元儀器儀表有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋、78-I型磁力攪拌器，江蘇省金壇榮華儀器制造有限公司；RJ-TDL-5A低速臺(tái)式大容量離心機(jī)，無(wú)錫瑞江機(jī)械設(shè)備有限公司；1000C電子天平，上海凱士電子有限公司。

1.2方法

1.2.1工藝流程。

豬血→離心分離→血漿液→超濾→噴霧干燥→血漿粉→酶解。

1.2.2血漿蛋白粉酶解工藝。

稱取一定量的血漿粉，加入適量去離子水，放入氣浴恒溫振蕩器振蕩溶解，將溶液pH調(diào)至反應(yīng)所需的pH，加入一定比例的堿性蛋白酶，放入恒溫水浴鍋，控制溫度與時(shí)間。反應(yīng)結(jié)束后，100 ℃水浴3～5 min，滅酶。對(duì)血漿酶解液進(jìn)行離心（6 000 r/min，-4 ℃，15 min），上清液濾紙過(guò)濾，冷凍干燥，采用TNBS法測(cè)定蛋白質(zhì)水解度。

1.2.3基礎(chǔ)理化檢測(cè)。

對(duì)豬血和血漿蛋白粉中的水分、蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量進(jìn)行測(cè)定。

水分含量按照GB 5009.3—2010的方法進(jìn)行測(cè)定；

蛋白質(zhì)含量采用凱氏定氮法測(cè)定；

脂肪含量采用索氏抽提法測(cè)定；

蛋白質(zhì)水解度的測(cè)定采用TNBS法測(cè)定；

鐵元素含量采用火焰原子吸收法測(cè)定。

1.2.4氨基酸組成分析。

稱取樣品0.1 g于水解管中，加入6 mol/L的鹽酸溶液10 mL后，充入氮?dú)?，待水解管中的空氣排凈后擰緊管蓋，防止漏氣。將充入氮?dú)獾男庸芊湃?10 ℃的烘箱反應(yīng)22 h后取出冷卻，用超純水定容到50 mL的容量瓶中并混勻，取1 mL于燒杯中，將液體樣品真空干燥24 h，加入3 mL的0.2 mol/L的色譜純HCl溶液，充分混勻后取1 mL液體過(guò)0.22 μm濾膜，經(jīng)氨基酸自動(dòng)分析儀檢測(cè)其氨基酸組分。

1.2.5螯合活性測(cè)定。

參照GB/T 13885的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.6單因素試驗(yàn)。

選擇水解溫度、pH、水解時(shí)間、酶添加量、底物濃度作為主要單因素，考察各單因素對(duì)酶解蛋白的影響。每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平。

根據(jù)Box-Behnken 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇單因素試驗(yàn)中顯著因素（pH、水解溫度和時(shí)間）進(jìn)行優(yōu)化，因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

1.2.8數(shù)據(jù)處理。

每次試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。采用Design-Expert 8.0.5軟件進(jìn)行響應(yīng)曲面的分析和作圖。

2結(jié)果與分析

2.1理化性質(zhì)

豬血血漿蛋白粉的理化指標(biāo)如表2所示。血漿蛋白是豬血中的主要成分，豬血中蛋白質(zhì)含量達(dá)到4.30%，豬血血漿蛋白粉中蛋白質(zhì)含量為79.10%，所以豬血是血漿蛋白粉加工的主要原材料。

2.2氨基酸組成

豬血加工副產(chǎn)物氨基酸組成分析如表3所示。豬血中富含氨基酸，氨基酸種類為16 種，其中必需氨基酸有7 種，必需氨基酸總量為43.36%，其中亮氨酸含量最高，為13.74%；賴氨酸次之，為9.06%。豬血血漿蛋白粉中必需氨基酸/氨基酸總量為40.80%，其中亮氨酸含量最高，為9.78%；賴氨酸次之，為8.70%。

2.3單因素試驗(yàn)

