中華按蚊擬除蟲菊酯殺蟲劑擊倒抗性突變的研究進展

周巧玲　陳夢麗

摘要主要闡述了鈉離子通道的結構和功能、擬除蟲菊酯殺蟲劑的作用機理，總結了中華按蚊鈉離子通道中與擬除蟲菊酯殺蟲劑抗性相關的kdr突變及其抗性機理，為后續(xù)中華按蚊抗性機制的深入研究提供了理論依據。

關鍵詞鈉離子通道；擬除蟲菊酯殺蟲劑；擊倒抗性；kdr突變；中華按蚊

中圖分類號S482.3+5文獻標識碼

A文章編號0517-6611（2017）30-0143-03

Abstract

We introduced the structure and function of sodium channel，the mode of action of pyrethroids，identification and functional characterization of pyrethroid resistanceassociated sodium channel mutations from Anopheles sinensis，which would provide the molecular basis for further study of resistance mechanism of Anopheles sinensis to pyrethroid insecticides.

Key wordsSodium channel；Pyrethroid insecticides；Knowdown resistance；kdr mutations；Anopheles sinensis

擬除蟲菊酯殺蟲劑（Pyrethroid insecticides）是從天然除蟲菊素衍生而來的一類人工合成的化學農藥，主要以神經鈉離子通道為作用靶標，其因殺蟲活性高、擊倒速度快、殺蟲譜廣、對哺乳動物低毒、 環(huán)境中易降解等特性而被廣泛應用于農業(yè)生產和家庭衛(wèi)生害蟲的防治。擬除蟲菊酯殺蟲劑可以作為蚊子的毒殺劑和驅避劑，能有效防治傳染病媒介——蚊子，所以世界衛(wèi)生組織推薦使用該類殺蟲劑防治蚊子[1]。但是隨著擬除蟲菊酯農藥的大量使用，抗藥性問題日益突出。蚊子作為瘧疾、登革熱等疾病的主要傳播媒介，如果其群體數量得不到有效的控制，將會給人類帶來極大的威脅，利用生物化學防治手段以切斷傳播途徑是防治疾病的重要措施。

蚊子對擬除蟲菊酯殺蟲劑的抗性主要分為代謝抗性和靶標抗性。代謝抗性是由于蚊子代謝解毒酶活性增強引起的。主要由于代謝解毒酶如P450酶的代謝變強，P450酶具有解毒作用，通常可將脂溶性有毒物質代謝為水溶性物質，使有毒物質排出體外。而靶標抗性則是由于殺蟲劑作用靶標敏感性降低造成的。主要是由于電壓門控鈉離子通道氨基酸位點發(fā)生非同義突變，導致擬除蟲菊酯殺蟲劑和靶標鈉通道的親和力下降[2-3]。

中華按蚊普遍分布于中國和東南亞，是中國常見的蚊子之一，是瘧疾的主要傳染媒介。筆者主要介紹了鈉離子通道的結構和功能、擬除蟲菊酯殺蟲劑的作用機理、擊倒抗性、中華按蚊中與擬除蟲菊酯殺蟲劑抗性相關的kdr突變及其作用機制，旨在為進一步研究中華按蚊對擬除蟲菊酯的抗性機理提供參考。

1鈉離子通道

1.1離子通道

離子通道是指由貫穿質膜的由多亞基組成的蛋白質，通過構象變化而形成的調控離子跨膜運轉的門系統(tǒng)，通過門的開閉控制離子運轉的種類和速度。依據其活化的方式不同，離子通道可分2類：一類是電壓活化的通道，稱做電壓門控離子通道，即通道的開放受膜電位的控制，如鈉離子通道、鈣離子通道、氯離子通道；另一類是配體活化的通道，稱做配體門控離子通道，即靠配體與膜上受體相互作用而活化的通道，如乙酰膽堿受體通道、氨基酸受體通道。鈉離子通道是所有動物中電信號的主要啟動鍵，而電信號則是神經活動和肌肉收縮等一系列生理過程的控制基礎，是有機氯殺蟲劑以及擬除蟲菊酯類殺蟲劑等重要化學農藥的作用靶標[4]。

