基于ITS2序列的丹參及其混偽品分子鑒定研究

張萍　黎先軍　杜微波

摘要[目的]采用DNA條形碼及特異性引物PCR技術(shù)對(duì)中藥材丹參及其混偽品進(jìn)行分子鑒定研究。[方法]以核基因ITS2序列作為DNA 條形碼，對(duì)研究材料進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增并雙向測(cè)序，將所得序列構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹。利用Koetschan等建立的ITS2數(shù)據(jù)庫及其網(wǎng)站預(yù)測(cè)ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)，同時(shí)采用自設(shè)引物進(jìn)行特異性引物PCR鑒別研究。[結(jié)果]ITS2序列長(zhǎng)度為470 bp左右；從系統(tǒng)聚類樹圖可以看出，丹參及其偽品分別聚在不同支，表現(xiàn)出單系性；比較二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，丹參與甘西鼠尾差異甚微，與牛蒡在螺旋莖環(huán)的數(shù)目、大小、位置以及螺旋臂由中心環(huán)伸出時(shí)的轉(zhuǎn)角等方面具有明顯區(qū)別；通過特異性引物PCR技術(shù)可將丹參及其偽品進(jìn)行區(qū)分。[結(jié)論]DNA條形碼技術(shù)和特異性引物PCR技術(shù)均能夠有效地區(qū)別丹參及其混偽品，在中藥材的鑒定中具有重要的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞丹參；DNA條形碼；二級(jí)結(jié)構(gòu)；PCR技術(shù)

中圖分類號(hào)R282.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2017）30-0122-03

Abstract[Objective]The research aimed to study the molecular identification of Salvia miltiorrhiza and its adulterants by DNA barcode and specific primers PCR. [Method]The ITS2 sequence was used as DNA barcoding， and the materials were amplified by PCR and sequenced， and the NJ phylogenetic tree was constructed. The secondary structure of ITS2 was predicted by database established and its website by Koetschan et al.，and the selfdesigned primers were used to carry out specific primer PCR identification. [Result]ITS2 sequence length was around 470 bp. The results of cluster analysis showed that Salvia miltiorrhiza and its adulterants were clustered in different branches and showed single character. Compared with secondary structure， Salvia miltiorrhiza and Ganxi rat tail had little difference， and there were significant difference on the number， size， location of burdock in the spiral stem， and the rotation angle of the spiral arm from the central ring with burdock. The specific primers could distinguish the Salvia miltiorrhiza and its counterfeit by PCR technique. [Conclusion]DNA barcoding and specific primers PCR are effective in distinguishing Salviae miltiorrhiza and its adulterants， and it has an important application foreground in the identification of Chinese herbal medicines.

Key wordsSalvia Miltiorrhiza Bge.；DNA barcoding；Secondary structure；PCR technique

丹參在2015年版《中國藥典》一部中記載為唇形科植物丹參（Salvia miltiorrhiza Bge.）的干燥根和根莖，是我國傳統(tǒng)中藥，具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、涼血消癰等功效[1]。目前丹參的主產(chǎn)區(qū)主要集中于山東日照、陜西商洛、四川中江、河南內(nèi)鄉(xiāng)等地，多數(shù)為栽培品種，采用野生馴化、種子繁殖、根段無性繁殖等方式保存種質(zhì)資源[2]。丹參作為我國十大常用大宗藥材之一，在臨床應(yīng)用上已有2 000多年的歷史，由于其對(duì)心血管疾病有顯著療效，且具有抗凝、促纖溶、擴(kuò)血管、改善微循環(huán)、清除自由基、保護(hù)線粒體等廣泛的藥理作用，其需求量正在逐年增大[3]。但是中藥品種繁多、真?zhèn)位祀s，有不少商販趁機(jī)摻假、造假現(xiàn)象屢見不鮮。因此，在保證藥材質(zhì)量及臨床有效性的同時(shí)，建立一種科學(xué)、可靠、方便的鑒定方法成為當(dāng)務(wù)之急[4]。