2.3.1不同酶解溫度對(duì)血漿蛋白粉水解度的影響。

底物濃度為6%，初始pH為7，蛋白酶添加量為0.4%，分別在30、40、50、60 ℃下水解4 h，測(cè)定不同酶解溫度下的蛋白水解度，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可以看出，溫度對(duì)蛋白酶解有顯著影響，水解度隨著溫度的升高而逐漸增加，當(dāng)溫度達(dá)到50 ℃，水解度最大；大于50 ℃，水解度逐漸減小。這是由于酶解反應(yīng)隨著溫度的升高蛋白酶活性逐漸增大，但是溫度過(guò)高會(huì)降低酶的活性。因此反應(yīng)溫度應(yīng)控制在50 ℃左右。

2.3.2不同pH對(duì)血漿蛋白粉水解度的影響。

調(diào)節(jié)初始 pH分別為5、6、7、8，底物濃度為6%，蛋白酶添加量為0.4%，45 ℃下水解4 h，測(cè)定不同初始pH下的蛋白水解度，結(jié)果如圖2所示。

圖2表明，其他條件一定，pH由5提高至7時(shí)，水解度隨著pH的升高而增加，在pH為7時(shí)達(dá)到最大，然而當(dāng)pH繼續(xù)升高時(shí)，水解度又慢慢減小。可能是因?yàn)楫?dāng)pH大于7時(shí)，酸堿度影響了底物的空間構(gòu)象[8]，從而影響了酶與底物的結(jié)合，故反應(yīng)pH應(yīng)控制在7左右。

2.3.3不同酶解時(shí)間對(duì)血漿蛋白粉水解度的影響。

固定底物濃度為6%、初始pH為7、酶添加量為0.4%、水解溫度為45 ℃，分別水解 2、4、6、8、10 h，測(cè)定不同酶解時(shí)間下的蛋白水解度，結(jié)果如圖3所示。

圖3表明，在2～6 h之內(nèi)，隨著酶解時(shí)間的增加，蛋白的水解度快速增大，6 h達(dá)到最大，之后酶解速度放慢，水解度緩慢降低。因此反應(yīng)時(shí)間應(yīng)控制在6 h左右。

2.3.4不同濃度酶添加量對(duì)血漿蛋白粉水解度的影響。

固定底物濃度為6%、初始pH為7，分別添加 0.2%、0.4%、06%、08%、1.0%的堿性蛋白酶，45 ℃下水解4 h，測(cè)定不同酶添加量對(duì)其蛋白水解度的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4表明，當(dāng)酶添加量在0.2%～0.6%時(shí)，蛋白水解度隨著酶添加量的增加而增加，在0.6%時(shí)達(dá)到最大，隨后水解度逐漸減小。可能是由于酶本身也是一種蛋白質(zhì)，也會(huì)發(fā)生酶解，如果量太大則會(huì)干擾酶解物的組成[9-10]。因此，反應(yīng)酶添加量應(yīng)控制在0.6%左右。

2.3.5不同底物濃度對(duì)血漿蛋白粉水解度的影響。

調(diào)節(jié)底物濃度分別為4%、6%、8%、10%、12%，初始 pH為7，蛋白酶添加量為0.4%，45 ℃下水解4 h，測(cè)定其不同底物濃度下的蛋白水解度，結(jié)果如圖5所示。

圖5表明，蛋白水解度隨著底物濃度的增加影響不大，在底物濃度為8%時(shí)，水解度相對(duì)其他底物濃度時(shí)達(dá)到最大，因此反應(yīng)底物濃度應(yīng)控制在8%左右。

通過(guò)上述5個(gè)條件的酶解單因素試驗(yàn)可以得出，pH、水解時(shí)間和溫度的變化對(duì)血漿蛋白粉的水解度具有顯著影響，而底物濃度和酶添加量的影響不明顯。因此，在接下來(lái)的響應(yīng)面試驗(yàn)中只對(duì)pH、水解時(shí)間和溫度這3個(gè)因素進(jìn)行工藝優(yōu)化，底物濃度和酶添加量將不再作為影響因素進(jìn)行研究，選擇底物濃度為8%、酶添加量為0.2%作為固定試驗(yàn)條件不再變化。

2.4響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)Design-Expert 8.0.5軟件設(shè)計(jì)的3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4。

采用Design-Expert 8.0.5軟件程序?qū)σ陨系脑囼?yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，分析結(jié)果得出血漿蛋白粉水解度的回歸方程為