1.2昆蟲鈉離子通道的結構與功能

昆蟲鈉離子通道和哺乳動物鈉離子通道類似，由1個α亞基和幾起輔助作用的亞基（TipE、TEH1-4）組成，較大的α亞基形成離子滲透孔洞，而較小的輔助亞基則起到調節(jié)通道功能和增加表達量的作用[5]。α亞基蛋白由1 800～2 500個氨基酸殘基組成，包含4個同源結構域（Ⅰ～Ⅳ），每個結構域又由6個疏水性跨膜螺旋體（S1～S6）組成，其中S1～S4組成電壓感受模塊，S5、S6以及連接于S5和S6之間的保守序列元件（P-LOOP）構成了供鈉離子通過的孔道模塊，電壓感受模塊與孔道模塊之間通過短肽（L45）連接。S5、S6跨膜片段參與Na+親水孔道的形成，4個結構域共8個跨膜片段形成細胞親水孔道結構。4個P-LOOP上分別有D、E、K、A 4個氨基酸殘基，決定通道的選擇性[6]。每1個同源結構的S4區(qū)域還包含了1個保守元件，其特征是帶正電荷的精氨酸或賴氨酸的重復序列，這些氨基酸之間分別由2個中性氨基酸隔開，形成電壓傳感器。結構域 Ⅲ 和 Ⅳ 之間有1個較短的保守序列片段，構成通道的失活門，哺乳動物中為IFM（異亮氨酸-苯丙氨酸-甲硫氨酸），昆蟲中為MFM（甲硫氨酸-苯丙氨酸-甲硫氨酸）[7]。每一個結構域都可以因為電子移動從而產生電流電壓，細胞去極化時，S4上的正電荷能檢測膜電場，使得電壓傳感器S4向膜外移動，隨之S1、S2、S3移動，通道的構象發(fā)生改變，只有當4個結構域的構相都發(fā)生改變后，Na+跨膜通道才打開。通道開啟數毫秒后，S4向后移動，隨之S1、S2、S3向后移動，則通道關閉。鈉離子通道的拓撲結構見圖1。

2擬除蟲菊酯殺蟲劑作用機理

鈉離子通道在動作電位的產生和傳遞過程中起非常重要的作用，是動作電位上升相的主要組成部分，主要通過鈉離子通道的激活和失活實現。正常情況下，鈉離子通道開放數毫秒后，通道失活并關閉；但是DDT和擬除蟲菊酯殺蟲劑能夠抑制通道失活，延長通道開放時間，干擾鈉離子通道正常功能，造成神經傳導障礙[8]。目前已知擬除蟲菊酯類農藥在昆蟲鈉離子通道上有2個對稱的結合位點，分別是結合位點 Ⅰ （Pyrethroid binding site 1，PyR1）和結合位點 Ⅱ （Pyrethroid binding site 1，PyR2）。以鉀離子通道為模型進行計算機模擬，OReilly等[9]提出擬除蟲菊酯結合位點由結構域 Ⅱ 的S4-S5連接肽、結構域 Ⅱ 的跨膜螺旋S5和結構域 Ⅲ 的跨膜螺旋S6組成，即 Ⅱ L45-Ⅱ S5-Ⅲ S6組成。之后Dong實驗室提出除了上述結合位點外，還存在與之對稱，但并不完全一致的結合位點存在，該位點由結構域 Ⅰ 的S4-S5連接肽、結構域 Ⅰ 的跨膜螺旋S5、S6和結構域 Ⅱ 的跨膜螺旋S6組成，即Ⅰ L45-Ⅰ S5-Ⅰ S6-Ⅱ S6組成[10-11]，并且將前者稱為結合位點 Ⅰ，后者稱為結合位點 Ⅱ。因此，目前認為擬除蟲菊酯殺蟲劑在昆蟲鈉離子通道上的結合位點有2個，且2個結合位點同時起作用。

3擊倒抗性

擊倒抗性（Knock down resistance，kdr）是擬除蟲菊酯殺蟲劑抗性的重要機制，是指鈉離子通道靶標部位敏感度降低而對DDT和擬除蟲菊酯產生的抗性。擊倒抗性的產生與鈉離子通道氨基酸序列發(fā)生非同義突變有關，這些氨基酸突變很可能導致物種對擬除蟲菊酯殺蟲劑產生抗性，因此又稱做kdr突變位點[12]。目前，已經在節(jié)肢動物害蟲和傳染病媒介的抗性品系中發(fā)現50多個和擬除蟲菊酯殺蟲劑抗性相關的kdr突變[6]。其中一部分kdr突變已在爪蟾卵母細胞表達體系中進行功能驗證，結果表明kdr突變主要通過改變鈉離子通道門控或者減少擬除蟲菊酯殺蟲劑在鈉離子通道上的結合而使鈉離子通道對擬除蟲菊酯殺蟲劑的敏感性降低，從而導致物種對擬除蟲菊酯類農藥產生抗性。