DNA條形碼作為分子標(biāo)記的最新發(fā)展，近年來逐漸應(yīng)用于中藥的分類和鑒定研究[5]。DNA序列信息可為系統(tǒng)學(xué)研究提供大量可靠的信息數(shù)據(jù)，并且其分析結(jié)果可對(duì)現(xiàn)存的分類學(xué)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。DNA 條形碼技術(shù)具有特異性強(qiáng)、微量、便捷、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，從分子水平對(duì)中藥材的真?zhèn)芜M(jìn)行鑒定[6-7]。陳士林[5]經(jīng)過十余年的潛心研究提出以ITS2序列為主、psbA-trnH序列為輔的鑒定體系。ITS2序列是去除5.8 S rRNA序列和28 S rRNA序列的核糖體DNA序列間隔區(qū)，可以鑒定大多數(shù)植物類藥材及其易混品種[8-10]。該研究利用ITS2序列對(duì)丹參原植物及其同屬混偽品進(jìn)行DNA條形碼鑒別研究，同時(shí)采用特異性引物PCR技術(shù)對(duì)其進(jìn)行真?zhèn)舞b別，以期為該藥材在分子水平的鑒別研究提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試材。

材料來源見表1，包括試驗(yàn)樣品及來自Genbank下載序列。

1.1.2試劑。

植物DNA提取試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司；瓊脂糖（Biowest）購自青島秀佰銳生物器材有限公司；Gene核酸染料、2*Taq PCR Mixture、Marker均購自天根生化科技有限公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；其余試劑均為分析純。

1.1.3儀器。

ProFlex型梯度PCR擴(kuò)增儀（Applied Biosystem 公司），THZ-82型雙數(shù)顯旋轉(zhuǎn)水浴振蕩器（金壇市城東新瑞儀器廠），JS-680D型凝膠成像儀（上海培清科技有限公司），MBE-150型電泳儀（美國MS），Micro 21R臺(tái)式高速低溫離心機(jī)（美國Thermo）。

1.2方法

1.2.1DNA提取。

樣品根使用70%乙醇擦洗表面后晾干，用冷凍研磨儀60 Hz研磨90 s，研磨2次，稱取20 mg，使用稍作修改的北京艾德萊生物科技有限公司生產(chǎn)的新型植物基因組DNA快速提取試劑盒提取總 DNA。

1.2.2PCR擴(kuò)增及測(cè)序。

ITS2通用引物序列上游5ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′、下游5GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′，特異性引物序列上游5CGCATCGCGTCGCCCC-3、下游5CGGTCGAAGGTTGGGCGCC-3，總反應(yīng)體系25 μL，包括12.5 μL 2*Taq PCR Mixture、1.0 μL DNA模版、9.5 μL ddH2O、10 μmol/L上游和下游引物各1.0 μL。反應(yīng)在ProFlex型梯度PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行，擴(kuò)增后取PCR反應(yīng)液6 μL加入到2.0%瓊脂糖凝膠孔中，在120 V電壓、70 mA電流下進(jìn)行電泳。用凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)目的基因表達(dá)情況并照相。用一代測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序分析。

1.2.3數(shù)據(jù)分析。

測(cè)序峰型用Chromas軟件查看，成功的序列利用DNAman進(jìn)行序列拼接，對(duì)于Genbank中的ITS2序列，使用基于隱馬爾可夫模型的HMMer注釋方法獲得ITS2間隔區(qū)序列。將所有序列利用MEGA 5.0軟件分析比對(duì)，進(jìn)行遺傳距離分析，利用NJ鄰接樹法構(gòu)建聚類分析圖，Bootstrap 1 000次檢驗(yàn)各分支支持率。根據(jù)Koetschan等[11]建立的ITS2數(shù)據(jù)庫及其網(wǎng)站預(yù)測(cè)功能，預(yù)測(cè)ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)。

2結(jié)果與分析

2.1序列比較及聚類分析

通用引物ITS2序列長(zhǎng)度均為461 bp，丹參序列內(nèi)變異位點(diǎn)有5個(gè)，多態(tài)性位點(diǎn)2個(gè)，G堿基和C堿基的平均占比為60.8%，根據(jù)Kimura 2-parameter model計(jì)算的種內(nèi)平均遺傳距離為0.004，最小遺傳距離為0.000，出現(xiàn)在D2、D4、D5、D6、D9、D11樣品兩兩之間，說明這6個(gè)樣品親緣關(guān)系最近，屬同一物種?；贗TS2 序列，通過鄰接法（NJ）所構(gòu)建的系統(tǒng)聚類樹圖（圖1）可以看出，丹參與其偽品甘西鼠尾和牛蒡分別聚在不同的支，表現(xiàn)出單系性，分支支持率在50%以上，能夠?qū)⑷邊^(qū)分開。