Y=-230.772 25+38.531 5A+3.302 25B+10724 25C-0.037 25AB+0.331 25AC-0.053 125BC-2527 25A2-0.027 672B2-0.746 81C2。

為了檢驗(yàn)上述方程的有效性，對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析，分析結(jié)果得出：

F模型=104.54，P模型< 0.000 1**；

FA=302.13，PA< 0.000 1**；

FB=5.58，PB=0.05；

FC=228.80，PC< 0.000 1**；

FAB=195，PAB=0.20；

FAC=6.18，PAC=0.04*；

FBC=15.90，PBC=001*；

FA2=94.69，PA2< 0.000 1**；

FB2=113.53，PB2< 0000 1**；

FC2=132.30，PC2< 0.000 1**；

F失擬=4.35，P失擬=0.09。

方差分析表明，模型的差異是極顯著的（P<0.000 1），說(shuō)明該模型能夠解釋大部分試驗(yàn)情況的變化，同時(shí)失擬差不明顯，這進(jìn)一步說(shuō)明了該模型的合理性。因此可以用此模型對(duì)整個(gè)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

3個(gè)因素對(duì)血漿蛋白粉水解作用比較復(fù)雜。在上述回歸方程的所有一次項(xiàng)中，對(duì)于血漿蛋白粉水解作用影響的順序?yàn)锳>C>B，其中A、C 2項(xiàng)影響極顯著（P<0.000 1），所以pH和時(shí)間對(duì)血漿蛋白粉水解影響較大；在所有的平方項(xiàng)中A2、B2、C2 3項(xiàng)影響極顯著（P<0.000 1）；而交互項(xiàng)的影響就相對(duì)較小。因此，各因素對(duì)血漿蛋白粉水解作用影響的大小順序?yàn)閜H>水解時(shí)間>溫度。

2.5響應(yīng)面分析

采用Design-Expert 8.0.5軟件，帶入試驗(yàn)數(shù)據(jù)，分別將模型中的pH（A）、溫度（B）、時(shí)間（C）的其中一個(gè)因素固定在0水平不變，得到其余2個(gè)因素之間相互作用對(duì)于蛋白水解度的影響。通過(guò)軟件的Model Graph值分別合成3個(gè)因素間交互作用影響的響應(yīng)面圖和等高線圖（圖6～11）。

2.6最佳水解工藝條件的確定及其鐵螯合活性

根據(jù)Design Expert 8.0.5軟件程序得到血漿蛋白粉酶解的最佳工藝條件為pH 7.7，溫度46.3 ℃，時(shí)間7.4 h；在此條件下，蛋白水解度的預(yù)測(cè)值為35.52%。

在上述最佳酶解工藝條件下設(shè)計(jì)3次平行試驗(yàn)，將3次平行試驗(yàn)的數(shù)值取平均值，得到血漿蛋白粉酶解時(shí)蛋白水解度平均為37.55%，高于預(yù)測(cè)值0.03%，水解物螯合率為7941%。證明了響應(yīng)面分析法對(duì)于酶解工藝的優(yōu)化結(jié)果準(zhǔn)確可靠，有較高實(shí)用價(jià)值。

3結(jié)論

豬血經(jīng)過(guò)高速離心分離，將血漿和血細(xì)胞分離，過(guò)濾濃

縮、噴霧干燥，得到血漿蛋白粉。在pH、底物濃度、水解溫度、酶解濃度、水解溫度對(duì)蛋白水解的單因素影響試驗(yàn)中得出pH、水解時(shí)間和水解溫度這3個(gè)因素的變化對(duì)蛋白水解度具有很明顯的影響，加酶量和底物濃度這2個(gè)因素對(duì)于蛋白水解度的影響不大。通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)得出：各因素對(duì)血漿蛋白粉水解作用影響的大小順序?yàn)閜H>水解時(shí)間>溫度。該試驗(yàn)結(jié)果表明，豬血漿蛋白制備蛋白粉的最佳工藝條件為 pH 77，溫度46.3 ℃，水解時(shí)間7.4 h；在此工藝條件下豬血清蛋白有很好的酶解效果。

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