4中華按蚊鈉離子通道的kdr突變

最早發(fā)現的kdr突變是位于結構域 Ⅱ S6的突變位點L1014F（以家蠅鈉離子通道的氨基酸序列命名），該位點在家蠅和德國小蠊鈉離子通道中都存在[13]。隨后在岡比亞按蚊[14]、淡色庫蚊[15]、麥長管蚜[16]、棉鈴蟲[17]、小菜蛾[18]、馬鈴薯甲蟲[19]、桃蚜[20]等物種中發(fā)現該位點其他氨基酸突變： C、S、W、H，其中L1014F是最常見的，而其余4種發(fā)生的頻率不高[8]。在我國進行中華按蚊的抗性位點檢測，發(fā)現鈉離子通道 Ⅱ S6的L1014位點上存在3種突變，分別是TTG（L）被TTT（F）替換、TTG（L）被TTG（F）替換、TTG（L）被TGT（C）替換。并且還發(fā)現早在1997年，江蘇和山東就已存在TTT（F）和TGT（C）的kdr突變，其中TTT（F）是頻率最高的突變，在中部地區(qū)河南、山東、江蘇、安徽、江西、湖北等地都發(fā)現了該kdr突變[21]。Yang等[22]鑒定了廣西壯族自治區(qū)9個地區(qū)中華按蚊的鈉離子通道1014位氨基酸的多樣性，結果表明除了野生型1014L外，百色市和南寧市只有1014S氨基酸突變位點；賀州市、貴港市和桂林市有1014F和1014C 2種突變位點；而玉林市、梧州市、柳州市和河池市有1014S、1014F和1014C 3種氨基酸突變位點，并且這些kdr位點的發(fā)生頻率逐年上升。另外，廣西壯族自治區(qū)桂平市的中華按蚊經等位基因特異性PCR、PIRA-PCR、PIM-PCR鑒定，發(fā)現突變位點L1014S、L1014F、L1014W和1個新的突變位點N1013S[23]。在其他國家也發(fā)現了這些kdr突變，例如在韓國中華按蚊中發(fā)現L1014F（TTT）、 L1014F（TTC）和L1014C（TGT）突變[24]；老撾、越南、哥倫比亞等地的中華按蚊中都發(fā)現了L1014S的突變位點[25]。

迄今為止，蚊子中與擬除蟲菊酯抗性相關的kdr位點不如其他節(jié)肢動物害蟲多，埃及伊蚊中共發(fā)現10個kdr突變位點，分別是G923V、L982W、S989P、V1016G/I、I1011M/V、T1520I、F1534C和D1763Y，并且這些kdr突變位點常常是共同存在，且共同存在時抗性系數更高[26]，但在中華按蚊中還未檢測到類似現象。目前，從中華按蚊中只發(fā)現5個鈉離子通道突變位點：L1014F、L1014S、L1014W、L1014C和N1013S，所以需要大量的樣品采集，并進行鈉離子通道的全長分析，才能鑒定得到更多與擬除蟲菊酯抗性相關的kdr突變位點。

5kdr突變的功能研究

抗性物種中鑒定得到的kdr突變，需要體外試驗驗證才能確定其是否真的使物種對擬除蟲菊酯殺蟲劑產生抗性。爪蟾卵母細胞表達體系和雙電極電壓鉗技術是研究擬除蟲菊酯殺蟲劑和鈉離子通道相互作用的有效手段，很多kdr突變位點經該體系驗證，表明其確實能夠降低擬除蟲菊酯殺蟲劑對鈉離子通道的結合力，從而導致擬除蟲菊酯抗性的產生。L1014F位點最早發(fā)現于家蠅，之后在許多物種中均有發(fā)現該突變位點或者該位點的其他氨基酸突變，并且常被發(fā)現和其他kdr位點同時存在[8]。OReilly等[9]通過計算機建模，模擬鈉離子通道和擬除蟲菊酯的結合，預測L1014位點位于擬除蟲菊酯類殺蟲劑和鈉離子通道的結合位點。Burton等[26]將L1014F/L1014S/l1014H引入果蠅鈉離子通道，發(fā)現突變位點L1014F和L1014H使50%鈉離子通道的激活電壓往去極化方向分別移動4和3 mV，L1014S不移動50%鈉離子通道激活的電壓，但激活曲線的衰減卻明顯比野生型快。實驗發(fā)現三者都降低了果蠅鈉離子通道對擬除蟲菊酯殺蟲劑的敏感性，但是三者作用有差別，L1014F顯著降低果蠅鈉離子通道對氯菊酯和溴氰菊酯的敏感性；而L1014H降低果蠅鈉離子通道對溴氰菊酯的敏感性，對氯菊酯的作用則不如溴氰菊酯強；L1014S則對DDT產生很明顯的抗性。之后Du等[10-11]將L1014F/L1014S引入埃及伊蚊、德國小蠊鈉離子通道，發(fā)現兩者都降低了鈉離子通道對氯菊酯和溴氰菊酯的敏感性。不同物種鈉離子通道的電壓鉗試驗都表明，L1014位點的突變都降低了鈉離子通道對擬除蟲菊酯殺蟲劑的敏感性，因此L1014突變被認為是直接導致抗性的原因。而N1013S突變頻率很低，并且樣本少，所以對它的研究較少。