2.2丹參及其混為品ITS2序列二級(jí)結(jié)構(gòu)

從丹參基原植物與其個(gè)別混偽品二級(jí)結(jié)構(gòu)比較（圖2）可以看出，丹參與甘西鼠尾差異較小，僅在Ⅲ區(qū)頂端的2個(gè)莖環(huán)有甚微差異；與牛蒡差異較大，4個(gè)區(qū)均有差異，差異相對(duì)較小的位于Ⅱ區(qū)。通過ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)比較，可以將丹參與其混偽品區(qū)別開來。

2.3特異性引物鑒別

通過PCR擴(kuò)增（圖3）可以看出，丹參樣品均能擴(kuò)增出目的條帶，而偽品甘西鼠尾和牛蒡均不能擴(kuò)增出目的條帶，陰性對(duì)照無條帶。表明采用特異性引物PCR技術(shù)能夠?qū)⒌⒓捌鋫纹愤M(jìn)行區(qū)分。

3討論

丹參始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，在我國有悠久的使用歷史，因其色紅且形狀似參而得名為“丹參”。近年來隨著丹參野生資源的減少，家種丹參其遺傳資源多樣性的不確定性導(dǎo)致市場(chǎng)上出現(xiàn)了不少丹參偽品，例如甘西鼠尾草、三葉鼠尾草、毛地黃鼠尾草、云南鼠尾草等鼠尾草屬植物。此外，經(jīng)市場(chǎng)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，有些商販還用牛蒡根染色充當(dāng)?shù)⑹圪u，使得丹參品質(zhì)存在重要的安全隱患。另外，也有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道將鼠尾草屬40多個(gè)種的根及根莖作丹參使用，經(jīng)化學(xué)成分含量的研究發(fā)現(xiàn)，其中有30多個(gè)種的脂溶性化學(xué)成分含量與丹參相當(dāng)，可作為丹參的新資源[12]。該研究選取了甘西鼠尾和牛蒡根2個(gè)偽品與丹參進(jìn)行比較研究，通過NJ聚類分析表明，11個(gè)丹參樣品先聚為一支后，再與甘西鼠尾聚為一支，二者親緣關(guān)系很近，該結(jié)果可為前人的新資源觀點(diǎn)提供數(shù)據(jù)支持；牛蒡根單獨(dú)聚為一支，從遺傳多樣性分析可知，丹參與牛蒡親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，這與二者屬不同科屬有關(guān)。

中國藥典四部指導(dǎo)原則推薦的植物藥主序列為ITS2片段擴(kuò)增通用引物 ITS2F和ITS3R，輔序列為psbA-trnH片段擴(kuò)增通用引物psbAF和trnHR[13]。該研究在試驗(yàn)過程中首先選用了通用主引物，結(jié)果顯示 PCR擴(kuò)增后，丹參及其混偽品均能擴(kuò)增成功，經(jīng)測(cè)序分析后可將丹參及其偽品進(jìn)行區(qū)分。此外，該研究擬通過PCR技術(shù)進(jìn)行鑒別，通過對(duì)ITS2序列的篩選以及引物的設(shè)計(jì)后，最終選取了一對(duì)特異性引物，通過特異性引物的擴(kuò)增，擴(kuò)增成功率非常高且條帶清晰穩(wěn)定，表明此方法也能夠?qū)Φ⒓捌鋫纹愤M(jìn)行鑒別，該研究可為丹參提供更加簡(jiǎn)便、快速的鑒別方法。

4結(jié)論

該研究采用 DNA 條形碼和特異性引物PCR技術(shù)，通過二級(jí)結(jié)構(gòu)分析、NJ樹的建立以及特異性引物的PCR擴(kuò)增，均實(shí)現(xiàn)了對(duì)丹參的鑒別。試驗(yàn)結(jié)果表明，ITS2序列能夠有效鑒定丹參與其混偽品，對(duì)丹參藥材進(jìn)行源頭把關(guān)，為丹參資源的合理開發(fā)利用提供重要的參考價(jià)值。

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