這些kdr突變在抗性物種中以純合體或雜合體的形式存在，物種抗性產生程度也與突變位點的頻率有關，并且不同的氨基酸突變對殺蟲劑的作用也有差別，有學者發(fā)現L1014S突變頻率較低，對擬除蟲菊酯類殺蟲劑抗性影響不大，對DDT抗性影響較大；L1014C突變主要針對于溴氰菊酯而不針對于氯氰菊酯和DDT[27]。很多kdr突變并未確證是否參與抗性產生，因此，需要對大量突變類型的樣本進行研究，并用電壓鉗試驗進行體外驗證，結合計算機模擬鈉離子通道突變體與擬除蟲菊酯殺蟲劑的相互作用，初步揭示這些kdr突變的功能。清華大學最近發(fā)現第1個真核生物電壓門控鈉離子通道的近原子分辨率三維結構[28]，若是以該鈉離子通道結構模擬其與擬除蟲菊酯殺蟲劑的結合，則能更精準地預測鈉離子通道和擬除蟲菊酯的相互作用，為進一步探索kdr突變和擬除蟲菊酯殺蟲劑抗性的關系奠定基礎。

6結語

在殺蟲劑的選擇壓力下，抗性品系的蚊子將會生存下來并繁殖出更多具有更高抗性的后代，對于殺蟲劑特別是擬除蟲菊酯殺蟲劑的抗性問題，將會更加嚴重。在中華按蚊中發(fā)現的與抗性相關的kdr突變并不多，因此，需要收集更多的抗性按蚊，對整個鈉離子通道基因進行擴增檢測，而不只是對某一片段進行檢測，從而發(fā)現新的kdr突變。按蚊kdr突變位點的發(fā)現并進行功能驗證將為人們研究擬除蟲菊酯殺蟲劑的作用位點以及擬除蟲菊酯殺蟲劑的抗性機理提供有力的分子水平上的依據。

參考文獻

[1]

SHIFF C.Vector control：Methods for use by individuals and communities[J].Parasitology today，1997，14（11）：470.

[2] 徐鐵龍，鄭彬.按蚊擬除蟲菊酯類殺蟲劑抗性相關分子機理的研究進展[J].中國病原生物學雜志，2012，7（7）：552-555.

[3] 陳斌，鮮鵬杰，喬梁，等.昆蟲鈉離子通道基因突變及其與殺蟲劑抗性關系的研究進展[J].昆蟲學報，2015，58（10）：1116-1125.

[4] CESTLE S，CATTERALL W A.Molecular mechanisms of neurotoxin action on voltagegated sodium channels[J].Biochimie，2000，82（9/10）：883-892.

[5] GOLDIN A L.Evolution of voltagegated Na（+） channels[J].Journal of experimental biology，2002，205（5）：575-584.

[6] DONG K，DU Y E，RINKEVICH F，et al.Molecular biology of insect sodium channels and pyrethroid resistance[J].Insect biochemistry and molecular biology，2014，50（1）：1-17.

[7] NODA M，SHIMIZU S，TANABE T，et al.Primary structure of electrophorus electricus sodium channel deduced from cDNA sequence[J].Nature，1984，312（5990）：121-127.

[8] DONG K.Insect sodium channels and insecticide resistance[J].Invert neurosci，2007，7（1）：17-30.

[9] OReilly A O，KHAMBAY B P.Modelling insecticidebinding sites in the voltagegated sodium channel[J].Biochem J，2006，396（2）：255-263.

[10] DU Y Z，NOMURA Y，SATAR G，et al.Molecular evidence for dual pyrethroidreceptor sites on a mosquito sodium channel[J].Pnas，2013，110（29）：11785-11790.

[11] DU Y，NOMURA Y，DONG K，et al.Rotational symmetry of two pyrethroid receptor sites in the mosquito sodium channel[J].Mol Pharmacol，2015，88（2）：273-280.

[12] SODERLUND D M.Molecular mechanisms of insecticide resistance[J].Molecular mechanisms of resistance to agrochemicals，1990，13：21-56.

[13] INGLES J P，ADAMS P M，KNIPPLE D C，et al.Characterization of voltagesensitive sodium channel gene coding sequences from insecticidesusceptible and knockdownresistant house fly strains[J].Insect Biochem Mol Biol，1996，26（4）：319-326.

[14] MARTINEZTORRES D，CHANDRE F，WILLIAMSON M S，et al.Molecular characterization of pyrethroid knockdown resistance （kdr） in the major malaria vector Anopheles gambiae[J].Insect Mol Biol，1998，7（2）：179-184.

[15] CHEN L，ZHONG D B，ZHANG D H，et al.Molecular ecology of pyrethroid knockdown resistance in Culex pipiens pallens mosquitoes[J].Plos one，2010，5 （7）：1-9.

[16] FOSTER S P，PAUL V L，SLATER R，et al.A mutation （L1014F） in the voltagegated sodium channel of the grain aphid，Sitobion avenae，is associated with resistance to pyrethroid insecticides[J].Pest management science，2014，70（8）：1249-1253

[17] HOPKINS B W，PIETRANTONIO P V.The helicoverpa zea （Boddie） （Lepidoptera：Noctuidae） voltagegated sodium channel and mutations associated with pyrethroid resistance in fieldcollected adult males[J].Insect biochemistry & molecular biology，2010，40（5）：385-393.

[18] SONODA S.Molecular analysis of pyrethroid resistance conferred by target insensitivity and increased metabolic detoxification in Plutella xylostella[J].Pest management science，2010，66（5）：572-575.

[19] RINKEVICH F D，SU C，LAZO T A，et al.Multiple evolutionary origins of knockdown resistance （kdr ） in pyrethroidresistant Colorado potato beetle，Leptinotarsa decemlineata[J].Pesticide biochemistry & physiology，2012，104（3）：192-200.

[20] CASSANELLI S，CERCHIARI B，GIANNINI S，et al.Use of the RFLP‐PCR diagnostic test for characterizing MACE and kdr insecticide resistance in the peach potato aphid Myzus persicae[J].Pest management science，2005，61（1）：91-96.

[21] WANG Y，YU W Q，SHI H，et al.Historical survey of the kdr mutations in the populations of Anopheles sinensis in China in 1996-2014[J].Malaria journal，2015，14（1）：120.

[22] YANG C，FENG X Y，HUANG Z S，et al.Diversity and frequency of kdr mutations within Anopheles sinensis populations from Guangxi，China[J].Malar J，2016，15（1）：411.

[23] TAN J，LIU Z ，TSAI T D，et al.Novel sodium channel gene mutations in Blattella germanica reduce the sensitivity of expressed channels to deltamethrin[J].Insect biochemistry and molecular biology，2002，32（4）：445-454.

[24] KANG S，JUNG J，LEE S H，et al.The polymorphism and the geographical distribution of the knockdown resistance （kdr） of Anopheles sinensis in the Republic of Korea[J].Malar J，2012，11（1）：1-8.

[25] VERHAEGHEN K，BORTEL W V，TRUNG H D，et al.Knockdown resistance in Anopheles vagus，An.sinensis，An.paraliae and An.peditaeniatus populations of the Mekong region[J].Parasites & vectors，2010，3：59.

[26] BURTON M J，MELLOR I R，DUCE I R，et al.Differential resistance of insect sodium channels with kdr mutations to deltamethrin，permethrin and DDT[J].Insect biochemistry and molecular biology，2011，41（9）：723-732.

[27] DU Y Z，NOMURA Y，ZHOROV B S，et al.Sodium channel mutations and pyrethroid resistance in Aedes aegypti[J].Insects，2016，7（4）：60.

[28] SHEN H Z，ZHOU Q，PAN X J，et al.Structure of a eukaryotic voltagegated sodium channel at nearatomic resolution[J].Science，2017，355 （6328）：1-17.